Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mimo że proteom i peptydom śliny ludzkiej zostały opisane 1-2, zostały one w znacznym stopniu zidentyfikowane na podstawie trawienia białek śliny trypsyną. Identyfikacja rodzimego peptydomu śliny ludzkiej bez uprzedniego trawienia egzogennymi enzymami staje się niezbędna, ponieważ natywne peptydy w ślinie ludzkiej mają potencjalną wartość w diagnostyce chorób, przewidywaniu postępu choroby oraz monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Odpowiednie pobieranie próbek jest krytycznym krokiem w celu zwiększenia możliwości identyfikacji rodzimego peptydomu śliny ludzkiej. Tradycyjne metody pobierania śliny ludzkiej, obejmujące wirowanie w celu usunięcia zanieczyszczeń 3-4, mogą być zbyt czasochłonne, aby znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej. Ponadto usuwanie zanieczyszczeń poprzez wirowanie może nie być wystarczające do oczyszczenia większości zainfekowanych patogenów oraz usunięcia białek o wysokiej zawartości, które często utrudniają identyfikację niskonakładowego peptydomu.
Konwencjonalne podejścia proteomiczne, wykorzystujące przede wszystkim dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE) w połączeniu z trawieniem w żelu, pozwalają na identyfikację wielu białek śliny 5-6. Jednak podejście to zazwyczaj nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć peptydy i białka występujące w niskich stężeniach. Alternatywą jest proteomika oparta na chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), która umożliwia identyfikację białek bez wcześniejszej separacji metodą 2-DE. Chociaż metoda ta zapewnia wyższą czułość, zazwyczaj wymaga wcześniejszego rozfrakcjonowania próbki 7 oraz trawienia trypsyną, co utrudnia jej zastosowanie w praktyce klinicznej.
Aby uniknąć utrudnień w spektrometrii mas wynikających z przygotowania próbek, opracowaliśmy technikę zwaną sondami do kapilarnej ultrafiltracji (CUF) 8-11. Dane z naszego laboratorium wykazały, że sondy CUF są w stanie wychwytywać białka in vivo z różnych mikrośrodowisk organizmów zwierzęcych w sposób dynamiczny i małoinwazyjny 8-11. Wirowanie nie jest konieczne, ponieważ podciśnienie jest wytwarzane poprzez proste zasysanie strzykawką podczas pobierania próbki. Sondy CUF w połączeniu z LC-MS pozwoliły na pomyślną identyfikację białek poddanych trawieniu trypsyną 8-11. W niniejszej pracy udoskonaliliśmy technikę pobierania próbek metodą ultrafiltracji, tworząc sondę do ultrafiltracji o kształcie lizaka (LLUF), która może z łatwością zmieścić się w ludzkiej jamie ustnej. Bezpośrednia analiza LC-MS bez trawienia trypsyną wykazała, że ludzka ślina naturalnie zawiera wiele fragmentów peptydowych pochodzących z różnych białek. Pobieranie śliny za pomocą sond LLUF pozwoliło uniknąć wirowania, a jednocześnie skutecznie usunęło wiele większych i wysokobobilnych białek. Wyniki spektrometrii mas wykazały, że wiele peptydów o niskiej obfitości stało się wykrywalnych po odfiltrowaniu większych białek za pomocą sond LLUF. Detekcja niskobobilnych peptydów śliny była niezależna od wieloetapowej separacji próbek za pomocą chromatografii. W zastosowaniach klinicznych sondy LLUF zintegrowane z LC-MS mogłyby w przyszłości służyć do monitorowania progresji chorób na podstawie analizy śliny.
Protokół
1. Tworzenie sond LLUF
- Membrany z polietersulfonu (2 cm2) uszczelniono za pomocą trójkątnych łopatek z polipropylenu (University of California, San Diego), przyklejając membrany żywicą epoksydową do krawędzi łopatek. Wykorzystano ujemnie naładowaną membranę z polietersulfonu o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 30 kDa.
- Teflonową rurkę z fluorylowanego etylenu propylenu (średnica wewnętrzna/zewnętrzna, 0,35/0,50 cm) przymocowano do wylotu cylindra trójkątnej łopatki z polipropylenu, aby sondę LLUF można było podłączyć do strzykawki o pojemności 20 ml.
- Po namoczeniu membrany z polietersulfonu w ludzkiej ślinie w szalce hodowlanej (średnica 50 mm), wytworzono podciśnienie poprzez cofnięcie tłoka strzykawki. Podciśnienie w strzykawce napędzało proces ultrafiltracji w celu pobrania białek ze śliny.
- Sondy sterylizowano 70% alkoholem przez noc przed użyciem. Aby wykazać prawidłowe uszczelnienie, umieszczono sondy LLUF w roztworze zawierającym niebieski dekstran (50 mg/ml) o średniej masie cząsteczkowej 2 000 kDa na 2 h. Brak niebieskiego dekstranu w zebranych próbkach wskazał, że podczas produkcji sond i pobierania próbek nie wystąpiły żadne nieszczelności.
2. Pobieranie śliny
- Ślinę całkowitą pobrano od trzech zdrowych ochotników (dwóch mężczyzn i jednej kobiety w wieku od 20 do 40 lat), którzy nie przyjmowali żadnych leków i nie wykazywali jawnych objawów zapalenia dziąseł ani próchnicy 6.
- Po wypłukaniu jamy ustnej wodą, próbki śliny całkowitej pobrano poprzez wyplucie, bez stymulacji chemicznej, do naczynia chłodzonego w lodzie.
- Wszystkie próbki połączono i przechowywano w lodzie podczas procedury pobierania.
- Niezwłocznie po pobraniu, do próbkowania za pomocą sond LLUF zastosowano ślinę (200 μl). Próbkowanie przeprowadzono w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C.
- Białka śliny (1,0 μg/μl) z zebranymi lub bez zebranych sondami LLUF poddano bezpośrednio analizie nano LC-mass spectrometry bez trawienia trypsyną. Stężenia białek określono przy użyciu Bio-Rad Protein Assay 12.
3. Analiza NanoLC-LTQ MS
- Nietrawione próbki śliny (5 μl) były wprowadzane bezpośrednio na kolumnę pułapkę systemu Eksigent NanoLC przez autosampler, przy użyciu 100% buforu A (2% acetonitrile/0.1% formic acid). System NanoLC był połączony on-line ze spektrometrem mas Finnigan LTQ.
- Po załadowaniu i przemyciu próbki przełączono zawór i zastosowano liniowy gradient o przepływie 500 nl/min na kolumnę pułapkę oraz kolumnę rozdzielczą (długość 10 cm, i.d. 100 μm, wypełniona wewnętrznie materiałem Synergi 4 μm C18). Gradient wynosił od 0 do 50% buforu B (80% acetonitrile/0.1% formic acid) w czasie 45 min.
- Instrumenty nanoLC-LTQ MS były obsługiwane w trybie zależnym od danych (data dependent mode) za pomocą oprogramowania Xcalibur. Widma MS/MS czterech najsilniejszych jonów MS o intensywności powyżej 1 × 105 były zbierane z włączoną dynamiczną ekskluzją i energią kolizyjną ustawioną na 35%.
- Każda próbka była analizowana dwukrotnie w systemie NanoLC-LTQ MS. Wykorzystano próbki z trzech oddzielnych preparacji. Peptydy wykrywalne w trzech oddzielnych próbkach zostały wymienione w Tabelach uzupełniających 1 i 2. Reprezentatywne widma NanoLC-LTQ MS przedstawiono na Rysunku 3.
4. Analiza danych i przeszukiwanie bazy danych białek
- Każdy plik RAW został przekonwertowany na plik mzXML przy użyciu programu Readw.exe.
- Plik mzXML wprowadzono do systemu SEQUEST Sorcerer 2 i przeszukano w odniesieniu do ludzkiej bazy danych wygenerowanej z odpowiedniej bazy białek National Center for Biotechnology Information (NCBI) przy zastosowaniu niespecyficzności enzymatycznej. Tolerancję masy jonu prekursorowego ustawiono na 1.5 Da. Do metioniny dodano masę cząsteczkową 16 Da w celu przeprowadzenia przeszukiwania różnicowego, aby uwzględnić utlenianie.
- Po przeszukiwaniu w systemie SEQUEST wyniki zostały automatycznie przefiltrowane, zwalidowane i wyświetlone przez PeptideProphet oraz ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet szacuje całkowity wynik prawdopodobieństwa (P), określający, czy przypisanie peptydu jest „poprawne” czy „błędne” na podstawie wyników SEQUEST (Xcorr, ΔCn, Sp, RSp) oraz dodatkowych informacji o każdej zidentyfikowanej sekwencji peptydowej. ProteinProphet obliczył wynik prawdopodobieństwa od 0 do 1 dla każdego białka na podstawie peptydów przypisanych do widm MS/MS.
- Aby zminimalizować liczbę fałszywie dodatnich identyfikacji, zastosowano rygorystyczne kryteria filtrowania. Po pierwsze, minimalny próg wyniku P dla każdego zaakceptowanego peptydu ustawiono na 0.8, aby zapewnić bardzo niski poziom błędów (znacznie poniżej 3%) i odpowiednio dobrą czułość. Po drugie, wszystkie peptydy z wynikiem P >0.8 musiały jednocześnie posiadać wysokie wyniki korelacji wzajemnej (Xcorr): 1.9, 2.2 i 3.0 dla ładunków odpowiednio +1, +2 i +3.
5. Usuwanie bakterii jamy ustnej za pomocą sond LLUF
- Aby określić zdolność sond LLUF do usuwania bakterii jamy ustnej, ślinę pobraną przed i po zastosowaniu sondy LLUF (Sekcja 3) naniesiono na płytki agarowe w celu wykrycia bakterii.
- Bakterie tlenowe hodowano na płytce z agarem Lauria-Bertani (LB) bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jedną dobę.
- Bakterie beztlenowe hodowano na płytce z agarem z pożywką Brucella (BD, Sparks, MD) w warunkach beztlenowych przy użyciu zestawu Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) w temperaturze 37 °C przez jedną dobę.
6. Reprezentatywne wyniki
1. Wytwarzanie sond LLUF i pobieranie próbek śliny w symulowanym środowisku jamy ustnej
Jeśli pobieranie śliny mogłoby być realizowane w formie ssania lizaka, procedura ta pozwoliłaby uniknąć degradacji wyplutą śliny w urządzeniach do zbierania próbek 13-14. Co istotne, umożliwiłoby to również dynamiczne i miejscowe monitorowanie pacjentów z jamy ustnej. Ponadto, gdyby przygotowanie próbek ze śliny można było uprościć, klinicyści mogliby łatwiej usprawnić procedurę, aby przyspieszyć podejmowanie decyzji o kolejnych działaniach klinicznych. Spektrometria mas jest jedną z najczulszych technik wykrywania, a nawet sekwencjonowania białek w bardzo krótkim czasie. Jednak skomplikowane procedury przygotowania próbek utrudniały stosowanie tej techniki w praktyce klinicznej. Co więcej, wiadomo, że białka o wyższej zawartości lub białka o wysokiej masie cząsteczkowej w próbkach klinicznych (np. amylaza w ślinie) maskują białka o niskiej zawartości w analizie spektrometrycznej 15-16. Aby pokonać wspomniane trudności, opracowaliśmy urządzenie do ultrafiltracji przypominające lizaka, nazwane sondami LLUF (Rycina 1). Ujemnie naładowana membrana z polietersulfonu z MWCO wynoszącym 30 kDa (Rycina 1A, a) została przyklejona do polipropylenowej łopatki (Rycina 1A, b). Została ona umieszczona przed sondą LLUF w celu odfiltrowania większych białek ze śliny. Aby odwzorować ludzkie środowisko jamy ustnej (Rycina 1A, g), gąbkę (Rycina 1A, e) nasączono śliną w naczyniu hodowlanym (Rycina 1A, f). Po pełnym wycofaniu tłoka strzykawki (Rycina 1A, d), przefiltrowana ślina zaczęła przemieszczać się wzdłuż podłączonej rurki (Rycina 1A, c) i została zebrana.
2. Identyfikacja rodzimego peptidomu śliny za pomocą NanoLC-LTQ MS
Porównując chromatogramy LC, stwierdziliśmy różnice między chromatogramami śliny przed i po pobraniu próbek za pomocą LLUF (Rysunek 2), co wskazuje na odmienny skład białkowy śliny po zastosowaniu próbników LLUF. Aby określić skład białkowy, wykorzystaliśmy spektrometrię mas NanoLC-LTQ, która jest znana z możliwości szybkiego sekwencjonowania peptydów z mieszanin wielobiałkowych. Co więcej, aby uprościć przygotowanie próbek do celów klinicznych, do analizy NanoLC-LTQ MS zastosowano całą ślinę bez trawienia chemicznego lub enzymatycznego. Niespodziewanie, w nietrawionej ślinie zidentyfikowano 131 peptydów (Tabela dodatkowa 1). Peptydy te są fragmentami pochodzącymi z różnych białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1 globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. W ślinie po filtrowaniu za pomocą próbników LLUF zidentyfikowano dwadzieścia sześć unikalnych peptydów (Tabela dodatkowa 2). Peptydy te są fragmentami pochodzącymi głównie z różnych białek bogatych w prolinę. Peptydy pochodzące z białek takich jak polimeryczny receptor immunoglobulin (83,24 kDa) oraz alfa-amylaza były niewykrywalne, co wykazuje zdolność próbników LLUF do usuwania większych i bardziej obfitych białek. Widmo MS/MS peptydu PFIAIHAEAESKL, odpowiadającego peptydowi wewnętrznemu alfa-amylazy, przedstawiono na Rysunku 3A. Co najbardziej intrygujące, po usunięciu większych białek, 18 z 26 zsekwencjonowanych peptydów stało się wykrywalnych w ślinie pobranej za pomocą próbników LLUF (Tabela 1). Te 18 peptydów pochodziło z białek bogatych w prolinę lub białek hipotetycznych, które kończyły się końcem C na prolinę (P)- glutaminę (Q) (-PQ), -SR, -SP lub -PP. Rysunek 3B przedstawia widmo MS/MS peptydu PQGPPQQGGHPRPP, który został wykryty w ślinie pobranej za pomocą próbników LLUF. Peptyd ten mógł pochodzić z białka bogatego w prolinę z podrodziny HaeIII 1 i 2 (Tabela 1).
Rycina 1. Skład sond LLUF i pobieranie całej śliny z modelu ludzkiej jamy ustnej. Panel A: (a) półprzepuszczalna membrana z polietersulfonu o MWCO 30 kDa; (b) łopatka z polipropylenu; (c) rurka z fluorowanego etylenu propylenu (Teflon); (d) strzykawka 20 ml. Panel B: gąbkę (e) (model języka) namoczono w szalce hodowlanej (f) zawierającej ludzką ślinę, aby stworzyć sztuczną ludzką jamę ustną (g). Podciśnienie powstałe w wyniku pełnego wycofania tłoka strzykawki powoduje przemieszczanie się zebranego płynu wzdłuż podłączonej rurki (strzałka) w kierunku powstałej przestrzeni (grot strzałki) wewnątrz strzykawki. Skala: 2.0 cm.
Rycina 2. Różnicowe chromatogramy LC/MS/MS śliny przed i po pobieraniu próbek metodą LLUF. Białka (1,0 μg/μl) w ludzkiej ślinie pełnej filtrowano bez lub z użyciem sondy LLUF. Białka bez trawienia trypsyną poddano bezpośrednio analizie NanoLC- LTQ MS sprzężonej z systemem Eksigent Nano LC, zgodnie z opisem w sekcji Materiały i Metody. Przedstawiono chromatogramy szczytów podstawowych (z czasami retencji 44-min) śliny przed (A) i po (B) pobieraniu próbek metodą LLUF.
Rysunek 3. Wykrywanie peptidomu śliny za pomocą sekwencjonowania NanoLC- LTQ MS. Białka śliny przed (A) i po (B) pobraniem za pomocą sond LLUF przeanalizowano metodą NanoLC- LTQ MS zgodnie z opisem w procedurach eksperymentalnych. Peptidom pochodzący z naturalnej ludzkiej śliny bez trawienia trypsyną przedstawiono w tabelach uzupełniających 1 i 2. Peptyd (PFIAIHAEAESKL) pochodzący z alfa-amylazy wykryto wyłącznie w próbce śliny pobranej bez użycia sond LLUF (A), co ilustruje zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek. Wiele peptydów z końcowymi sekwencjami -PQ, -SR, -SP lub -PP na C-końcu występowało wyłącznie w próbkach po ultrafiltracji sondami LLUF. Przedstawiono jeden z peptydów (PQGPPQQGGHPRPP) pochodzących z różnych białek bogatych w prolinę (B). Widma MS/MS z charakterystycznymi szeregami jonów „y” i „b” potwierdziły tożsamość obu peptydów.
Rysunek 4. Usuwanie bakterii jamy ustnej przy użyciu sond LLUF. Sondę LLUF wykonano zgodnie z opisem w sekcji Materiały i metody. Sondę umieszczono w ludzkiej ślinie w symulowanym środowisku jamy ustnej (Rysunek 1). Tłok strzykawki znajdującej się na końcu sondy LLUF został wycofany, aby wytworzyć podciśnienie napędzające proces ultrafiltracji w celu pobrania próbki śliny. Podczas pobierania cała ślina selektywnie przenikała przez membranę z polietersulfonu i gromadziła się w strzykawce. Jako kontrolę posłużyła cała ślina przed pobraniem za pomocą sondy LLUF. Ślinę (10 μl) przed i po pobraniu sondą LLUF wysiano na płytki agarowe w celu wykrycia bakterii. Panel A: Ślinę z (+LLUF) i bez (+LLUF) pobrania sondą LLUF wysiano obok siebie na płytkę z agarem LB bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Panel B: Ślinę z i bez pobrania sondą LLUF wysiano na płytkę z agarem z bulionem Brucella bez antybiotyków w warunkach beztlenowych przy użyciu zestawu Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Na płytkach agarowych wysianych śliną pobraną sondą LLUF nie odnotowano wzrostu bakterii, co demonstruje zdolność sond LLCF do eliminacji tlenowych oraz beztlenowych bakterii jamy ustnej. Pasek: 1.0 cm.
| Sekwencja peptydowa/ Zmierzona masa peptydu | Numer akcesyjny | Nazwa | |
| 1 | AGNPQGPSPQGGNKPQ GPPPPPGKPQ 2485.3 | gi|41349484 | Prekursor izoformy 2 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 |
| gi|41349482 | Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|60301553 | Białko bogate w prolinę podrodziny BstNI 2 | ||
| 2 | GGHQQGPPPPPPGKPQ 1576.9 | gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 |
| gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 | ||
| 3 | GPPPAGGNPQQPQAPPA GKPQGPPPPPQGGRPP 3126.2 | gi|37537692 | Prekursor białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 4 |
| 4 | GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ 2028.3 | gi|113423660 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne |
| 5 | GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP 2077.8 | gi|113423262 | PREDYKOWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego |
| gi|41349482 | Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|60301553 | Białko bogate w prolinę podrodziny BstNI 2 | ||
| gi|113423663 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne | ||
| gi|41349484 | Prekursor izoformy 2 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|41349486 | Prekursor izoformy 3 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| 6 | GPPPPPPGKPQGPPPQ GGRPQGPPQGQSPQ 2918.5 | gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 |
| 7 | GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ 2131.3 | gi|113423660 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne |
| 8 | GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ 2030 | gi|113423663 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne |
| gi|41349482 | Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|113423262 | PREDYKOWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego | ||
| gi|60301553 | Białko bogate w prolinę podrodziny BstNI 2 | ||
| 9 | GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ 1866.6 | gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 |
| 10 | GPPQQGGHPPPPQGRPQ 1713.8 | gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 |
| gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 | ||
| 11 | GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ 2083.1 | gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 |
| gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 | ||
| 12 | GRPQGPPQQGGHQQGP PPPPPGKPQ 2512.6 | gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 |
| gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 | ||
| 13 | NKPQGPPPPGKPQGPP PQGGSKSRSSR 2720.2 | gi|113423262 | PREDYKOWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego |
| gi|113423663 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne | ||
| 14 | PQGPPQQGGHPRPP 1450.1 | gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 |
| gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 | ||
| 15 | QGRPQGPPQQGGHPRPP 1791.1 | gi|4826944 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 2 |
| gi|9945310 | Białko bogate w prolinę podrodziny HaeIII 1 | ||
| 16 | SPPGKPQGPPPQ 1186.9 | gi|113423262 | PREDYKOWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego |
| gi|41349482 | Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|60301553 | Białko bogate w prolinę podrodziny BstNI 2 | ||
| gi|113423663 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne | ||
| gi|41349484 | Prekursor izoformy 2 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|41349486 | Prekursor izoformy 3 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| 17 | SPPGKPQGPPPQGGNQ PQGPPPPPGKPQ 2720.3 | gi|113423663 | PREDYKOWANE: białko hipotetyczne |
| gi|41349482 | Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 1 | ||
| gi|113423262 | PREDYKOWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego | ||
| gi|60301553 | Białko bogate w prolinę podrodziny BstNI 2 | ||
| 18 | SPPGKPQGPPQQEGNKPQ 1870.9 | gi|37537692 | Prekursor białka bogatego w prolinę podrodziny BstNI 4 |
Tabela 1. Peptydy były wykrywalne wyłącznie w próbkach pobranych za pomocą LLUF.
Tabela uzupełniająca 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tabelę uzupełniającą 1.
Tabela uzupełniająca 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tabelę uzupełniającą 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Odkryliśmy, że w nieprzetrawionej ślinie ludzkiej występuje wiele fragmentów peptydowych. Fragmenty te są pochodnymi różnych form białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1-globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. Wiele czynników może przyczyniać się do powstawania peptydów o nieokreślonych miejscach cięcia. Na przykład niektóre fragmenty peptydowe mogą występować naturalnie w pełnej ślinie ludzkiej. Zidentyfikowano wiele peptydów...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 oraz R21-I58002-01). Dziękujemy C. Niemeyer za krytyczną lekturę manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Membrany z polietersulfonu | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Rurka z fluorowanego etylenu propylenu Teflon | Upchurch Scientific | ||
| Niebieski dekstran | Sigma | ||
| System Nano LC | Eksigent | ||
| Kolumna pułapkowa C18 | Agilent | 5065-9913 | |
| Liniowy spektrometr mas z pułapką jonową LTQ | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitryl-0,1% kwasu mrówkowego | J.T. Baker | 9832-03 | stopień LC/MS |
| Woda-0,1% kwasu mrówkowego | J.T. Baker | 9834-03 | stopień LC/MS |
Bibliografia
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
