Artykuł metodologiczny

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 sierpnia 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mimo że proteom i peptydom śliny ludzkiej zostały opisane 1-2, zostały one w znacznym stopniu zidentyfikowane na podstawie trawienia białek śliny trypsyną. Identyfikacja rodzimego peptydomu śliny ludzkiej bez uprzedniego trawienia egzogennymi enzymami staje się niezbędna, ponieważ natywne peptydy w ślinie ludzkiej mają potencjalną wartość w diagnostyce chorób, przewidywaniu postępu choroby oraz monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Odpowiednie pobieranie próbek jest krytycznym krokiem w celu zwiększenia możliwości identyfikacji rodzimego peptydomu śliny ludzkiej. Tradycyjne metody pobierania śliny ludzkiej, obejmujące wirowanie w celu usunięcia zanieczyszczeń 3-4, mogą być zbyt czasochłonne, aby znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej. Ponadto usuwanie zanieczyszczeń poprzez wirowanie może nie być wystarczające do oczyszczenia większości zainfekowanych patogenów oraz usunięcia białek o wysokiej zawartości, które często utrudniają identyfikację niskonakładowego peptydomu.

Konwencjonalne podejścia proteomiczne, wykorzystujące przede wszystkim dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE) w połączeniu z trawieniem w żelu, pozwalają na identyfikację wielu białek śliny 5-6. Jednak podejście to zazwyczaj nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć peptydy i białka występujące w niskich stężeniach. Alternatywą jest proteomika oparta na chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), która umożliwia identyfikację białek bez wcześniejszej separacji metodą 2-DE. Chociaż metoda ta zapewnia wyższą czułość, zazwyczaj wymaga wcześniejszego rozfrakcjonowania próbki 7 oraz trawienia trypsyną, co utrudnia jej zastosowanie w praktyce klinicznej.

Aby uniknąć utrudnień w spektrometrii mas wynikających z przygotowania próbek, opracowaliśmy technikę zwaną sondami do kapilarnej ultrafiltracji (CUF) 8-11. Dane z naszego laboratorium wykazały, że sondy CUF są w stanie wychwytywać białka in vivo z różnych mikrośrodowisk organizmów zwierzęcych w sposób dynamiczny i małoinwazyjny 8-11. Wirowanie nie jest konieczne, ponieważ podciśnienie jest wytwarzane poprzez proste zasysanie strzykawką podczas pobierania próbki. Sondy CUF w połączeniu z LC-MS pozwoliły na pomyślną identyfikację białek poddanych trawieniu trypsyną 8-11. W niniejszej pracy udoskonaliliśmy technikę pobierania próbek metodą ultrafiltracji, tworząc sondę do ultrafiltracji o kształcie lizaka (LLUF), która może z łatwością zmieścić się w ludzkiej jamie ustnej. Bezpośrednia analiza LC-MS bez trawienia trypsyną wykazała, że ludzka ślina naturalnie zawiera wiele fragmentów peptydowych pochodzących z różnych białek. Pobieranie śliny za pomocą sond LLUF pozwoliło uniknąć wirowania, a jednocześnie skutecznie usunęło wiele większych i wysokobobilnych białek. Wyniki spektrometrii mas wykazały, że wiele peptydów o niskiej obfitości stało się wykrywalnych po odfiltrowaniu większych białek za pomocą sond LLUF. Detekcja niskobobilnych peptydów śliny była niezależna od wieloetapowej separacji próbek za pomocą chromatografii. W zastosowaniach klinicznych sondy LLUF zintegrowane z LC-MS mogłyby w przyszłości służyć do monitorowania progresji chorób na podstawie analizy śliny.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie sond LLUF

  1. Membrany z polietersulfonu (2 cm2) uszczelniono trójkątnymi łopatkami z polipropylenu (University of California, San Diego), przyklejając membrany żywicą epoksydową do krawędzi łopatek. Użyto ujemnie naładowanej membrany z polietersulfonu o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 30 kDa.
  2. Teflonową rurkę z fluorowanego etylenu propylenowego (średnica wewnętrzna/zewnętrzna, 0,35/0,50 cm) przymocowano do wylotu cylindra trójkątnej łopatki polipropylenowej, aby sondę LLUF można było podłączyć do strzykawki o pojemności 20 ml.
  3. Po namoczeniu membrany z polietersulfonu w ludzkiej ślinie w naczyniu hodowlanym (średnica 50 mm), wytworzono podciśnienie poprzez odciągnięcie tłoka strzykawki. Strzykawka z wytworzonym podciśnieniem napędzała proces ultrafiltracji w celu pobierania białek ze śliny.
  4. Przed użyciem sondy sterylizowano przez noc w 70% alkoholu. Aby wykazać prawidłowe uszczelnienie, umieszczono sondy LLUF na 2 h w roztworze zawierającym niebieski dekstran (50 mg/ml) o średniej masie cząsteczkowej 2 000 kDa. Brak niebieskiego dekstranu w zebranych próbkach wskazał, że podczas produkcji sond i pobierania próbek nie wystąpiły żadne nieszczelności.

2. Pobieranie śliny

  1. Całkowitą ślinę pobrano od trzech zdrowych ochotników (dwóch mężczyzn i jednej kobiety w wieku od 20 do 40 lat), którzy nie przyjmowali żadnych leków i nie wykazywali wyraźnych objawów zapalenia dziąseł ani próchnicy 6.
  2. Po wypłukaniu jamy ustnej wodą, próbki całkowitej śliny pobrano poprzez wyplucie, bez stymulacji chemicznej, do naczynia chłodzonego lodem.
  3. Wszystkie próbki połączono i przechowywano na lodzie podczas procedury pobierania.
  4. Bezpośrednio po pobraniu, ślinę (200 μl) poddano próbkowaniu z użyciem sond LLUF. Próbkowanie przeprowadzono w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C.
  5. Białka śliny (1,0 μg/μl) z pobranymi lub bez pobranych sond LLUF poddano bezpośrednio analizie nano LC-spektrometrią mas bez trawienia trypsyną. Stężenia białek określono za pomocą zestawu Bio-Rad Protein Assay 12.

3. Analiza NanoLC-LTQ MS

  1. Próbki nieprzetrawionej śliny (5 μl) były wprowadzane bezpośrednio na kolumnę pułapkującą systemu Eksigent NanoLC przez autosampler, przy użyciu 100% buforu A (2% acetonitrile/0,1% formic acid). System NanoLC był połączony on-line ze spektrometrem mas Finnigan LTQ.
  2. Po wprowadzeniu i przemyciu próbki przełączono zawór i zastosowano liniowy gradient o przepływie 500 nl/min na kolumnę pułapkującą oraz kolumnę rozdzielczą (długość 10 cm, średnica wewnętrzna 100 μm, wypełniona wewnętrznie materiałem Synergi 4 μm C18). Gradient obejmował zmianę stężenia buforu B (80% acetonitrile/0,1% formic acid) od 0 do 50% w czasie 45 min.
  3. Instrumenty nanoLC-LTQ MS pracowały w trybie zależnym od danych (data dependent mode) za pomocą oprogramowania Xcalibur. Widma MS/MS dla czterech najsilniejszych jonów MS o intensywności powyżej 1 × 105 były zbierane z włączoną dynamiczną ekskluzją, przy energii kolizyjnej ustawionej na 35%.
  4. Każda próbka była analizowana dwukrotnie w systemie NanoLC-LTQ MS. Wykorzystano próbki z trzech oddzielnych preparatów. Peptydy wykrywalne w trzech oddzielnych próbkach wyszczególniono w Tabelach uzupełniających 1 i 2. Reprezentatywne widma NanoLC-LTQ MS przedstawiono na Rysunku 3.

4. Analiza danych i przeszukiwanie baz danych białek

  1. Każdy plik RAW został przekonwertowany do formatu mzXML przy użyciu programu Readw.exe.
  2. Plik mzXML został wprowadzony do systemu SEQUEST Sorcerer 2 i przeszukany w bazie danych białek ludzkich wygenerowanej z odpowiadającej jej bazy białek National Center for Biotechnology Information (NCBI) przy zastosowaniu niespecyficzności enzymatycznej. Tolerancję masy jonu prekursorowego ustawiono na 1,5 Da. Do metioniny dodano masę cząsteczkową 16 Da w celu przeprowadzenia wyszukiwania różnicowego, aby uwzględnić utlenianie.
  3. Po przeszukiwaniu w systemie SEQUEST wyniki zostały automatycznie przefiltrowane, zwalidowane i wyświetlone przez programy PeptideProphet i ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet szacuje całkowity wynik prawdopodobieństwa (P), wskazujący, czy przypisanie peptydu jest „poprawne” czy „niepoprawne” na podstawie wyników SEQUEST (Xcorr, ΔCn, Sp, RSp) oraz dodatkowych informacji o każdej zidentyfikowanej sekwencji peptydowej. ProteinProphet obliczył wynik prawdopodobieństwa od 0 do 1 dla każdego białka na podstawie peptydów przypisanych do widm MS/MS.
  4. Aby zminimalizować liczbę fałszywie dodatnich identyfikacji, zastosowano rygorystyczne kryteria filtrowania. Po pierwsze, minimalną wartość odcięcia wyniku P dla każdego zaakceptowanego peptydu ustawiono na 0,8, aby zapewnić bardzo niski błąd (znacznie poniżej 3%) i odpowiednio dobrą czułość. Po drugie, wszystkie peptydy o wyniku P >0,8 muszą jednocześnie posiadać wysokie wyniki korelacji krzyżowej (Xcorr): odpowiednio 1,9, 2,2 i 3,0 dla ładunków +1, +2 i +3.

5. Usuwanie bakterii jamy ustnej za pomocą sond LLUF

  1. Aby określić zdolność sond LLUF do usuwania bakterii jamy ustnej, ślinę pobraną przed i po zastosowaniu sond LLUF (Sekcja 3) naniesiono na płytki agarowe w celu wykrycia bakterii.
  2. Bakterie tlenowe hodowano na płytkach z agarem Lauria-Bertani (LB) bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jeden dzień.
  3. Bakterie beztlenowe hodowano na płytkach z agarem z bulionu Brucella (BD, Sparks, MD) w warunkach beztlenowych z użyciem Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) w temperaturze 37 °C przez jeden dzień.

6. Reprezentatywne wyniki

1. Wytwarzanie sond LLUF i pobieranie próbek śliny w symulowanym środowisku jamy ustnej

Jeśli pobieranie śliny można przeprowadzić w sposób przypominający ssanie lizaka, procedura ta pozwoli uniknąć degradacji wyplutej śliny w urządzeniach do pobierania 13-14. Co istotne, umożliwi to również dynamiczne i lokalne monitorowanie pacjentów w obrębie jamy ustnej. Ponadto, gdyby przygotowanie próbek ze śliny można było uprościć, klinicyści mogliby łatwiej usprawnić tę procedurę, aby przyspieszyć decyzję o kolejnym działaniu klinicznym. Spektrometria mas jest jedną z najczulszych technik wykrywania, a nawet sekwencjonowania białek w bardzo krótkim czasie. Jednak skomplikowane procedury przygotowania próbek utrudniały stosowanie tej techniki w praktyce klinicznej. Ponadto wiadomo, że białka o wysokiej zawartości lub białka o wysokiej masie cząsteczkowej w próbkach klinicznych (np. amylaza w ślinie) maskują białka o niskiej zawartości w analizie spektrometrycznej 15-16. Aby pokonać wspomniane trudności, opracowaliśmy urządzenie do ultrafiltracji przypominające lizaka, nazwane sondami LLUF (Rycina 1). Ujemnie naładowana membrana z polietersulfonu z MWCO wynoszącym 30 kDa (Rycina 1A, a) została przyklejona do polipropylenowej łopatki (Rycina 1A, b). Umieszczono ją przed sondą LLUF w celu odfiltrowania większych białek zawartych w ślinie. Aby odwzorować ludzkie środowisko jamy ustnej (Rycina 1A, g), gąbkę (Rycina 1A, e) namoczono w ślinie w naczyniu hodowlanym (Rycina 1A, f). Po całkowitym wyciągnięciu tłoka strzykawki (Rycina 1A, d), przefiltrowana ślina zaczęła przemieszczać się wzdłuż podłączonej rurki (Rycina 1A, c) i została zebrana.

2. Identyfikacja rodzimego peptidomu śliny za pomocą NanoLC-LTQ MS

Porównując chromatogramy LC, zaobserwowaliśmy wyraźne różnice w chromatogramach śliny przed i po pobieraniu próbek za pomocą LLUF (Rycina 2), co wskazuje na odmienny skład białkowy śliny po zastosowaniu LLUF. Aby określić skład białkowy, wykorzystaliśmy spektrometrię mas NanoLC-LTQ, która pozwala na szybkie sekwencjonowanie peptydów z mieszanin wielobiałkowych. Co więcej, w celu uproszczenia przygotowania próbek do celów klinicznych, do analizy NanoLC-LTQ MS zastosowano całą ślinę bez trawienia chemicznego lub enzymatycznego. Nieoczekiwanie, w nietrawionej ślinie zidentyfikowano 131 peptydów (Tabela uzupełniająca 1). Peptydy te są fragmentami pochodzącymi z różnych białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1-globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. W ślinie po filtrowaniu za pomocą sond LLUF zidentyfikowano dwadzieścia sześć unikalnych peptydów (Tabela uzupełniająca 2). Peptydy te są fragmentami pochodzącymi głównie z różnych białek bogatych w prolinę. Peptydy pochodzące z białek takich jak polimeryczny receptor immunoglobulin (83.24 kDa) i alfa-amylaza były niewykrywalne, co demonstruje zdolność sond LLUF do usuwania większych i obfitych białek. Widmo MS/MS peptydy PFIAIHAEAESKL, odpowiadające wewnętrznemu peptydowi alfa-amylazy, przedstawiono na Rycini 3A. Najbardziej intrygujące jest to, że po usunięciu większych białek 18 z 26 sekwencjonowanych peptydów stało się wykrywalnych w ślinie pobranej za pomocą sond LLUF (Tabela 1). Te 18 peptydów pochodziło z białek bogatych w prolinę lub białek hipotetycznych, których koniec C-terminalny kończył się sekwencją prolina (P)- glutamina (Q) (-PQ), -SR, -SP lub -PP. Rycina 3B przedstawia widmo MS/MS peptydy PQGPPQQGGHPRPP, który został wykryty w ślinie pobranej za pomocą sond LLUF. Peptyd ten mógł pochodzić z białka bogatego w prolinę z podrodziny HaeIII 1 i 2 (Tabela 1).

układ strzykawki do przenoszenia cieczy; schemat przedstawia komponenty i drogę przepływu płynu; części oznaczone od A do G
Rycina 1. Skład sond LLUF oraz pobieranie pełnej śliny z modelu ludzkiej jamy ustnej. Panel A: (a) półprzepuszczalna membrana z polietersulfonu o MWCO 30 kDa; (b) łopatka z polipropylenu; (c) rurka z fluorowanego etylenu propylenu (Teflon); (d) strzykawka 20 ml. Panel B: gąbka (e) (imitująca język) została zanurzona w naczyniu hodowlanym (f) zawierającym ludzką ślinę, aby stworzyć sztuczną ludzką jamę ustną (g). Powstałe podciśnienie, wywołane pełnym wycofaniem tłoka strzykawki, powoduje przemieszczanie się zebranego płynu wzdłuż podłączonej rurki (strzałka) w kierunku powstałej przestrzeni (grot strzałki) wewnątrz strzykawki. Skala: 2,0 cm.

Wykres chromatograficzny przedstawiający względną obfitość w funkcji czasu dla analizy rozdziału związków.
Rycina 2. Różnicowe chromatogramy LC/MS/MS śliny przed i po pobieraniu próbek za pomocą LLUF. Białka (1,0 μg/μl) w ludzkiej ślinie całkowitej filtrowano bez lub z użyciem sondy LLUF. Białka bez trawienia trypsynowego poddano bezpośrednio analizie NanoLC-LTQ MS połączonego z systemem Eksigent Nano LC, zgodnie z opisem w sekcji Materiały i Metody. Przedstawiono chromatogramy największych pików (z czasami retencji wynoszącymi 44 min) dla śliny przed (A) i po (B) pobieraniu próbek za pomocą LLUF.

Diagram widm spektrometrii mas; analiza sekwencji peptydów; m/z vs. względna obfitość.
Rysunek 3. Detekcja peptydomu śliny za pomocą sekwencjonowania NanoLC-LTQ MS. Białka śliny przed (A) i po (B) pobraniu prób za pomocą sond LLUF analizowano metodą NanoLC-LTQ MS zgodnie z opisem w Procedurach Eksperymentalnych. Peptydom śliny pochodzący z naturalnej ludzkiej śliny bez trawienia trypsyną przedstawiono w Tabelach uzupełniających 1 i 2. Peptyd (PFIAIHAEAESKL) pochodzący z alfa-amylazy został wykryty wyłącznie w próbce śliny pobranej bez użycia sond LLUF (A), co ilustruje zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek. Wiele peptydów z końcami C-terminalnymi -PQ, -SR, -SP lub -PP znajdowało się wyłącznie w próbkach po ultrafiltracji sondami LLUF. Przedstawiono jeden z peptydów (PQGPPQQGGHPRPP) pochodzących z różnych białek bogatych w prolinę (B). Widma MS/MS z charakterystycznymi seriami jonów „y” i „b” potwierdziły tożsamość obu peptydów.

Analiza agregacji białek, obraz mikroskopowy porównujący efekty traktowania -LLUP i +LLUP.
Rycina 4. Usuwanie bakterii jamy ustnej przy użyciu sond LLUF. Sondę LLUF skonstruowano zgodnie z opisem w sekcji Materiały i metody. Sondę umieszczono w ludzkiej ślinie w symulowanym środowisku jamy ustnej (Rycina 1). Strzykawkę znajdującą się na końcu sondy LLUF cofnięto, aby stworzyć podciśnienie napędzające proces ultrafiltracji podczas pobierania próbek śliny. Podczas pobierania cała ślina selektywnie przenikała przez membranę z polietersulfonu i gromadziła się wewnątrz strzykawki. Jako kontrolę wykorzystano całą ślinę przed pobraniem próbki za pomocą sondy LLUF. Ślinę (10 μl) przed i po pobraniu próbki za pomocą sondy LLUF naniesiono na płytki agarowe w celu wykrycia bakterii. Panel A: Ślinę po pobraniu próbki za pomocą sondy LLUF (+LLUF) oraz bez pobierania próbki (-LLUF) naniesiono obok siebie na płytkę z agarem LB bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Panel B: Ślinę po pobraniu próbki za pomocą sondy LLUF oraz bez pobierania naniesiono na płytkę z agarem z pożywką Brucella bez antybiotyków w warunkach beztlenowych przy użyciu zestawu Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Bakterie nie rosły na płytkach agarowych z naniesioną śliną pobraną za pomocą sondy LLUF, co wykazuje zdolność sond LLCF do eliminowania tlenowych oraz beztlenowych bakterii jamy ustnej. Pasek: 1.0 cm.

 Sekwencja peptydowa/Zmierzona masa peptyduNumer dostępuNazwa
1AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485.3		gi|41349484Prekursor izoformy 2 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|41349482Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|60301553Białko bogate w prolinę z podrodziny BstNI 2
2GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576.9		gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
  gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
3GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126.2		gi|37537692Prekursor białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 4
4GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028.3		gi|113423660PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
5GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077.8		gi|113423262PRZEWIDYWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego
  gi|41349482Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|60301553Białko bogate w prolinę z podrodziny BstNI 2
  gi|113423663PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349484Prekursor izoformy 2 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|41349486Prekursor izoformy 3 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
6GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918.5		gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
7GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131.3		gi|113423660PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
8GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030		gi|113423663PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349482Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|113423262PRZEWIDYWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego
  gi|60301553Białko bogate w prolinę z podrodziny BstNI 2
9GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866.6		gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
10GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713.8		gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
  gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
11GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083.1		gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
  gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
12GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512.6		gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
  gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
13NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720.2		gi|113423262PRZEWIDYWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego
  gi|113423663PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
14PQGPPQQGGHPRPP
1450.1		gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
  gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
15QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791.1		gi|4826944Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 2
  gi|9945310Białko bogate w prolinę z podrodziny HaeIII 1
16SPPGKPQGPPPQ
1186.9		gi|113423262PRZEWIDYWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego
  gi|41349482Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|60301553Białko bogate w prolinę z podrodziny BstNI 2
  gi|113423663PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349484Prekursor izoformy 2 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|41349486Prekursor izoformy 3 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
17SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720.3		gi|113423663PRZEWIDYWANE: białko hipotetyczne
  gi|41349482Prekursor izoformy 1 białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 1
  gi|113423262PRZEWIDYWANE: izoforma 5 białka hipotetycznego
  gi|60301553Białko bogate w prolinę z podrodziny BstNI 2
18SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870.9		gi|37537692Prekursor białka bogatego w prolinę z podrodziny BstNI 4

Tabela 1. Peptydy były wykrywalne wyłącznie w próbkach pobranych za pomocą LLUF.

Tabela uzupełniająca 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tabelę uzupełniającą 1.

Tabela uzupełniająca 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić Tabelę uzupełniającą 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkryliśmy, że w nieprzetrawionej ślinie ludzkiej występuje wiele fragmentów peptydowych. Fragmenty te są pochodnymi różnych form białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1-globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. Wiele czynników może przyczyniać się do powstawania peptydów o nieokreślonych miejscach cięcia. Na przykład niektóre fragmenty peptydowe mogą występować naturalnie w pełnej ślinie ludzkiej. Zidentyfikowano wiele peptydów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 oraz R21-I58002-01). Dziękujemy C. Niemeyer za krytyczną lekturę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Membrany z polietersulfonu Pall Corporation30 kDa MWCO
Rurka z fluorowanego etylenu propylenu Teflon Upchurch Scientific
Niebieski dekstran Sigma
System Nano LCEksigent
Kolumna pułapkowa C18 Agilent5065-9913
Liniowy spektrometr mas z pułapką jonową LTQ Thermo Fisher
Sorcerer 2Sage-N Research
Acetonitryl-0,1% kwasu mrówkowegoJ.T. Baker9832-03stopień LC/MS
Woda-0,1% kwasu mrówkowegoJ.T. Baker9834-03stopień LC/MS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
  2. Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
  3. Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
  4. Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
  5. Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
  6. Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
  7. Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
  8. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
  9. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
  10. Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
  11. Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
  12. Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
  13. Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
  14. Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
  15. Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
  16. Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
  17. Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
  18. Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
  19. Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
  20. Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
  21. Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
  22. Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
  23. Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
  24. Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
  25. Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
  26. Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
  27. Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
  28. Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
  29. Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
  30. Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
  31. Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
  32. Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
  33. Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
  34. Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
  35. Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
  36. Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
  37. Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
  38. Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sonda do ultrafiltracji Lollipopanaliza peptidomu linyultrafiltracja kapilarnaanaliza nano LC MSrodzime peptydy linymetoda filtracji bia ekbezpo rednia spektrometria masprzetwarzanie pr bek linydetekcja peptyd w o niskiej obfito ciodkrywanie biomarker w klinicznych

Powiązane artykuły