Przeszczep cienkiego jelita stał się uznaną opcją terapeutyczną dla pacjentów z nieodwracalną niewydolnością jelit. Nasz eksperymentalny model ortotopowego przeszczepu cienkiego jelita u szczurów służy jako niezawodne narzędzie do badania podstawowych procesów immunologicznych i zapalnych, które komplikują transplantację jelita.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowe przeszczepianie jelita cienkiego u szczurów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeszczepienie jelita cienkiego stało się uznaną opcją kliniczną dla pacjentów z zespołem krótkiego jelita i niepowodzeniem żywienia pozajelitowego (nieodwracalną niewydolnością jelit). W wyspecjalizowanych ośrodkach ulepszone strategie operacyjne i terapeutyczne doprowadziły do doskonałego przeżycia pacjentów i przeszczepów w krótkim i średnim terminie, zapewniając jednocześnie wysoką jakość życia 1,3. W przeciwieństwie do częstszych przeszczepień innych narządów pełnych (t.j. serca, wątroby), wiele podstawowych mechanizmów funkcjonowania przeszczepu i zmian immunologicznych wywołanych transplantacją jelita nie jest w pełni znanych6,7. Epizody ostrego odrzucania, sepsa i przewlekła niewydolność przeszczepu są głównymi przeszkodami wciąż przyczyniającymi się do mniej korzystnych wyników długoterminowych i utrudniającymi szersze zastosowanie tej procedury, mimo rosnącej liczby pacjentów na domowym żywieniu pozajelitowym, którzy potencjalnie odnieśliby korzyść z takiego przeszczepu. Jelito cienkie zawiera dużą liczbę leukocytów pasażerskich, powszechnie określanych jako część tkanki limfatycznej związanej z jelitami (GALT), co jest jedną z przyczyn wysokiej immunogenności przeszczepu jelita. Obecność i bliskość wielu komensali i patogenów w jelitach wyjaśnia ciężkość epizodów sepsy w momencie naruszenia integralności błony śluzowej przeszczepu (na przykład w wyniku odrzucania). Aby rozwinąć dziedzinę transplantacji jelit i wielonarządowej, potrzebne są dalsze dane generowane z niezawodnych i wykonalnych modeli zwierzęcych. Model przedstawiony w niniejszym opracowaniu łączy niezawodność i wykonalność po ustandaryzowaniu jego wdrożenia i może dostarczyć cennych informacji na temat złożonych molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych mechanizmów wywoływanych przez transplantację jelita. Opisaną procedurę z sukcesem stosowaliśmy i udoskonalaliśmy w naszym laboratorium przez ponad 5 lat 8-11. Format wideo JoVE jest szczególnie przydatny do zademonstrowania tej złożonej procedury i uniknięcia początkowych błędów przez grupy planujące ustanowienie ortotopowego modelu gryzoni do badania transplantacji jelita.
Protokół
1. Operacja dawcy
- Szczura dawcę należy poddać 24-godzinnej głodówce (zapewniając swobodny dostęp do wody/roztworu glukozy).
- Aby wprowadzić znieczulenie inhalacyjne izofluranem, należy rozpocząć od stężenia 2% przy użyciu standardowego atomizera, a następnie zmniejszyć je do 1% po wykonaniu laparotomii. Sedację należy sprawdzić za pomocą ucisku palca u nogi.
- Należy ogolić brzuch i trzykrotnie oczyścić go preparatem do przygotowania skóry (Kodan). Następnie, po podskórnym podaniu leku przeciwbólowego, należy wykonać cięcie pośrodkowe.
- Po owinięciu przeszczepu gazą nasączoną solą fizjologiczną, należy delikatnie oddzielić fizjologiczne zrosty między trzustką a okrężnicą wstępującą za pomocą patyczka higienicznego (pod mikroskopem chirurgicznym przy powiększeniu 6x).
- Należy podwiązać i przeciąć naczynia kątniczo-okrężnicze oraz prawe i środkowe naczynia okrężnicze, używając jedwabiu 7-0. Po odsunięciu okrężnicy wstępującej na prawą stronę żyły krezkowej górnej (SMV), naczynia kątniczo-okrężnicze, prawe i środkowe naczynia okrężnicze można zidentyfikować w celu ich podwiązania i przecięcia za pomocą nici 7-0.
- Żołądek należy odsunąć ku górze, tak aby cała SMV została wyprostowana i odsłonięta. Do retrakcji należy użyć kleszczyków typu mosquito. Kleszczyki są utrzymywane przez masę z plasteliny uformowaną w odpowiedni kształt.
- Należy podwiązać i przeciąć żyły trzustkowo-dwunastnicze odchodzące od SMV. Wszystkie małe żyły trzustkowo-dwunastnicze wychodzące z SMV muszą zostać starannie zidentyfikowane, podwiązane jedwabiem 7-0 i przecięte przed usunięciem tkanki trzustki z przeszczepu.
- Należy podwiązać i przeciąć luźną tkankę łączną, w tym wszystkie naczynia limfatyczne pomiędzy SMV a aortą brzuszną. Przy przeszczepie znajdującym się wciąż po prawej stronie jamy brzusznej, luźna tkanka łączna wraz z naczyniami limfatycznymi między SMV a aortą brzuszną jest dostępna. Tkankę łączną tę należy podwiązać jedwabiem 7-0 i przeciąć, aby uniknąć pooperacyjnej limforyi z przeszczepu jelita.
- Należy podwiązać i przeciąć prawą tętnicę nerkową. Po przecięciu tkanki łącznej prawa tętnica nerkowa staje się dostępna, po czym zostaje podwiązana i przecięta za pomocą jedwabiu 7-0.
- Szczura należy poddać systemowej heparynizacji, podając 200 jednostek heparyny i.v. przez żyłę prącia.
- Należy podwiązać tętnice brzeżne i przeciąć jelito cienkie na poziomie połączenia dwunastniczo-żejunalnego oraz w końcowym odcinku jelita krętego.
- Aortę należy podwiązać proksymalnie względem odejścia SMA. Żyłę wrotną przecina się w miejscu zbiegu z żyłą śledzionową. Następnie pobiera się przeszczep wraz z pieńkiem naczyniowym składającym się z SMA z segmentem aorty.
2. Procedura przy stole zabiegowym
- Przespłucz przeszczep, używając 3 ml roztworu University of Wisconsin (UW) w temperaturze 4 °C poprzez przewód aorty, oraz wypłucz światło jelita od strony końca jelita czczego 30 ml roztworu Uro-Nebacetin N w temperaturze 4 °C (irygacja światła jest obowiązkowa).
Bezpośrednio po wyjęciu przeszczepu przewód aorty jest wykorzystywany do perfuzji 3 ml schłodzonego roztworu UW. W tym celu stosuje się kaniulę dożylną 20 G na strzykawce 10 ml. Należy upewnić się, że perfuzat swobodnie wypływa z przekroju żyły wrotnej. Do irygacji jelit preparatem Nebacetin używa się strzykawki 50 ml.
- Przechowywać przeszczep w roztworze UW w temperaturze 4 °C podczas przygotowania biorcy.
3. Operacja u biorcy
- Szczura biorcy nie należy karmić przez 24 h (zapewniając swobodny dostęp do wody/roztworu glukozy).
- Aby wprowadzić znieczulenie inhalacyjne izofluranem, należy rozpocząć od stężenia 2% przy użyciu standardowego atomizera, a następnie zmniejszyć je do 1% po wykonaniu laparotomii. Sedację należy sprawdzić, wykonując ucisk palca u stopy.
- Brzuch należy ogolić i oczyścić preparatem do skóry 3 razy (Kodan). Następnie, po podskórnym podaniu karprofenu w dawce 5 mg/kg s.c. w celu zapewnienia analgezji śródoperacyjnej, należy wykonać cięcie pośrodkowe.
- Jelito biorcy należy zawinąć w gazę nasączoną solą fizjologiczną i położyć na klatce piersiowej biorcy.
- Tylną ścianę otrzewnej należy rozdzielić tępo za pomocą patyczków higienicznych i odsłonić aortę brzuszną oraz żyłę główną dolną poniżej naczyń nerkowych aż do poziomu naczyń miednicznych; w razie potrzeby należy użyć mikronóżek. Niewielkie dopływy lędźwiowe i rdzeniowe odchodzące od aorty i żyły głównej należy podwiązać nicią jedwabną 7-0, aby uniknąć utraty krwi. (W tym celu należy zmienić powiększenie mikroskopu chirurgicznego na 16x).
- Aortę i żyłę główną dolną należy zacisnąć kleszczykami naczyniowymi mikroprecyzyjnymi: proksymalnie poniżej lewych naczyń nerkowych i dystalnie powyżej rozwidlenia naczyń miednicznych. Zarówno proksymalnie, jak i dystalnie stosuje się tylko jeden zacisk, aby jednocześnie zacisnąć oba naczynia. Oba naczynia należy naciąć od strony przedniej za pomocą mikronoża i wypłukać pozostałą krew.
- Należy wykonać anastomozę końcowo-boczną pomiędzy segmentem aorty z przeszczepu a aortą podnerkową biorcy, stosując szew ciągły nicią Prolene 10-0. Początkowo przeszczep umieszcza się po prawej stronie brzucha (głowa szczura skierowana na godzinę 12), aby wykonać szwy tylnej ściany anastomozy tętniczej i zawiązać dolny szew stabilizujący. Następnie przeszczep obraca się na lewą stronę brzucha (głowa szczura skierowana na godzinę 9), aby odsłonić i zaszyć przednią ścianę anastomozy.
- Anastomoza końcowo-boczna pomiędzy żyłą wrotną przeszczepu a żyłą główną dolną biorcy jest wykonywana w podobny sposób za pomocą szwów ciągłych nicią Prolene 10-0. Gdy szczur nadal leży na boku (głowa w pozycji na godzinę 9), przeszczep ustawia się po lewej stronie brzucha i zakłada dolny szew stabilizujący. Anastomozę rozpoczyna się od tylnej ściany od wewnątrz naczynia. Po zawiązaniu dolnego szwu stabilizującego można wykonać szwy przedniej ściany od zewnątrz.
- Najpierw usuwa się zaciski dystalne, a następnie górne. Ewentualne krwawienie z anastomozy opanowuje się poprzez bezpośredni ucisk za pomocą patyczków higienicznych. Należy sprawdzić, czy reperfuzja przeszczepu jest równomierna i szybka.
- Po podwiązaniu naczyń krezkowych należy wyciąć całe jelito cienkie biorcy. U biorców wykonuje się subtotalną enterektomię, zachowując 2-3 cm proksymalnej części jelita czczego oraz 1 cm dystalnej części jelita krętego.
- Ciągłość jelita przywraca się poprzez anastomozy końcowe proksymalną (jejunostomia) i dystalną (ileostomia), stosując jednowarstwowy szew przerywany nicią Monocryl 6-0. Do wykonania anastomoz potrzeba około 16 szwów.
- Jamę otrzewną należy płukać solą fizjologiczną aż do uzyskania czystości. W celu uzupełnienia płynów należy podać 2 ml soli fizjologicznej do jam otrzewnej. Następnie brzuch zamyka się szwem ciągłym nicią Vicryl 3-0 w warstwie mięśniowej oraz ciągłym szwem skórnym.
- W okresie pooperacyjnym szczury powinny pozostawać na czczo (z dostępem do wody i roztworu glukozy) przez kolejne 24 h, a następnie powrócić do standardowej karmy i wody ad libitum. Analgezję karprofenem należy stosować przez 3 dni (patrz dawkowanie poniżej).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Standardowy przebieg pooperacyjny
Zwierzęta po przeszczepie powinny szybko dojść do siebie po zabiegu pod lampą grzewczą przez około 1 hr. Hipotermia jest główną przyczyną śmiertelności pooperacyjnej i należy jej starannie zapobiegać w trakcie oraz po operacji. Straty płynów w trakcie operacji należy uzupełnić poprzez iniekcję s.c. 2,5 ml soli fizjologicznej oraz 2,5 ml 5% glukozy co 8 hr przez pierwsze 24 hr. Szczury powinny mieć również swobodny dostęp do roztworu glukozy (lub diety żelowej) or...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż modele przeszczepów jelita u szczurów opisywano już w latach 70. XX wieku 5, większość z niedawno stosowanych modeli opiera się na heterotopowym przeszczepieniu jelita z wykorzystaniem różnych technik 13. O ile procedury heterotopowe mają w ogólności zaletę łatwiejszych technik mikrochirurgicznych i lepszej dostępności przeszczepu do oceny, o tyle heterotopowe przeszczepienie jelita posiada istotną wadę w postaci pominięcia wielokrotnych interakcji przeszczepionego jelita cienkiego oraz jego...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Roztwór University of Wisconsin (UW) (ViaSpan) | Bristol-Myers Squibb | ||
| Roztwór Uro-Nebacetin N | Nycomed | 6967855 | |
| Ampicylina | Ratiopharm | ||
| Karprofen (Rimadyl) | Pfizer | ||
| Nieresorbowalna nić chirurgiczna Prolene 10-0 | Ethicon | ||
| Resorbowalna nić chirurgiczna Monocryl 6-0 | Ethicon | ||
| Resorbowalna nić chirurgiczna Vicryl 3-0 | Ethicon | ||
| Kaniula i.v. G 20 1.1x33 mm | Braun | ||
| Kaniula i.v. G 22 0.9x25 mm | Braun | ||
| Kodan Skin Prep | Schülke | ||
| Roztwór infuzyjny NaCl 0.9% | Braun | ||
| Mała pęseta zakrzywiona | FineScienceTools | 11009-13 | |
| Mikropęseta zakrzywiona | AESCULAP | BD 333 | |
| Mikropęseta zakrzywiona | AESCULAP | FD281R | |
| Mikropęseta prosta 1 | WPI | 5 | |
| Mikropęseta prosta 2 | WPI | 2 | |
| Mikroigłowy uchwyt do igieł | WPI | 14081 | |
| Mikronożyczki | FineScienceTools | 15006-09 | |
| Mikroskalpel | MANI | Ophthalmic knife | |
| Mikroklematy | AESCULAP | FB329R |
Bibliografia
- Abu-Elmagd, K. M., et al. Five Hundred Intestinal and Multivisceral Transplantations at a Single Center: Major Advances With New Challenges. Ann. Surg. 250 (4), 567-56 (2009).
- Berney, T., et al. Portal versus systemic drainage of small bowel allografts: comparative assessment of survival, function, rejection, and bacterial translocation. J. Am. Coll. Surg. 195 (6), 804(2002).
- Fishbein, T. M. Intestinal transplantation. N. Engl. J. Med. 361 (10), 998(2009).
- Hernandez, F., et al. Is portal venous outflow better than systemic venous outflow in small bowel transplantation? Experimental study in syngeneic rats. J. Pediatr. Surg. 40 (2), 336(2005).
- Monchik, G. J., Russell, P. S. Transplantation of small bowel in the rat: technical and immunological considerations. Surgery. 70 (5), 693(1971).
- Murase, N., et al. Graft-versus-host disease after brown Norway-to-Lewis and Lewis-to-Brown Norway rat intestinal transplantation under FK506. Transplantation. 55 (1), 1(1993).
- Murase, N., et al. Immunomodulation of intestinal transplant with allograft irradiation and simultaneous donor bone marrow infusion. Transplant Proc. 31 (1-2), 565(1999).
- Pech, T., et al. Perioperative infliximab application ameliorates acute rejection associated inflammation after intestinal transplantation. Am. J. Transplant. 10 (11), 2431(2010).
- Schaefer, N., et al. Resident macrophages are involved in intestinal transplantation-associated inflammation and motoric dysfunction of the graft muscularis. Am J Transplant. 7 (5), 1062(2007).
- Schaefer, N., et al. Mechanism and impact of organ harvesting and ischemia-reperfusion injury within the graft muscularis in rat small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1821(2006).
- Schaefer, N., et al. Acute rejection and the muscularis propria after intestinal transplantation: the alloresponse, inflammation, and smooth muscle function. Transplantation. 85 (10), 1465(2008).
- Xue, L., et al. Surgical experience of refined 3-cuff technique for orthotopic small-bowel transplantation in rat: a report of 270 cases. Am. J. Surg. 198 (1), 110(2009).
- Zhang, X. Q., et al. Simplified techniques in rat heterotopic small bowel transplantation. Transplant. Proc. 38 (6), 1840(2006).
- Zhao, Y., et al. The establishment of a new en bloc combined liver-small bowel transplantation model in rats. Transplant. Proc. 39 (1), 278(2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
