Szkolenie wyrafinowanej techniki mikrochirurgicznej: wstawienie zewnętrznego przeszczepu żyły szyjnej do wspólnej tętnicy szyjnej u szczurów

Summary

Przerost neointimy jest główną przyczyną zwężenia w żyłach tętniczych. Proponujemy nowy protokół, w którym prawa żyła szyjna zewnętrzna jest szczepiona techniką mankietową w tętnicy szyjnej wspólnej szczurów Sprague Dawley. Wskaźnik przeżycia wynosił 100 % w momencie złożenia ofiary.

Abstract

Przerost neointimy jest jedną z głównych przyczyn zwężenia w żyłach tętniczych, które mają ogromne znaczenie w operacji pomostowania tętnic wieńcowych, w operacji pomostowania tętnic obwodowych, jak również w przetokach tętniczo-żylnych. ^1-5 Eksperymentalna procedura wprowadzania przeszczepu żyły do tętnicy szyjnej wspólnej przy użyciu techniki mankietowej została zastosowana w kilku projektach badawczych w celu zbadania etiologii przerostu neointenalnego i możliwości terapeutycznych w celu jego rozwiązania. ^6-8 Mankiet zapobiega przebudowie zespolenia naczynia i wywołuje turbulencje w obrębie przeszczepu, a tym samym rozwój przerostu neointimalu.

Użycie przeszczepu żyły głównej jest uznanym modelem dla małych zwierząt do eksperymentu z tętnicami żylnymi. ^9-11 Ten obecny protokół odnosi się do ustalonej techniki wprowadzania przeszczepu żyły szyjnej, po raz pierwszy opisanej przez Zou i wsp., ⁹, a także innych. ^12-14 Niemniej jednak przytoczone protokoły dotyczące małych zwierząt są skomplikowane.

Aby uprościć procedurę i zminimalizować liczbę potrzebnych zwierząt doświadczalnych, przedstawiono szczegółowy protokół operacyjny za pomocą wideoszkolenia. Ten film powinien pomóc początkującemu chirurgowi w nauce zarówno techniki mankietu, jak i wstawiania przeszczepu żyły. W ten sposób prawa zewnętrzna żyła szyjna została przeszczepiona techniką mankietową w tętnicy szyjnej wspólnej 21 samic szczurów Sprague Dawley podzielonych na trzy równe grupy, które zostały uśmiercone odpowiednio w 21, 42 i 84 dniu. Warto zauważyć, że nie były potrzebne żadne zwierzęta dawcy, ponieważ wykonywano autoprzeszczepy. Wskaźnik przeżycia wynosił 100 % w momencie złożenia ofiary. Ponadto wskaźnik drożności przeszczepów wynosił 60 % dla pierwszych 10 operowanych zwierząt i 82 % dla pozostałych 11 zwierząt. Przepływ krwi w momencie składania ofiary wynosił 8±3 ml/min. Podsumowując, ten protokół chirurgiczny znacznie upraszcza, optymalizuje i standaryzuje tę skomplikowaną procedurę. Daje początkującym chirurgom łatwe, krok po kroku instrukcje, wyjaśniając możliwe pułapki, pomagając im w ten sposób szybko zdobyć wiedzę i uniknąć bezużytecznego poświęcania zwierząt doświadczalnych.

Protocol

1. Zwierzęta doświadczalne

1. Uzyskanie zgody Lokalnej Komisji Bioetycznej na wszystkie eksperymenty, które zostaną przeprowadzone, zgodnie z wytycznymi FELASA dotyczącymi ochrony zwierząt.
2. Używaj samic szczurów Sprague-Dawley, które można kupić od każdego komercyjnego hodowcy (np. Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, Niemcy). Wykorzystaliśmy 21 zwierząt podzielonych na trzy grupy po 7 zwierząt każda, które zostały uśmiercone w 3, 6 i 12 tygodniu po operacji. W momencie zakupu zwierzęta powinny mieć ukończone 12 tygodni i ważyć 250-300 g.
3. Trzymaj zwierzęta w klimatyzowanych pomieszczeniach o temperaturze otoczenia 21 °C, wilgotności względnej 60% i 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

2. Znieczulenie i przygotowanie operacyjne

1. Wywołać znieczulenie ogólne za pomocą pudełka z pleksiglasu podłączonego do aparatu do znieczulenia, ustawionego na natężenie przepływu tlenu 1 l/min, oraz parownika izofluoranu z 5% gazem znieczulającym.
2. Utrzymuj znieczulenie parownikiem izofluoranu na poziomie 1,5 %, gdy tylko głębokie odruchy czuciowe zwierząt zostaną stłumione.
3. Ułóż szczury w pozycji leżącej na płycie do rozgrzewania ciała.
4. Przygotuj obszar operacyjny każdego zwierzęcia, usuwając jego sierść kremem do depilacji, od kąta żuchwy do 2 cm poniżej manubrium sterni.
5. Przygotuj sterylne pole operacyjne, zwracając uwagę na obszar operacyjny, obszar przygotowany na zwierzęciu i przód chirurga:
   • Wyczyść blat środkiem dezynfekującym.
   • Przygotować miejsce nacięcia, stosując wielokrotne aplikacje roztworu do peelingu chirurgicznego (np. chlorheksydyny i 70% alkoholu izopropylowego). Najpierw nałóż chlorheksydynę, następnie alkohol, a na końcu roztwór do szorowania.
   • Noś jednorazowy fartuch chirurgiczny i rękawiczki chirurgiczne lub alternatywnie rękawiczki do badań, które zostały wcześniej umyte chirurgicznym środkiem dezynfekującym.
6. W procedurze operacyjnej należy używać sterylnych narzędzi mikrochirurgicznych.
7. Użyj mikroskopu operacyjnego (Wild Heerbrugg M650, Gais, Szwajcaria) w powiększeniu 10-20-krotnym.

3. Anatomia

Rysunek 1 przedstawia anatomię szyi szczura:

1a) Miejsce przed przecięciem prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.

1b) Lokalizacja po przecięciu prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.

4. Przygotowanie mankietu

Wytnij ręcznie mankiety o długości 3 mm z plastikowej rurki (Portex, średnica wewnętrzna 0,75 mm, średnica zewnętrzna 0,94 mm, Smiths Medical, Wielka Brytania). Mankiety te składają się z rurowego korpusu mankietu obejmującego całą objętość plastikowej rurki oraz uchwytu mankietu składającego się z połowy objętości mankietu. Zarówno korpus mankietu, jak i uchwyt mankietu powinny być jednakowo długie. Uchwyt mankietu jest niezbędny do manipulowania mankietem podczas zabiegu chirurgicznego. Po wsunięciu mankietu przez naczynie, zacisk mini Bulldog jest umieszczany jednocześnie na uchwycie mankietu i naczyniu, aby zapobiec krwawieniu, utrzymać mankiet na miejscu i zapewnić stabilność.

5. Technika mankietu

1. Wsuń mankiet na naczynie.
2. Natychmiast po naczyniu przeciągnij je na zewnątrz korpusu mankietu i przymocuj za pomocą jedwabnej ligatury 7-0. W ten sposób światło mankietu jest pokryte śródbłonkiem. Następnie wsuń przeszczep żylny na korpus mankietu i przymocuj go nową jedwabną ligaturą 7-0. Aby zapobiec tworzeniu się skrzepliny, konieczne jest zamocowanie opaski przeszczepu żyły bardzo blisko brzegu mankietu, aby uniknąć kontaktu krwi z opaską utrzymującą tętnicę na miejscu. Ma to kluczowe znaczenie dla zespolenia dystalnego ze względu na kierunek przepływu krwi. Jednak według autorów z tego samego powodu nie jest ona uważana za niezbędną dla zespolenia proksymalnego.

6. Zabieg chirurgiczny

6.1 Przygotowanie prawej żyły szyjnej zewnętrznej

1. Wykonaj środkowe nacięcie szyjki macicy o długości około 2,5 cm bezpośrednio nad manubrium sterni.
2. Całkowicie oddzielić odcinek prawej żyły szyjnej zewnętrznej o długości 1 cm od otaczających tkanek
3. Podwiązywać dopływy żylne za pomocą jedwabnych szwów 7-0.

6.2 Przygotowanie prawej tętnicy szyjnej wspólnej

1. Przygotuj mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i przetransektuj go w środku.
2. Ostrożnie przygotuj prawą tętnicę szyjną wspólną, uważając, aby nie uciskać tętnicy ani nerwu błędnego. Zmobilizuj go od rozwidlenia tętnicy szyjnej w dół do pnia ramienno-głowowego.
3. Następnie podwiąż go dwukrotnie w środku za pomocą szwów jedwabnych 7-0 przed przecięciem.
4. Wsuń nylonowy mankiet składający się z korpusu i uchwytu (Rysunek 2a) na dystalny koniec wspólnej tętnicy szyjnej, przy czym ważne jest, aby upewnić się, że uchwyt mankietu znajduje się za naczyniem (Rysunek 2b).
5. Zacisnąć mankietowany koniec dystalnej tętnicy szyjnej wspólnej za pomocą mini Bulldog clamp dokładnie na uchwycie mankietu, aby zapewnić stabilność (ryc. 2c).
6. Następnie przeciąć tętnicę bezpośrednio za ligaturą, przy czym powstały kikut tętnicy powinien być tak długi jak korpus mankietu.
7. Przepłukać światło tętnicy roztworem heparyny i soli fizjologicznej (20 j.m. heparyny / ml 0,9% NaCl). Odłóż pętlę podwiązania w odpowiedniej pozycji do późniejszego wykorzystania.
8. Pociągnij kikut tętnicy do góry i wsuń go jak rękaw na korpus mankietu.
9. Następnie pociągnij pętlę podwiązania i mocno ją zawiąż
.
10. Aby zapobiec wysunięciu się tętnicy z rękawa, możesz zastosować sztuczkę: chwyć jednocześnie ścianę tętnicy i szew prawą ręką, a lewymi kleszczami (ryc. 2d) zawiąż węzeł (ryc. 2e).
11. Powtórz tę samą procedurę dla bliższego kikuta tętnicy (ryc. 2f).

6.3 Umiejscowienie przeszczepu żylnego

1. Wyciąć odcinek o długości 1 cm zaciśniętej żyły szyjnej zewnętrznej
2. Ponieważ dwie tętnice z mankietem są zbyt daleko od siebie, aby można było wprowadzić je żylnie, należy w przybliżeniu określić prawidłową odległość dla tej procedury za pomocą szwu Vicryl 3-0, który należy owinąć wokół każdego zacisku mini Bulldog.
3. Krzyżuj oba szwy.
4. Następnie pociągnij szwy w przeciwnych kierunkach, umożliwiając prawidłowe ustawienie kikutów tętniczych z mankietem (ryc. 2g)
5. Przepłukać odcinek żyły roztworem heparyny i soli fizjologicznej.
6. Wsuń jeden koniec wcześniej odwróconego odcinka żyły przez dystalną tętnicę szyjną z mankietem i zabezpiecz go we właściwej pozycji za pomocą jedwabnej ligatury 7-0.
7. Należy tutaj zauważyć, że obwód żyły musi być całkowicie i równomiernie uchwycony.
8. Przepłukać odcinek żyły roztworem soli fizjologicznej heparyny i wsunąć drugi koniec odcinka żyły na kikut bliższej części tętnicy szyjnej.
9. Zakończ podwiązanie (ryc. 2h);
10. Zdejmij zaciski mini Bulldog jeden po drugim, najpierw na dystalnym kikutu tętnicy szyjnej, a następnie na bliższym, umożliwiając w ten sposób niezakłócony przepływ krwi i tętnicę przeszczepu żylnego (ryc. 2i). Operację uważa się za udaną, jeśli obserwuje się przepływ krwi i pulsację w obrębie przeszczepu i tętnicy szyjnej wspólnej (oceniane wizualnie).

6.4. Zamknięcie rany

Do podskórnego szwu biegowego użyj 4-0 Vicryl. W przypadku szwu biegowego na skórę użyj 3-0 Vicryl.

7. Rekonwalescencja i postępowanie pooperacyjne

1. Pozwól zwierzętom dojść do siebie po znieczuleniu na płaskiej papierowej pościeli pod lampą ocieplającą na podczerwień. Nie należy zwracać operowanych zwierząt do obszaru przetrzymywania zwierząt, dopóki wszystkie zwierzęta nie będą wyglądać normalnie.
2. Po operacji podawać buprenorfinę (Temgesic) w stężeniu 0,03-0,05 mg/kg m.c. sc co 8-12 godzin przez 2 dni. Buprenorfina może być podawana tuż przed indukcją izofluoranu.
3. Monitoruj zwierzęta po operacji pod kątem ich ogólnego stanu i oznak choroby lub infekcji.

8. Pomiar przepływu krwi

Pooperacyjna drożność przeszczepu została udowodniona przez pomiar przepływu krwi, przy użyciu badawczego systemu pomiaru przepływu krwi Transsonic (Model: TS420, Transonic Systems Europe B.V., Maastricht, Holandia) z sondą przepływu okołonaczyniowego (3 mm, MA3PSB). System oparty jest na zasadzie Dopplera.

9. Reprezentatywne wyniki

Dzięki wiernemu przestrzeganiu powyższych instrukcji, średni czas trwania operacji chirurgicznych wynosił około 65 minut. Zwierzęta prezentowały doskonałą kondycję fizyczną i przybrały na wadze zgodnie z oczekiwaniami przez cały czas trwania eksperymentu: w momencie rozpoczęcia operacji zwierzęta ważyły 312±20,39 g. W momencie uśmiercenia 3 tygodnie po operacji zwierzęta ważyły 325,2±28,7 g, po 6 tygodniach 333±39,9 g, a po 12 tygodniach 362,22±29 g.

W miejscu operacji nie zaobserwowano żadnych infekcji i nie pojawiły się żadne rany. Rany po operacji zagoiły się całkowicie w oczekiwanym czasie. Kontrola neurologiczna nie wykazała żadnych oznak zawału mózgu ani upośledzenia motorycznego. To ostatnie było ważne, ponieważ zwierzęta były operowane w tętnicy szyjnej, a jedna z dwóch zewnętrznych żył szyjnych została usunięta i wykorzystana jako autoprzeszczep. Nie zaobserwowano reakcji alergicznych na terapię przeciwbólową pooperacyjną.

Wszystkie zwierzęta były czujne i towarzyskie przez cały czas trwania eksperymentu. Ich nawyki dotyczące przyjmowania jedzenia i wody pozostały niezmienne przez cały czas.

Wskaźnik przeżycia wszystkich eksperymentów wynosił 100 % w momencie składania ofiary. Wskaźnik drożności przeszczepów wynosił 60 % dla pierwszych 10 operowanych zwierząt i odpowiednio 82 % dla pozostałych 11 zwierząt. Całkowita drożność przeszczepu wynosiła 71 %. Przepływ krwi w tętniczych przeszczepach żylnych mierzono w momencie ofiarowania i wynosił 8±3 ml/min bez żadnych statystycznie istotnych różnic między trzema punktami czasowymi ofiary.

Rysunek 1. Anatomia szyi szczura. 1a) Lokalizacja przed przecięciem prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego. 1b) Lokalizacja po przecięciu prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.

Rysunek 2. Śródoperacyjne zdjęcia mikroskopowe: a) mankiet składający się z korpusu mankietu i uchwytu mankietu; b) mankiet przesunięty przez dystalny koniec tętnicy szyjnej wspólnej; c) zaciśnięcie dystalnego kikuta tętnicy szyjnej wspólnej z mankietem; d) odwrócenie kikuta tętnicy szyjnej wspólnej nad mankietem; e) zabezpieczenie podwiązaniem kikuta tętnicy szyjnej wspólnej Everted; f) miejsce po wywinięciu zarówno dystalnych, jak i proksymalnych kikutów tętnicy szyjnej wspólnej; g) technika krzyżowa w celu zbliżenia dwóch kikutów tętnicy szyjnej wspólnej z mankietem; h) lokalizacja po wstawieniu żylnym; i) Lokalizacja po reperfuzji przeszczepu interpozycji żylnej.

Rysunek 3. Schematyczne przedstawienie miejsca po reperfuzji przeszczepu interpozycji żylnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Discussion

Wprowadzenie zewnętrznego przeszczepu żyły szyjnej do tętnicy szyjnej wspólnej jest wyrafinowaną techniką mikrochirurgiczną. Ten film pomaga początkującemu chirurgowi opanować tę technikę w jak najkrótszym czasie przy mniejszym marnotrawstwie zwierząt doświadczalnych.

Znieczulenie wziewne jest najlepszą opcją dla tej operacji, ponieważ pozwala uniknąć zbyt głębokiego etapu znieczulenia, może być dobrze kontrolowane i daje chirurgowi wystarczająco dużo czasu na operację. Co więcej, szczur jest ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pleciony jedwab 7-0	Ethicon Products	892100
Vicryl 3-0	Ethicon Products	J285G
Vicryl 4-0	Ethicon Products	J284G
Portex niesterylne rurki nylonowe 0,75 mm, 0,94 mm Rurki polietylenowe (polietylenowe) drobnootworowe	Portex	UK 800/200/175/100
Izofluoran 5 %			Dowolny genericon
Heparyna			Dowolna generikona
0,9% sól fizjologiczna			Dowolna generikona
Buprenorfina			Dowolna generikona