Hiperplazja neointimy jest główną przyczyną zwężenia w żyłach arteryalizowanych. Proponujemy nowy protokół, w którym żyła zewnętrzna szyjna prawa jest przeszczepiana z wykorzystaniem techniki mankietowej do tętnicy szyjnej wspólnej u szczurów Sprague Dawley. Przeżywalność w momencie uśmiercenia zwierząt wynosiła 100 %.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szkolenie z zaawansowanej techniki mikrosurgicalnej: Interpozycja przeszczepu z żyły szyjnej zewnętrznej w tętnicy szyjnej wspólnej u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hiperplazja neointimy jest jedną z głównych przyczyn stenozy w zarterializowanych żyłach, które mają ogromne znaczenie w chirurgii pomostowania tętnic wieńcowych, chirurgii pomostowania tętnic obwodowych, a także w przetokach tętniczo-żylnych.1-5 Eksperymentalna procedura interpozycji przeszczepu żylnego w tętnicy szyjnej wspólnej z wykorzystaniem techniki mankietowej (cuff-technique) została zastosowana w kilku projektach badawczych w celu zbadania etiologii hiperplazji neointimy oraz opcji terapeutycznych służących do jej zwalczania. 6-8 Mankiet zapobiega przebudowie anastomozy naczyniowej i indukuje turbulencje w obrębie przeszczepu, co prowadzi do rozwoju hiperplazji neointimy.
Wykorzystanie przeszczepu z żyły głównej górnej jest uznanym modelem na małych zwierzętach w eksperymentach nad arteryalizacją żył.9-11 Niniejszy protokół odnosi się do ugruntowanej techniki interpozycji przeszczepu z żyły szyjnej, po raz pierwszy opisanej przez Zou et al., 9 a także przez innych autorów.12-14 Niemniej jednak, cytowane protokoły dla małych zwierząt są skomplikowane.
Aby uprościć procedurę i zminimalizować liczbę potrzebnych zwierząt doświadczalnych, przedstawiono szczegółowy protokół operacyjny w formie szkolenia wideo. Film ten powinien pomóc początkującemu chirurgowi w opanowaniu zarówno techniki mankietowej, jak i interpozycji przeszczepu żylnego. W niniejszej pracy prawą żyłę szyjną zewnętrzną przeszczepiono techniką mankietową do tętnicy szyjnej wspólnej u 21 samic szczurów Sprague Dawley, podzielonych na trzy równe grupy, które uśmiercono odpowiednio w 21., 42. i 84. dniu. Co istotne, nie było potrzeby stosowania zwierząt dawców, ponieważ przeprowadzono autotransplantacje. Przeżywalność w momencie uśmiercenia wynosiła 100 %. Ponadto wskaźnik drożności przeszczepów wyniósł 60 % dla pierwszych 10 operowanych zwierząt i 82 % dla pozostałych 11 zwierząt. Przepływ krwi w momencie uśmiercenia wynosił 8±3 ml/min. Podsumowując, niniejszy protokół chirurgiczny znacznie upraszcza, optymalizuje i standaryzuje tę skomplikowaną procedurę. Zapewnia on początkującym chirurgom łatwą, instruktażową ścieżkę krok po kroku, wyjaśniając możliwe pułapki, co pomaga im szybko zdobyć doświadczenie i uniknąć niepotrzebnego uśmiercania zwierząt doświadczalnych.
Protokół
1. Zwierzęta doświadczalne
- Uzyskać zgodę Lokalnej Komisji Etycznej na wszystkie planowane eksperymenty, zgodnie z wytycznymi FELASA dotyczącymi ochrony zwierząt.
- Użyć samic szczurów Sprague-Dawley dostępnych w zakupie u dowolnego komercyjnego hodowcy (np. Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, Niemcy). W badaniu wykorzystano 21 zwierząt podzielonych na trzy grupy po 7 zwierząt każda, które zostały uśmiercone w 3., 6. i 12. tygodniu po operacji. W momencie zakupu zwierzęta powinny mieć 12 tygodni i ważyć 250-300 g.
- Utrzymywać zwierzęta w pomieszczeniach z klimatyzacją, przy temperaturze otoczenia 21 °C, wilgotności względnej 60% i 12-godzinnym cyklu światło-ciemność, zapewniając swobodny dostęp do pokarmu i wody.
2. Znieczulenie i przygotowanie operacyjne
- Wprowadzić zwierzęta w narkozę ogólną, używając skrzynki z pleksiglasu podłączonej do aparatury do znieczulenia, z przepływem tlenu ustawionym na 1 L/min i parownikiem izofluranu z 5 % gazem anestetycznym.
- Utrzymać znieczulenie za pomocą parownika izofluranu przy stężeniu 1,5 %, gdy tylko zostaną stłumione głębokie odruchy sensoryczne zwierząt.
- Utrwalić szczury w pozycji na plecach na podgrzewanej płycie.
- Przygotować obszar operacyjny każdego zwierzęcia, usuwając sierść kremem do depilacji, od kąta żuchwy w dół do 2 cm poniżej manubrium sterni.
- Przygotować sterylną strefę chirurgiczną, zwracając uwagę na obszar operacyjny, obszar przygotowany u zwierzęcia oraz przedpole chirurga:
- Oczyścić blat roboczy środkiem dezynfekcyjnym.
- Przygotować miejsce nacięcia, stosując wielokrotne aplikacje roztworu do mycia chirurgicznego (np. chloreksydyny i 70% alkoholu izopropylowego). Najpierw zastosować chloreksydynę, następnie alkohol, a na koniec roztwór do mycia.
- Założyć jednorazową fartuch chirurgiczny i rękawiczki chirurgiczne lub alternatywnie rękawiczki do badań, które zostały uprzednio umyte środkiem dezynfekcyjnym do chirurgii.
- W procedurze operacyjnej stosować sterylne instrumenty do mikrochirurgii.
- Użyć mikroskopu operacyjnego (Wild Heerbrugg M650, Gais, Szwajcaria) z powiększeniem 10-20-krotnym.
3. Anatomia
Rysunek 1 przedstawia anatomię szyi szczura:
1a) Situs przed przecięciem prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
1b) Situs po przecięciu prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
4. Przygotowanie mankietu
Ręcznie wytnij mankiety o długości 3 mm z plastikowej rurki (Portex, średnica wewnętrzna 0,75 mm, średnica zewnętrzna 0,94 mm, Smiths Medical, Wielka Brytania). Mankiety te składają się z rurkowatego korpusu mankietu, obejmującego pełną objętość plastikowej rurki, oraz uchwytu mankietu stanowiącego połowę objętości mankietu. Zarówno korpus mankietu, jak i jego uchwyt powinny mieć taką samą długość. Uchwyt mankietu jest niezbędny do manipulowania mankietem podczas procedury chirurgicznej. Po nasunięciu mankietu na naczynie, mini zacisk Bulldog jest umieszczany jednocześnie na uchwycie mankietu i naczyniu, aby zapobiec krwawieniu, utrzymać mankiet w pozycji i zapewnić stabilność.
5. Technika mankietowa
- Nasunąć mankiet na naczynie.
- Następnie natychmiast wywinąć naczynie na zewnątrz, naciągnąć je na korpus mankietu i przymocować za pomocą ligatury jedwabnej 7-0. W ten sposób światło mankietu zostanie pokryte śródbłonkiem. Następnie nasunąć przeszczep żylny na korpus mankietu i przymocować go nową ligaturą jedwabną 7-0. Aby zapobiec tworzeniu się skrzepów, kluczowe jest zawiązanie przeszczepu żylnego bardzo blisko krawędzi mankietu, aby krew nie miała kontaktu z więzadłem utrzymującym tętnicę na miejscu. Jest to szczególnie istotne w przypadku zespolenia dystalnego ze względu na kierunek przepływu krwi. Jednak według autorów, w przypadku zespolenia proksymalnego nie jest to uważane za niezbędne z tego samego powodu.
6. Procedura chirurgiczna
6.1 Przygotowanie prawej zewnętrznej żyły szyjnej
- Wykonaj przybliżone 2,5 cm nacięcie szyjne w linii pośrodkowej, bezpośrednio nad manubrium sterni.
- Całkowicie odseparuj 1 cm odcinek prawej żyły szyjnej zewnętrznej od otaczających tkanek.
- Podwiąż dopływy żylne za pomocą jedwabnych szwów 7-0.
6.2 Przygotowanie prawej tętnicy szyjnej wspólnej
- Przygotuj mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i przetnij go w połowie.
- Ostrożnie przygotuj prawą tętnicę szyjną wspólną, uważając, aby nie ucisnąć tętnicy ani nerwu Vagus. Zmobilizuj ją od rozwidlenia tętnicy szyjnej w dół do pnia ramionowo-głowowego.
- Następnie podwiąż ją dwukrotnie w połowie, używając szwów jedwabnych 7-0, przed przecięciem.
- Nasuń nylonową mankietkę składającą się z korpusu i uchwytu (Rycina 2a) na dystalny koniec tętnicy szyjnej wspólnej, przy czym ważne jest zapewnienie, aby uchwyt mankietki znajdował się za naczyniem (Rycina 2b).
- Zaciśnij zacisk typu mini Bulldog na mankietkowym końcu dystalnej tętnicy szyjnej wspólnej, dokładnie na uchwycie mankietki, aby zapewnić stabilność (Rycina 2c).
- Następnie przetnij tętnicę bezpośrednio za podwiązaniem, tak aby powstały kikut tętniczy był tak długi jak korpus mankietki.
- Przepłucz światło tętnicy roztworem soli fizjologicznej z heparyną (20 IU heparyny/ml 0.9% NaCl). Odłóż pętlę ligacyjną w odpowiedniej pozycji do późniejszego użycia.
- Podciągnij kikut tętniczy i nasuń go jak rękaw na korpus mankietki.
- Następnie pociągnij pętlę ligacyjną i mocno zawiąż węzeł.
- Aby zapobiec wysunięciu się tętnicy z rękawa, można zastosować pewien zabieg: chwyć jednocześnie prawą ręką zarówno ścianę tętnicy, jak i szew, a za pomocą kleszczyków w lewej ręce (Rycina 2d) zawiąż węzeł (Rycina 2e).
- Powtórz tę samą procedurę dla proksymalnego kikuta tętniczego (Rycina 2f).
6.3 Pozycjonowanie przeszczepu żylnego
- Wyciąć segment zaklemowanej zewnętrznej żyły szyjnej o długości 1 cm.
- Ponieważ dwie tętnice z mankietami znajdują się zbyt daleko od siebie, aby zastosować interpozycję żylną, należy przybliżyć je do odpowiedniej odległości za pomocą szwy Vicryl 3-0, którą należy owinąć wokół każdego z mini-zacisków Bulldog.
- Skrzyżować obie nici.
- Następnie pociągnąć nici w przeciwnych kierunkach, aby umożliwić prawidłowe ustawienie mankietowych kikutów tętniczych (Rysunek 2g).
- Przepłukać segment żyły roztworem soli fizjologicznej z heparyną.
- Nasunąć jeden koniec wcześniej odwróconego segmentu żyły na mankiet dystalnej tętnicy szyjnej i zabezpieczyć go w odpowiedniej pozycji ligaturem jedwabnym 7-0.
- Należy pamiętać, że obwód żyły musi zostać całkowicie i równomiernie uchwycony.
- Przepłukać segment żyły roztworem soli fizjologicznej z heparyną, a następnie nasunąć drugi koniec segmentu żyły na proksymalny kikut tętnicy szyjnej.
- Zakończyć ligację (Rysunek 2h);
- Usuwać mini-zaciski Bulldog jeden po drugim, najpierw z dystalnego kikuta tętnicy szyjnej, a następnie z proksymalnego, umożliwiając tym samym niezakłócony przepływ krwi i arteryalizację przeszczepu żylnego (Rysunek 2i). Operację uznaje się za udaną, jeśli w przeszczepie i wspólnej tętnicy szyjnej zaobserwowano przepływ krwi i pulsację (ocena wizualna).
6.4. Zamknięcie rany
Do szwu przedskórnego w sposób ciągły należy użyć nici 4-0 Vicryl. Do szwu skórnego w sposób ciągły należy użyć nici 3-0 Vicryl.
7. Rekonwalescencja i opieka pooperacyjna
- Pozostaw zwierzęta do wybudzenia z anestezji na płaskim podłożu z papieru pod lampą grzewczą na podczerwień. Nie przenoś operowanych zwierząt do pomieszczenia hodowlanego, dopóki wszystkie zwierzęta nie odzyskają normalnego stanu.
- Po zabiegu podawaj Buprenorfinę (Temgesic) w stężeniu 0,03-0,05 mg/kg m.c. podskórnie co 8-12 h przez 2 dni. Buprenorfinę można podać bezpośrednio przed indukcją izofluranem.
- Monitoruj stan ogólny zwierząt po zabiegu oraz obecność objawów choroby lub infekcji.
8. Pomiar przepływu krwi
Pooperacyjną drożność przeszczepu potwierdzono pomiarem przepływu krwi, wykorzystując badawczy system pomiaru przepływu krwi Transonic (Model: TS420, Transonic Systems Europe B.V., Maastricht, Holandia) z okołonaczyniową sondą przepływową (3 mm, MA3PSB). System ten opiera się na zasadzie Dopplera.
9. Reprezentatywne wyniki
Dzięki ścisłemu przestrzeganiu powyższych instrukcji średni czas operacji chirurgicznych wynosił około 65 min. Zwierzęta wykazywały doskonałą kondycję fizyczną i zwiększały masę ciała zgodnie z oczekiwaniami przez cały okres eksperymentu: w punkcie początkowym operacji zwierzęta ważyły 312±20.39 g. W punkcie uboju 3 tygodnie po operacji zwierzęta ważyły 325.2±28.7 g, w 6. tygodniu 333±39.9 g, a w 12. tygodniu 362.22±29 g.
W miejscu operacji nie zaobserwowano infekcji i nie pojawiły się żadne rany. Rany pooperacyjne zagoiły się całkowicie w przewidywanym czasie. W grupie kontrolnej neurologicznej nie stwierdzono oznak zawału mózgu ani deficytów motorycznych. Ten ostatni punkt był istotny, ponieważ operacje przeprowadzano na tętnicy szyjnej wspólnej, a jedną z dwóch żył szyjnych zewnętrznych usunięto i wykorzystano jako autotransplantat. Nie zaobserwowano reakcji alergicznych na pooperacyjną terapię przeciwbólową.
Wszystkie zwierzęta pozostawały czujne i socjalne przez cały czas trwania eksperymentu. Ich nawyki dotyczące przyjmowania pokarmu i wody nie uległy zmianie w całym badanym okresie.
Wskaźnik przeżywalności we wszystkich eksperymentach wynosił 100 % w momencie uboju. Wskaźnik drożności przeszczepów wyniósł 60 % dla pierwszych 10 operowanych zwierząt i odpowiednio 82 % dla pozostałych 11 zwierząt. Całkowita drożność przeszczepów wyniosła 71 %. Przepływ krwi w arteryalizowanych przeszczepach żylnych był mierzony w momencie uboju i wynosił 8±3 ml/min, bez statystycznie istotnych różnic pomiędzy trzema punktami czasowymi uboju.
Rysunek 1. Anatomia szyi szczura. 1a) Situs przed przecięciem prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowatego. 1b) Situs po przecięciu prawego mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowatego.
Rycina 2. Śródoperacyjne zdjęcia mikroskopowe: a) mankiet składający się z korpusu i uchwytu; b) mankiet nasunięty na dystalny koniec tętnicy szyjnej wspólnej; c) zaklemowanie dystalnego kikuta tętnicy szyjnej wspólnej z mankietem; d) wywinięcie kikuta tętnicy szyjnej wspólnej na mankiet; e) zabezpieczenie wywiniętego kikuta tętnicy szyjnej wspólnej ligaturą; f) situs po wywinięciu obu mankietowanych kikutów tętnicy szyjnej wspólnej – dystalnego i proksymalnego; g) technika krzyżowa (criss-cross) w celu zbliżenia dwóch mankietowanych kikutów tętnicy szyjnej wspólnej; h) situs po interpozycji żylnej; i) situs po reperfuzji żylnego przeszczepu interpozycyjnego.
Rycina 3. Schematyczne przedstawienie situs po reperfuzji żylnego przeszczepu interpozycyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wszczepienie przeszczepu z zewnętrznej żyły szyjnej do wspólnej tętnicy szyjnej jest zaawansowaną techniką mikrochirurgiczną. Niniejszy film pomaga początkującemu chirurgowi opanować tę metodę w minimalnym czasie, ograniczając przy tym liczbę wykorzystywanych zwierząt doświadczalnych.
Znieczulenie inhalacyjne jest najlepszą opcją dla tego zabiegu, ponieważ pozwala uniknąć zbyt głębokiej fazy znieczulenia, może być precyzyjnie kontrolowane i zapewnia chirurgowi wystarczająco dużo czasu na opera...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez program promocji badań "START" wydziału medycznego Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie, Niemcy (Tytuł: "Die Arterialisation venöser Gefäße" START 690753). Chcielibyśmy podziękować pani Mary-Joan Blümich za doskonałą pomoc w redakcji. Finansowanie dr Marii Kokozidou pochodziło z funduszu Fresenius 2011_A61.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pleciony jedwab czarny 7-0 | Ethicon Products | 892100 | |
| Vicryl 3-0 | Ethicon Products | J285G | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon Products | J284G | |
| Niesterylna rurka nylonowa Portex 0.75 mm, 0.94 mm polietylenowa rurka o małej średnicy wewnętrznej | Portex UK | 800/200/175/100 | |
| Isofluran 5 % | Dowolny producent generyczny | ||
| Heparyna | Dowolny producent generyczny | ||
| 0.9% sól fizjologiczna | Dowolny producent generyczny | ||
| Buprenorfina | Dowolny producent generyczny |
Bibliografia
- Motwani, J. G., Topol, E. J. Aortocoronary saphenous vein graft disease: Pathogenesis, Predisposition, and Prevention. Circulation. 97, 916-931 (1998).
- Bonatti, J., Oberhuber, A., Schachner, T., Zou, Y., Hammerer-Lercher, A., Mittermair, R., Laufer, G. Neointimal hyperplasia in coronary vein grafts: Pathophysiology and prevention of a significant clinical problem. The Heart Surg. , E72-E87 (2004).
- Roy-Chaudhury, P., Kelly, B. S., Zhang, J., Narayana, A., Desai, P., Melhem, M., Duncan, H., Heffelfinger, S. C. Hemodialysis Vascular Access Dysfunction: From Pathophysiology to Novel Therapies. Blood Purif. 21, 99-110 (2003).
- Dixon, B. S. Why don't fistulas mature. Kidney Int. 70, 1413-1422 (2006).
- Newby, A. C., Zaltsman, A. B. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia. J. Pathol. 190, 300-309 (2000).
- Schachner, T., Heiss, S., Zipponi, D., Tzankov, A. Perivascular treatment with azathioprine reduces neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Heart Surg. 9, E515-E517 (2006).
- Zhang, L., Sivashanmugam, P., Wu, J. H., Brian, L., Exum, S. T., Freedman, N. J., Peppel, K. Tumor necrosis factor receptor-2 signaling attenuates vein graft neointima formation by promoting endothelial recovery. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 284-289 (2008).
- Tzankov, A., Mairinger, T., Laufer, G., Bonatti, J. O. Local application of rapamycin inhibits neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Ann. Thorac. Surg. 77, 1580-1585 (2004).
- Zou, Y., Dietrich, H., Hu, Y., Metzler, B., Wick, G., Xu, Q. Mouse Model of Venous bypass graft arteriosclerosis. A.J.P. 153, 1301-1310 (1998).
- Schachner, T., Oberhuber, A., Zou, Y., Tzankov, A., Ott, H., Laufer, G., Bonatti, J. Rapamycin treatment is associated with an increased apoptosis rate in experimental vein grafts. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 27, 302-306 (2005).
- Ali, Z., Bursill, C., Hu, Y., Choudhury, R. P., Xu, Q., Greaves, D. R., Channon, K. M. Gene transfer of a broad spectrum CC-chemokine inhibitor reduces vein graft atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice. Circulation. 30, 1235-1241 (2005).
- Zou, J., Zhang, X., Yang, H., Zhu, Y., Ma, H., Wang, S. Rapamycin-loaded nanoparticles for inhibition of neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Ann. Vasc. Surg. 25, 538-546 (2011).
- Wang, J., Liu, K., Shen, L., Wu, H., Jing, H. Small interfering RNA to c-myc inhibits vein graft restenosis in a rat vein graft model. J. Surg. Res. 169, e85-e91 (2011).
- Schachner, T., Zou, Y., Oberhuber, A., Mairinger, T., Tzankov, A., Laufer, G., Ott, H., Bonatti, J. Perivascular application of C-type natriuretic peptide attenuates neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 25, 585-590 (2004).
- Thomas, A. C., Newby, A. C. Effect of matrix metalloproteinase-9 knockout on vein graft remodelling in mice. J. Vasc. Res. 47, 299-308 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
