Artykuł metodologiczny

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 sierpnia 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mimo że proteom i peptydom śliny ludzkiej zostały opisane 1-2, zostały one w znacznym stopniu zidentyfikowane na podstawie trawienia białek śliny trypsyną. Identyfikacja rodzimego peptydomu śliny ludzkiej bez uprzedniego trawienia egzogennymi enzymami staje się niezbędna, ponieważ natywne peptydy w ślinie ludzkiej mają potencjalną wartość w diagnostyce chorób, przewidywaniu postępu choroby oraz monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Odpowiednie pobieranie próbek jest krytycznym krokiem w celu zwiększenia możliwości identyfikacji rodzimego peptydomu śliny ludzkiej. Tradycyjne metody pobierania śliny ludzkiej, obejmujące wirowanie w celu usunięcia zanieczyszczeń 3-4, mogą być zbyt czasochłonne, aby znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej. Ponadto usuwanie zanieczyszczeń poprzez wirowanie może nie być wystarczające do oczyszczenia większości zainfekowanych patogenów oraz usunięcia białek o wysokiej zawartości, które często utrudniają identyfikację niskonakładowego peptydomu.

Konwencjonalne podejścia proteomiczne, wykorzystujące przede wszystkim dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE) w połączeniu z trawieniem w żelu, pozwalają na identyfikację wielu białek śliny 5-6. Jednak podejście to zazwyczaj nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć peptydy i białka występujące w niskich stężeniach. Alternatywą jest proteomika oparta na chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), która umożliwia identyfikację białek bez wcześniejszej separacji metodą 2-DE. Chociaż metoda ta zapewnia wyższą czułość, zazwyczaj wymaga wcześniejszego rozfrakcjonowania próbki 7 oraz trawienia trypsyną, co utrudnia jej zastosowanie w praktyce klinicznej.

Aby uniknąć utrudnień w spektrometrii mas wynikających z przygotowania próbek, opracowaliśmy technikę zwaną sondami do kapilarnej ultrafiltracji (CUF) 8-11. Dane z naszego laboratorium wykazały, że sondy CUF są w stanie wychwytywać białka in vivo z różnych mikrośrodowisk organizmów zwierzęcych w sposób dynamiczny i małoinwazyjny 8-11. Wirowanie nie jest konieczne, ponieważ podciśnienie jest wytwarzane poprzez proste zasysanie strzykawką podczas pobierania próbki. Sondy CUF w połączeniu z LC-MS pozwoliły na pomyślną identyfikację białek poddanych trawieniu trypsyną 8-11. W niniejszej pracy udoskonaliliśmy technikę pobierania próbek metodą ultrafiltracji, tworząc sondę do ultrafiltracji o kształcie lizaka (LLUF), która może z łatwością zmieścić się w ludzkiej jamie ustnej. Bezpośrednia analiza LC-MS bez trawienia trypsyną wykazała, że ludzka ślina naturalnie zawiera wiele fragmentów peptydowych pochodzących z różnych białek. Pobieranie śliny za pomocą sond LLUF pozwoliło uniknąć wirowania, a jednocześnie skutecznie usunęło wiele większych i wysokobobilnych białek. Wyniki spektrometrii mas wykazały, że wiele peptydów o niskiej obfitości stało się wykrywalnych po odfiltrowaniu większych białek za pomocą sond LLUF. Detekcja niskobobilnych peptydów śliny była niezależna od wieloetapowej separacji próbek za pomocą chromatografii. W zastosowaniach klinicznych sondy LLUF zintegrowane z LC-MS mogłyby w przyszłości służyć do monitorowania progresji chorób na podstawie analizy śliny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie sond LLUF

  1. Membrany z polietersulfonu (2 cm2) uszczelniono za pomocą trójkątnych łopatek z polipropylenu (University of California, San Diego), przyklejając membrany żywicą epoksydową do krawędzi łopatek. Zastosowano ujemnie naładowaną membranę z polietersulfonu o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 30 kDa.
  2. Teflonową rurkę z fluorowanego etylenu propylenowego (średnica wewnętrzna/zewnętrzna, 0,35/0,50 cm) przymocowano do wylotu cylindrycznego trójkątnej łopatki z polipropylenu, aby sondę LLUF można było podłączyć do strzykawki o pojemności 20 ml.
  3. Po namoczeniu membrany z polietersulfonu w ludzkiej ślinie w naczyniu hodowlanym (średnica 50 mm), poprzez odciągnięcie tłoka strzykawki wytworzono podciśnienie. Strzykawka z podciśnieniem wymusiła proces ultrafiltracji w celu pobrania białek ze śliny.
  4. Sondy sterylizowano 70% alkoholem przez noc przed użyciem. Aby wykazać prawidłowość uszczelnienia, sondy LLUF umieszczono na 2 h w roztworze zawierającym niebieski dekstran (50 mg/ml) o średniej masie cząsteczkowej 2 000 kDa. Brak niebieskiego dekstranu w zebranych próbkach wskazał, że podczas produkcji sondy i pobierania próbek nie wystąpiły żadne wycieki.

2. Pobieranie śliny

  1. Całą ślinę pobrano od trzech zdrowych ochotników (dwóch mężczyzn i jednej kobiety w wieku od 20 do 40 lat), którzy nie przyjmowali żadnych leków i nie wykazywali wyraźnych oznak zapalenia dziąseł ani próchnicy 6.
  2. Po wypłukaniu jamy ustnej wodą, próbki całej śliny pobrano poprzez wyplucie, bez stymulacji chemicznej, do naczynia chłodzonego w lodzie.
  3. Wszystkie próbki połączono i przechowywano w lodzie podczas procedury pobierania.
  4. Bezpośrednio po pobraniu, ślinę (200 μl) poddano próbkowaniu za pomocą sond LLUF. Próbkowanie przeprowadzono w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C.
  5. Białka śliny (1,0 μg/μl) z zebranymi lub bez zebranych sondami LLUF poddano bezpośrednio analizie nano LC-spektrometrii mas bez trawienia trypsyną. Stężenia białek określono przy użyciu Bio-Rad Protein Assay 12.

3. Analiza NanoLC-LTQ MS

  1. Próbki niepoddanej trawieniu śliny (5 μl) były wprowadzane bezpośrednio na kolumnę pułapkową systemu Eksigent NanoLC przez autosampler, przy użyciu 100% buforu A (2% acetonitrile/0.1% formic acid). NanoLC było sprzężone on-line ze spektrometrem mas Finnigan LTQ.
  2. Po załadowaniu i przemyciu próbki przełączono zawór i podano liniowy gradient 500 nl/min na kolumnę pułapkową oraz kolumnę rozdziałczą (długość 10 cm, średnica wewnętrzna 100 μm, wypełniona wewnętrznie materiałem Synergi 4 μm C18). Gradient wynosił od 0 do 50% buforu B (80% acetonitrile/0.1% formic acid) w czasie 45 min.
  3. Przyrządy nanoLC-LTQ MS były obsługiwane w trybie zależnym od danych (data dependent) przez oprogramowanie Xcalibur. Widma MS/MS czterech najsilniejszych jonów MS o intensywności powyżej 1 × 105 były zbierane z włączoną dynamiczną ekskluzją i energią kolizyjną ustawioną na 35%.
  4. Każda próbka była analizowana dwukrotnie w systemie NanoLC-LTQ MS. Wykorzystano próbki z trzech oddzielnych preparacji. Peptydy wykryte w trzech oddzielnych próbkach wykazano w Tabelach uzupełniających 1 i 2. Reprezentatywne widma NanoLC-LTQ MS przedstawiono na Rysunku 3.

4. Analiza danych i przeszukiwanie bazy danych białek

  1. Każdy plik RAW został przekonwertowany na plik mzXML za pomocą programu Readw.exe.
  2. Plik mzXML wprowadzono do systemu SEQUEST Sorcerer 2 i przeszukano go w bazie danych białek ludzkich wygenerowanej z odpowiadającej jej bazy białek National Center for Biotechnology Information (NCBI), stosując niespecyficzność enzymatyczną. Tolerancję masy jonu prekursorowego ustawiono na 1,5 Da. W ramach wyszukiwania różnicowego do metioniny dodano masę cząsteczkową 16 Da, aby uwzględnić utlenianie.
  3. Po przeszukiwaniu w systemie SEQUEST wyniki zostały automatycznie przefiltrowane, zwalidowane i wyświetlone przez programy PeptideProphet oraz ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet szacuje całkowity wynik prawdopodobieństwa (P), określający, czy przypisanie peptydu jest „poprawne” czy „błędne”, na podstawie wyników SEQUEST (Xcorr, ΔCn, Sp, RSp) oraz dodatkowych informacji o każdej zidentyfikowanej sekwencji peptydu. ProteinProphet obliczył wynik prawdopodobieństwa od 0 do 1 dla każdego białka na podstawie peptydów przypisanych do widm MS/MS.
  4. Aby zminimalizować liczbę fałszywie dodatnich identyfikacji, zastosowano rygorystyczne kryteria filtrowania. Po pierwsze, minimalny próg wyniku P ustalono na 0,8 dla każdego zaakceptowanego peptydu, aby zapewnić bardzo niski poziom błędów (znacznie poniżej 3%) i zadowalającą czułość. Po drugie, wszystkie peptydy z wynikiem P >0,8 musiały jednocześnie wykazywać wysokie wartości korelacji krzyżowej (Xcorr): 1,9, 2,2 oraz 3,0 dla ładunków +1, +2 i +3.

5. Usuwanie bakterii jamy ustnej za pomocą sond LLUF

  1. Aby określić zdolność sond LLUF do usuwania bakterii jamy ustnej, ślinę pobraną przed i po zastosowaniu sondy LLUF (Sekcja 3) naniesiono na płytki agarowe w celu wykrycia bakterii.
  2. Bakterie tlenowe hodowano na płytce z agarem Lauria-Bertani (LB) bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jeden dzień.
  3. Bakterie beztlenowe hodowano na płytce z agarem z pożywką Brucella bez antybiotyków (BD, Sparks, MD) w warunkach beztlenowych przy użyciu Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) w temperaturze 37 °C przez jeden dzień.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Wykonanie sond LLUF i pobieranie próbek śliny w symulowanym środowisku jamy ustnej

Jeśli pobieranie śliny mogłoby odbywać się w sposób przypominający ssanie lizaka, procedura ta pozwoliłaby uniknąć degradacji wypluwanej śliny w urządzeniach do zbierania próbek 13-14. Co istotne, możliwe byłoby również dynamiczne i lokalne monitorowanie pacjentów bezpośrednio z jamy ustnej. Ponadto, gdyby przygotowanie próbek z wykorzystaniem śliny mogło zostać uproszczone, klinicyści mogliby łatwiej usprawnić tę procedurę, aby przyspieszyć podejmowanie decyzji o kolejnych działaniach klinicznych. Spektrometria mas jest jedną z najczulszych technik wykrywania, a nawet sekwencjonowania białek w bardzo krótkim czasie. Jednak skomplikowane procedury przygotowania próbek utrudniały stosowanie tej techniki w praktyce klinicznej. Ponadto wiadomo, że białka występujące w większym stężeniu lub białka o wysokiej masie cząsteczkowej w próbkach klinicznych (np. amylaza w ślinie) maskują białka o niskim stężeniu podczas analizy spektrometrycznej 15-16. Aby pokonać wspomniane powyżej trudności, opracowaliśmy urządzenie do ultrafiltracji przypominające lizak, nazwane sondami LLUF (Rysunek 1). Ujemnie naładowana membrana z polietersulfonu z MWCO 30 kDa (Rysunek 1A, a) została przyklejona do polipropylenowej łopatki (Rysunek 1A, b). Umieszczono ją przed sondą LLUF w celu odfiltrowania większych białek zawartych w ślinie. Aby naśladować ludzkie środowisko jamy ustnej (Rysunek 1A, g), gąbkę (Rysunek 1A, e) nasączono śliną w naczyniu hodowlanym (Rysunek 1A, f). Po całkowitym wyciągnięciu tłoka strzykawki (Rysunek 1A, d), przefiltrowana ślina zaczęła przemieszczać się wzdłuż podłączonej rurki (Rysunek 1A, c) i została zebrana.

2. Identyfikacja rodzimego peptidomu śliny za pomocą NanoLC-LTQ MS

Porównując chromatogramy LC, stwierdziliśmy wyraźne różnice w chromatogramach śliny przed i po pobraniu próbek za pomocą LLUF (Rysunek 2), co wskazuje na odmienny skład białkowy śliny po zastosowaniu LLUF. Aby określić skład białek, wykorzystaliśmy spektrometrię mas NanoLC-LTQ, która jest znana ze zdolności do szybkiego sekwencjonowania peptydów z mieszanin wielu białek. Co ważniejsze, aby uprościć przygotowanie próbek do celów klinicznych, do analizy NanoLC-LTQ MS zastosowano pełną ślinę bez trawienia chemicznego lub enzymatycznego. Nieoczekiwanie, w nietrawionej ślinie zidentyfikowano 131 peptydów (Tabela uzupełniająca 1). Peptydy te są fragmentami pochodzącymi z różnych białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, globiny alfa 1, globiny beta, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. W ślinie po filtracji za pomocą sond LLUF zidentyfikowano dwadzieścia sześć unikalnych peptydów (Tabela uzupełniająca 2). Peptydy te są fragmentami pochodzącymi głównie z różnych białek bogatych w prolinę. Peptydy pochodzące z takich białek jak polimeryczny receptor immunoglobulin (83,24 kDa) i alfa-amylaza były niewykrywalne, co wykazuje zdolność sond LLUF do usuwania większych i licznych białek. Widmo MS/MS peptydu PFIAIHAEAESKL, odpowiadającego wewnętrznemu peptydowi alfa-amylazy, przedstawiono na Rysunku 3A). Co najbardziej intrygujące, po usunięciu większych białek, 18 z 26 zsekwencjonowanych peptydów stało się wykrywalnych w ślinie pobranej za pomocą sondy LLUF (Tabela 1). Te 18 peptydów pochodziło z białek bogatych w prolinę lub białek hipotetycznych, których koniec C-końcowy kończył się sekwencją prolina (P)- glutamina (Q) (-PQ), -SR, -SP lub -PP. Rysunek 3B przedstawia widmo MS/MS peptydu PQGPPQQGGHPRPP, który został wykryty w ślinie pobranej za pomocą sondy LLUF. Peptyd ten może pochodzić z białek bogatych w prolinę podrodziny HaeIII 1 i 2 (Tabela 1).

figure-protocol-1
Rycina 1. Budowa sond LLUF oraz pobieranie całej śliny z modelu ludzkiej jamy ustnej. Panel A: (a) półprzepuszczalna membrana z polietersulfonu o MWCO 30 kDa; (b) łopatka z polipropylenu; (c) rurka z fluorowanego etylenu propylenu (teflonowa); (d) strzykawka 20 ml. Panel B: gąbkę (e) (imitującą język) zanurzono w naczyniu hodowlanym (f) zawierającym ludzką ślinę, aby stworzyć sztuczną ludzką jamę ustną (g). Podciśnienie powstałe w wyniku pełnego wycofania tłoka strzykawki powoduje przemieszczanie się pobranego płynu wzdłuż połączonej rurki (strzałka) w kierunku utworzonej przestrzeni (grot strzałki) wewnątrz strzykawki. Pasek skali: 2,0 cm.

figure-protocol-2
Rycina 2. Różnicowe chromatogramy LC/MS/MS śliny przed i po pobieraniu próbek za pomocą LLUF. Białka (1,0 μg/μl) w ludzkiej ślinie pełnej były filtrowane bez lub z zastosowaniem sondy LLUF. Białka bez trawienia trypsyną poddano bezpośrednio analizie NanoLC- LTQ MS połączonej z systemem Eksigent Nano LC, zgodnie z opisem w materiale i metodach. Przedstawiono chromatogramy szczytów podstawowych (z czasami retencji 44-mim) śliny przed (A) i po (B) pobieraniu próbek za pomocą LLUF.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Wykrywanie peptidomu śliny za pomocą sekwencjonowania NanoLC- LTQ MS. Białka śliny przed (A) i po (B) pobraniu za pomocą sond LLUF analizowano metodą NanoLC- LTQ MS, zgodnie z opisem w Procedurach Eksperymentalnych. Peptidom pochodzący z naturalnej ludzkiej śliny bez trawienia trypsyną przedstawiono w Tabelach uzupełniających 1 i 2. Peptyd (PFIAIHAEAESKL) pochodzący z alfa-amylazy został wykryty wyłącznie w próbce śliny pobranej bez użycia sond LLUF (A), co ilustruje zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek. Wiele peptydów z końcami C-末-PQ, -SR, -SP lub -PP znajdowało się wyłącznie w próbkach po ultrafiltracji sondami LLUF. Przedstawiono jeden z peptydów (PQGPPQQGGHPRPP) pochodzących z różnych białek bogatych w prolinę (B). Widma MS/MS z charakterystycznymi jonami serii „y” i „b” potwierdziły tożsamość obu peptydów.

figure-protocol-4
Rycina 4. Usuwanie bakterii jamy ustnej przy użyciu sond LLUF. Sonda LLUF została wykonana zgodnie z opisem w sekcji Materiały i metody. Sonda została umieszczona w ludzkiej ślinie w symulowanym środowisku jamy ustnej (Rycina 1). Strzykawka na końcu sondy LLUF została wycofana, aby wytworzyć podciśnienie napędzające proces ultrafiltracji podczas pobierania próbek śliny. Podczas pobierania pełna ślina selektywnie przenikała przez membranę z polietersulfonu i gromadziła się w strzykawce. Pełna ślina przed pobraniem próbki za pomocą sondy LLUF służyła jako kontrola. Ślinę (10 μl) przed i po pobraniu próbki sondą LLUF wysiano na płytki agarowe w celu wykrycia bakterii. Panel A: Ślinę pobraną za pomocą sondy LLUF (+LLUF) oraz bez użycia sondy LLUF (-LLUF) wysiano obok siebie na płytkę z agarem LB bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Panel B: Ślinę pobraną za pomocą sondy LLUF oraz bez niej wysiano na płytkę z agarem z pożywki Brucella bez antybiotyków w warunkach beztlenowych przy użyciu Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Bakterie nie rosły na płytkach agarowych z wysianą śliną pobraną za pomocą sondy LLUF, co wykazuje zdolność sond LLCF do eliminowania zarówno tlenowych, jak i beztlenowych bakterii jamy ustnej. Skala: 1,0 cm.

 Sekwencja peptydowa/ zmierzona masa peptydowaNumer akcesyjnyNazwa
1AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485,3		gi|41349484Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 2
  gi|41349482Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 1
  gi|60301553Białko bogate w prolinę BstNI podrodzina 2
2GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576,9		gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
  gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
3GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126,2		gi|37537692Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 4
4GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028,3		gi|113423660PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
5GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077,8		gi|113423262PREDYKOWANE: białko hipotetyczne izoforma 5
  gi|41349482Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 1
  gi|60301553Białko bogate w prolinę BstNI podrodzina 2
  gi|113423663PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349484Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 2
  gi|41349486Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 3
6GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918,5		gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
7GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131,3		gi|113423660PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
8GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030		gi|113423663PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349482Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 1
  gi|113423262PREDYKOWANE: białko hipotetyczne izoforma 5
  gi|60301553Białko bogate w prolinę BstNI podrodzina 2
9GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866,6		gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
10GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713,8		gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
  gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
11GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083,1		gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
  gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
12GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512,6		gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
  gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
13NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720,2		gi|113423262PREDYKOWANE: białko hipotetyczne izoforma 5
  gi|113423663PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
14PQGPPQQGGHPRPP
1450,1		gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
  gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
15QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791,1		gi|4826944Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 2
  gi|9945310Białko bogate w prolinę HaeIII podrodzina 1
16SPPGKPQGPPPQ
1186,9		gi|113423262PREDYKOWANE: białko hipotetyczne izoforma 5
  gi|41349482Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 1
  gi|60301553Białko bogate w prolinę BstNI podrodzina 2
  gi|113423663PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349484Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 2
  gi|41349486Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 3
17SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720,3		gi|113423663PREDYKOWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349482Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 1 izoforma 1
  gi|113423262PREDYKOWANE: białko hipotetyczne izoforma 5
  gi|60301553Białko bogate w prolinę BstNI podrodzina 2
18SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870,9		gi|37537692Prekursor białka bogatego w prolinę BstNI podrodzina 4

Tabela 1. Peptydy były wykrywalne wyłącznie w próbkach pobranych metodą LLUF.

Tabela uzupełniająca 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tabelę uzupełniającą 1.

Tabela uzupełniająca 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tabelę uzupełniającą 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkryliśmy, że w nieprzetrawionej ślinie ludzkiej występuje wiele fragmentów peptydowych. Fragmenty te są pochodnymi różnych form białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1-globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. Wiele czynników może przyczyniać się do powstawania peptydów o nieokreślonych miejscach cięcia. Na przykład niektóre fragmenty peptydowe mogą występować naturalnie w pełnej ślinie ludzkiej. Zidentyfikowano wiele peptydów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 oraz R21-I58002-01). Dziękujemy C. Niemeyer za krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Membrany z polietersulfonu Pall Corporation30 kDa MWCO
Rurka z fluorowanego etylenu propylenu Teflon Upchurch Scientific
Niebieski dekstran Sigma
System Nano LCEksigent
Kolumna pułapkowa C18 Agilent5065-9913
Liniowy spektrometr mas z pułapką jonową LTQ Thermo Fisher
Sorcerer 2Sage-N Research
Acetonitryl-0,1% kwasu mrówkowegoJ.T. Baker9832-03stopień LC/MS
Woda-0,1% kwasu mrówkowegoJ.T. Baker9834-03stopień LC/MS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
  2. Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
  3. Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
  4. Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
  5. Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
  6. Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
  7. Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
  8. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
  9. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
  10. Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
  11. Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
  12. Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
  13. Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
  14. Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
  15. Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
  16. Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
  17. Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
  18. Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
  19. Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
  20. Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
  21. Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
  22. Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
  23. Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
  24. Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
  25. Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
  26. Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
  27. Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
  28. Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
  29. Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
  30. Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
  31. Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
  32. Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
  33. Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
  34. Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
  35. Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
  36. Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
  37. Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
  38. Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sonda do ultrafiltracji Lollipopanaliza peptidomu linyultrafiltracja kapilarnaanaliza nano LC MSrodzime peptydy linymetoda filtracji bia ekbezpo rednia spektrometria masprzetwarzanie pr bek linydetekcja peptyd w o niskiej obfito ciodkrywanie biomarker w klinicznych

Powiązane artykuły