Opisano wydajną syntezę na fazie stałej funkcjonalizowanego trimeru bis-peptydowego z wykorzystaniem procedury odszczepiania typu „safety catch” z żywicy HMBA.
Artykuł metodologiczny
Synteza na fazie stałej funkcjonalizowanego bis-peptydu z wykorzystaniem metodologii „safety catch”
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W 1962 roku R.B. Merrifield opublikował pierwszą procedurę wykorzystującą syntezę peptydów na fazie stałej jako nowatorską metodę wydajnej syntezy peptydów. Technika ta szybko okazała się korzystniejsza od swojej poprzedniczki, syntezy w fazie ciekłej, zarówno pod względem czasu, jak i nakładu pracy. Usprawnienia dotyczące rodzaju nośnika stałego, stosowanych grup ochronnych oraz metod sprzęgania wprowadzane przez ostatnie pięć dekad jedynie zwiększyły użyteczność oryginalnego systemu Merrifielda. Obecnie do syntezy peptydów najczęściej stosuje się strategię ochrony opartą na grupie Boc i żywicę usuwalną za pomocą zasad/nukleofilów lub strategię ochrony opartą na grupie Fmoc i żywicę usuwalną w warunkach kwasowych, zapoczątkowaną przez R.C. Shepparda1.
Inspirowani strategią syntezy na nośniku stałym opracowaną przez Merrifielda, opracowaliśmy strategię syntezy w fazie stałej z wykorzystaniem grup Boc/tert-butyl do montażu funkcjonalizowanych bis-peptydów2, która została tutaj opisana. Zastosowanie syntezy w fazie stałej w porównaniu z metodologią w fazie ciekłej jest korzystne nie tylko pod względem czasu i nakładu pracy, co opisał Merrifield1, ale pozwala również na większą łatwość syntezy bibliotek bis-peptydów. Przedstawiona tutaj synteza obejmuje końcowy etap odszczepienia, w którym wykorzystano dwuetapowy mechanizm typu „safety catch” w celu uwolnienia funkcjonalizowanego bis-peptydu z żywicy poprzez tworzenie diketopiperazyny.
Bis-peptydy są sztywnymi, spiro-drabinowymi oligomerami bis-aminokwasów, które pozwalają na pozycjonowanie funkcjonalności w przewidywalny i projektowalny sposób, kontrolowany przez typ i stereochemię jednostek monomerów oraz sposób ich połączenia. Każdy bis-aminokwas stanowi stereochemicznie czysty, cykliczny szkielet zawierający dwa aminokwasy (kwas karboksylowy z α-aminą)3,4. Nasze laboratorium bada obecnie potencjał funkcjonalnych bis-peptydów w wielu dziedzinach, w tym w katalizie, oddziaływaniach białko-białko oraz w nanomateriałach.
Protokół
1. Przygotowanie
- Układ reakcyjny do syntezy w fazie stałej stanowi polipropylenowy wkład filtrujący lub reaktor szklany, który jest połączony za pomocą polipropylenowej rurki z zamkniętą kolbą filtracyjną pod próżnią, zgodnie z Rysunkiem 1. Mieszanie reakcji można przeprowadzić za pomocą magnetycznego mieszadła lub poprzez przepuszczanie azotu przez reaktor.
- Zaleca się również zastosowanie kolektora gazów połączonego z butlą z argonem, wyposażonego w rurkę osuszającą i bulgotkę olejową, co pozwala na utrzymanie naczynia reakcyjnego w atmosferze obojętnej oraz umożliwia pobieranie odczynników z zamkniętych pojemników.
- Wszystkie operacje wykonuje się w dygestorium; wymagane jest stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej (okularów ochronnych, fartucha laboratoryjnego i rękawiczek nitrylowych).
2. Obciążanie żywicy pierwszym bis-peptydem
- Odważ 114 mg żywicy HMBA-AM (ładunek 0,88 mmol / g, 100 μmol) do naczynia reakcyjnego o pojemności 8 mL i dodaj magnetyczny mieszadło. Zamknij górną część naczynia gumowym septem i przedmuchaj rurkę argonem przez co najmniej 5 minut.
- W międzyczasie odważ 117,3 mg związku 1 z Rysunku 3 (586,63 g / mol, 2eq) oraz 59,2 mg 1-(mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) do jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i rozpuść w 2 mL bezwodnego dichlorometanu (DCM). Do roztworu dodaj 24 μL 1-metyloimidazolu (NMI, 80,81 mL / mol, 3eq) i mieszaj do całkowitego rozpuszczenia.
- Przenieś aktywowany roztwór do naczynia reakcyjnego za pomocą strzykawki i pozostaw do mieszania pod osłoną argonu przez noc (~10 godzin).
- Zdejmij sept i zlej mieszaninę reakcyjną. Przemyj żywicę DCM (5x) oraz dimetyloformamidem (DMF) (5x). Wykonaj „test z czerwienią metylową” opisany w sekcji 10.1, aby ocenić stopień załadowania żywicy. Jeśli żywica pozostaje czerwona podczas testu z czerwienią metylową, należy powtórzyć kroki 2.2 i 2.3. Preferowany jest kolor żółty, wskazujący na negatywny wynik testu z czerwienią metylową; jednakże, ponieważ wszelkie pozostałe grupy hydroksylowe zostaną zablokowane w kolejnym kroku, dopuszczalny może być lekko pozytywny wynik (jasnopomarańczowy kolor żywicy).
3. Deprotekcja pierwszego bis-peptydu i jednoczesne blokowanie żywicy
- Do naczynia reakcyjnego należy dodać 1 mL DCM, a następnie powoli, w ciągu 30 sekund, dodawać kroplami 1 mL 33% bromku wodoru w kwasie octowym (nastąpi wydzielanie pęcherzyków gazu) i mieszać przez 15 minut. Odcedzić i przemyć żywicę DCM (5x), a następnie powtórzyć cały proces jeszcze raz.
- Przemyć żywicę DCM (5x), a następnie DMF (5x). Zneutralizować żywicę, przemywając ją dwukrotnie 5% v/v roztworem N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) w DMF, a następnie ponownie przemyć DCM (5x) i DMF (5x). Wykonać „test z czerwienią metylową” oraz „test z chloranilem” omówione w sekcjach 10.1 i 10.2. Wynik testu z czerwienią metylową powinien być negatywny, a testu z chloranilem – pozytywny.
4. Sprzęganie funkcjonalizowanego bis-aminokwasu chronionego grupami Boc/tBu
- Przywrócić atmosferę obojętną do naczynia reakcyjnego zawierającego żywicę, płukąc je trzykrotnie bezwodnym DCM, a następnie założyć septum i podłączyć linię z argonem. Przepłukać naczynie, dodając 1-2 mL bezwodnego DCM i mieszając przez 30 sekund, a następnie odprowadzić ciecz, aż poziom cieczy w bulgocie linii argonowej zacznie rosnąć. Powtórzyć tę czynność co najmniej raz więcej.
- Przygotować w ogrzanej nad ogniem probówce w atmosferze argonu roztwór 0,15 M funkcjonalizowanego kwasu bis-aminowego (3 eq) oraz 245 mg 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HOAt, 136,11 g / mol, 18 eq) w 2 mL mieszaniny DCM:DMF w stosunku 2:1. Dodać 47 μL diizopropylokarbodiimidu (DIC, 156,6 mL / mol, 3 eq) i mieszać przez 90 minut.
- Dodać 35 μL DIPEA (174,19 mL / mol, 2 eq) w 666 μL bezwodnego DMF do żywicy i mieszać przez 5 minut.
- Przenieść za pomocą strzykawki roztwór uprzednio aktywowanego kwasu bis-aminowego do naczynia reakcyjnego i mieszać przez noc.
- Odprowadzić mieszaninę reakcyjną i dwukrotnie przepłukać bezwodnym DCM w atmosferze argonu.
- Aby wspomóc zamknięcie pierścienia diketopiperazyny, dodać 0,25 M roztwór HOAt (136,11 g / mol, 10 eq) i DIC (156,6 mL / mol, 10 eq) w 4 mL mieszaniny DCM:DMF w stosunku 1:1 i mieszać w atmosferze argonu przez 1 godzinę.
- Zdjąć septum i odprowadzić mieszaninę reakcyjną. Przepłukać żywicę DCM (5x) oraz DMF (5x). W razie potrzeby wykonać „test z chloranilem” opisany w sekcji 10.2.
5. Deprotekcja funkcjonalizowanego bis-aminokwasu chronionego grupami Boc/tBu
- Do naczynia reakcyjnego dodać 2 mL roztworu kwasu triflorooctowego (TFA) i triizopropylosilanu (TIPS) w stosunku 95:5 i mieszać przez 1 godzinę. Odlać ciecz i przemywać żywicę DCM przez około 30 sekund (5x), a następnie powtórzyć ten proces jeszcze raz.
- Przemyć żywicę DCM (5x), a następnie DMF (5x). Zneutralizować żywicę, przemywając ją dwukrotnie 5%v/v roztworem DIPEA w DMF, a następnie ponownie przemyć DCM (5x) i DMF (5x). W razie potrzeby przeprowadzić „test z chloranilem” opisany w sekcji 10.2.
6. Powtórz kroki 4 i 5 w zależności od potrzeb, aby zsyntetyzować docelowy bis-peptyd.
7. Funkcjonalizacja końca prolidynowego bis-peptydu
- Koniec prolinowy rosnącego bis-peptydu może zostać uprocylowany niezależnie lub wspólnie poprzez diketopiperazynę. Alternatywnie, koniec ten może pozostać chroniony, a grupa ochronna zostanie usunięta w późniejszym etapie, uwalniając wolny aminokwas. W razie potrzeby należy przeprowadzić „test z chloranilem” opisany w sekcji 10.2, aby ocenić wydajność sprzęgania.
8. Deprotekcja grupy Fmoc i acylacja końca czwarciorzędowego bis-peptydu
- Dodaje się 2 mL 20% roztworu piperydyny w DMF i miesza mieszaninę przez 20 minut. Odcedza się i przemywa żywicę DMF (5x), a następnie powtarza ten proces jeszcze raz.
- Żywicę przemywa się DCM (5x), a następnie DMF (5x).
- Przygotowuje się 0,15 M roztwór aminokwasu (3 eq) w 2 mL N-metylopirolidonu (NMP) z dodatkiem 114 mg 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyluroniu heksafluorofosforanu (HATU, 380,2 g/mol, 3 eq) oraz 104,5 μL DIPEA (174,19 mL/mol, 6 eq) i dokładnie miesza. Roztwór dodaje się do naczynia reakcyjnego i miesza przez 6 godzin.
- Żywicę przemywa się DCM (5x), a następnie DMF (5x).
9. Usunięcie grupy Boc z aminokwasu związanego z żywicą i odszczepienie z żywicy
- Do naczynia reakcyjnego dodać 2 mL roztworu TFA:DCM w stosunku 1:1 i mieszać przez 30 minut. Odlać ciecz i przemyć żywicę DCM (5x), a następnie powtórzyć ten proces raz jeszcze.
- Przemyć i odlać żywicę przez 30 sekund, używając DCM (5x), a następnie DMF (5x).
- Dodać 2 mL roztworu 10% DIPEA w bezwodnym DMF i mieszać przez 24-48 godzin.
- Zebrać mieszaninę reakcyjną do wcześniej zważonej kolby okrągłodennej. Przenieść 30 μL tego roztworu do 450 μL THF w fiolce do LC-MS i przekazać do analizy. Przemyć żywicę dodatkowymi porcjami DMF, zebrać je do kolby okrągłodennej, a następnie odparować rozpuszczalnik in vacuo.
10. Oczyszczanie bis-peptydu
- Rozpuścić surowy bis-peptyd w minimalnej ilości dimetylosulfotlenku (100-250 μL) i przenieść do wkładki do fiolki HPLC. Umieścić wkładkę w autostatowniku systemu półpreparatywnego HPLC (Hewlett Packard 1100 Series) wyposażonego w kolumnę XTerra Prep MS C18 5 μm 7,8x150 mm oraz pętlę wtryskową o pojemności 100 μL.
- Wyonać wielokrotne wstrzyknięcia próbki po 50 μL, stosując program gradientowy 5-95% acetonitrylu w wodzie z 0,1% kwasem mrówkowym w ciągu 30 minut, monitorując sygnał przy 274 nm. Zebrać szczyt produktu do wcześniej zważonej jednorazowej probówki do wirowania i poddać liofilizacji za pomocą liofilizatora. Należy zachować ostrożność podczas pierwszego przejazdu, ponieważ zazwyczaj obserwuje się niewielkie przesunięcie czasu retencji szczytu w porównaniu z analitycznym LCMS.
11. Metody oceny
- TEST Z CZERWONIĄ METYLOWĄ7: Za pomocą jednorazowej pipety przenieść ok. 1 mg suchej żywicy i wypłukać do naczynia reakcyjnego o objętości 4 mL. Dodać roztwór 20 mg czerwieni metylowej, 50 μL N,N'-diizopropylowo-karbodiimidu (DIC) oraz 5 mg 4-dimetylaminopirydyny (DMAP) w 500 μL bezwodnego DCM i mieszać przez 5-10 min. Odfiltrować i przemywać żywicę DCM, aż filtrat stanie się bezbarwny. Wynik pozytywny objawia się pozostaniem pomarańczowego lub czerwonego koloru kulek żywicy.
- TEST Z CHLORANILEM12: Za pomocą jednorazowej pipety przenieść ok. 1 mg suchej żywicy do małej probówki. Dodać po 3 krople roztworu 0,8 mM chloranilu w DMF oraz 2% acetaldehydu w DMF i pozostawić w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut. Wynik pozytywny objawia się zmianą koloru kulek żywicy na niebieski/fioletowy.
- TEST PUŁAPKI AKTYWACYJNEJ: Obecność związków aktywowanych podczas syntezy można ocenić, przenosząc niewielką ilość (5-10 μL) aktywowanego roztworu do fiolki do chromatografii cieczowej z detekcją masową (LC-MS) zawierającej 50 μL pyrrolidyny. Mieszać ręcznie przez kilka sekund (roztwór powinien stać się żółty), a następnie rozcieńczyć 450 μL tetrahydrofuranu (THF) i poddać analizie LC-MS.
- ANALITYCZNE LC-MS: Produkt końcowy oraz aktywowane produkty pośrednie można ocenić przy użyciu systemu LC-MS serii HP 1200 wyposażonego w kolumnę Waters Xterra MS C18 3,5 μm 4,6 mm x 150 mm oraz system gradientowy 5-95% acetonitrylu w wodzie z 0,1% kwasem mrówkowym w czasie 30 minut.
12. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiono przykłady chromatogramów LCMS zarówno dla produktu surowego (Rysunek 4), jak i oczyszczonego (Rysunek 5). Przy zastosowaniu opisanych powyżej metod oczekiwana jest wydajność produktu oczyszczonego na poziomie około 10%.
Rysunek 1. Schemat układu eksperymentalnego do syntezy w fazie stałej.
Rysunek 2. Odpowiednia nomenklatura bis-aminokwasów/bis-peptydów.
Rysunek 3. Ogólny schemat syntezy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 4a. Chromatogram HPLC surowego produktu przy 274 nm.
Rycina 4b. Spektrum MS piku produktu surowego.
Rysunek 5a. Chromatogram HPLC oczyszczonego produktu przy 274 nm.
Rycina 5b. Widmo MS oczyszczonego piku produktu.
Dyskusja
Przedstawione tutaj podejście syntetyczne dostarcza metody syntezy funkcjonalizowanych bis-peptydów z bloków budulcowych bis-aminokwasów z wykorzystaniem powszechnych technik syntezy peptydów w fazie stałej. Synteza monomerów tych bloków budulcowych „Pro4” z trans-4-hydroksyproliny3 jest wysoce skalowalna i została pomyślnie przeprowadzona do etapu hydantoiny w skali 600 mmol (234 g) (nieopublikowano). Po otrzymaniu monomerów, zastosowanie technik fazy stałej zapewnia szybszą metodę syntezy bis-peptydów niż nasza obecna metodologia w fazie roztworu4, eliminując konieczność opracowania reakcji i oczyszczania produktów pośrednich.
Głównym wyzwaniem w syntezie w fazie stałej jest diagnozowanie postępów syntezy oraz rozwiązywanie problemów, ponieważ żadne produkty pośrednie nie są izolowane. Doprowadziło to do opracowania wielu testów kolorymetrycznych, w tym tych służących do identyfikacji, czy na żywicy znajdują się wolne aminy (test Kaisera10) lub wolne grupy hydroksylowe (test z czerwienią metylową7). Niestety powszechnie stosowany test Kaisera10 nie znajduje zazwyczaj zastosowania w naszej syntezie w fazie stałej ze względu na niemal wyłączne stosowanie amin wtórnych lub amin przyłączonych do węgla czwartorzędowego. Inne opcje oceny na żywicy HMBA obejmują testowe odszczepienia z użyciem nukleofila, takiego jak hydrazyna11, ilościowe odszczepianie grup Fmoc monitorowane metodą UV/Vis1,11 oraz wychwytywanie i analizowanie wprowadzanych związków aktywowanych.
Kolejną często pomijaną kwestią w syntezie w fazie stałej jest powtarzalność kroków syntetycznych wymaganych od operatora. Mając to na uwadze, autorzy zdecydowanie zalecają stosowanie arkusza kalkulacyjnego lub listy kontrolnej podczas przeprowadzania każdej manualnej syntezy peptydów w fazie stałej.
Trudności w wykorzystaniu bis-peptydów w syntezie na fazie stałej w porównaniu do powszechnych α-aminokwasów obejmują potencjalnie utrudnione sprzęganie ze względu na zawadę steryczną, konieczność zamykania pierścieni diketopiperazynowych na żywicy oraz jednoczesne deprotekcje (Boc/tBu; Cbz/tBu). Kolejną trudnością jest uzyskanie ilościowego uwalniania z żywicy przy zastosowaniu tej metody „zatrzasku bezpieczeństwa” (safety catch) w porównaniu do bardziej konwencjonalnych sposobów. Mając na uwadze te czynniki, istnieje duża możliwość dalszej optymalizacji tej metody, a w naszej grupie podejmowane są obecnie działania mające na celu udoskonalenie zaprezentowanego tutaj podejścia.
Oświadczenia
Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Agencję Redukcji Zagrożeń Obronnych Stanów Zjednoczonych (United States Defense Threat Reduction Agency).
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr. Zachary’emu Z. Brownowi oraz Jennifer Alleva za początkowy rozwój tej techniki syntezy na fazie stałej, a także Matthewowi F.L. Parkerowi za pomocne dyskusje. Praca ta jest wspierana przez Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) oraz stypendium Horst Witzel Fellowship Award wspieranym przez Cephalon, Inc.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Żywica HMBA-Am | Novabiochem, EMD Millipore | 855018 | |
| MSNT | Novabiochem, EMD Millipore | 851011 | |
| NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toksyczny, żrący |
| DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Kancerogenny |
| Bezwodny DCM | Acros Organics | 34846 | Kancerogenny |
| 33% bromowodoru w kwasie octowym | Sigma-Aldrich | 248630 | Toksyczny, żrący, wydziela opary po otwarciu |
| DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Łatwopalny, toksyczny, żrący |
| DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Łatwopalny, toksyczny |
| Bezwodny DMF | Acros Organics | 34843 | Łatwopalny, toksyczny |
| HOAt | GenScript | C01568 | |
| DIC | Acros Organics | BP590 | Łatwopalny, toksyczny, żrący |
| TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toksyczny, żrący |
| TIPS | Acros Organics | 21492 | Łatwopalny, toksyczny |
| Piperydyna | Sigma-Aldrich | 104094 | Łatwopalna, toksyczna, żrąca |
| HATU | GenScript | C01566 | Toksyczny |
| NMP | Acros Organics | 36438 | Toksyczny |
| DMAP | Novabiochem, EMD Millipore | 851055 | Toksyczny |
| Czerwień metylowa | Sigma-Aldrich | 250198 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Łatwopalny, toksyczny, tworzy nadtlenki |
| Pirolydyna | Sigma-Aldrich | P73803 | Łatwopalna, toksyczna, żrąca |
| Dimetylosulfotlenek | Fisher Scientific | D1281 | |
| Naczynia reakcyjne do SPPS | Grace | 211108 | |
| LCMS | Agilent Technologies | Seria 1200 | |
| Półpreparatywna LC | Hewlett-Packard | Seria 1100 | |
| Liofilizator | Labconco Corp. | 7934027 | |
| Rotawapor | Buchi | Seria R-210 | |
| Argon | Airgas | AR PP300CT |
Bibliografia
- Atherton, E., Sheppard, R. C. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1989).
- Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides. Biopolymers. 96, 578-585 (2010).
- Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. Shape-Programmable Macromolecules. Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).
- Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids. Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).
- Nielson, J., Lyngso, L. O. Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues. Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).
- Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports. Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).
- Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis. Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).
- Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation. Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).
- Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC. Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).
- Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Chan, W. C., White, P. D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2000).
- Vojkovsky, T. Detection of Secondary Amines on Solid-Phase. Peptide Research. 71, 236-237 (1995).
Przedruki i uprawnienia
