Topologię adhezji komórek do podłoża mierzy się z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Topologia powierzchni, np. komórek rosnących na podłożu, jest określana z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM). Komórki są hodowane na przezroczystych szkiełkach i inkubowane z markerem fluorescencyjnym homogenicznie rozmieszczonym w ich błonie plazmatycznej. Oświetlenie odbywa się za pomocą równoległej wiązki lasera pod zmiennymi kątami całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) o różnych głębokościach penetracji ewanescentnego pola elektromagnetycznego. Rejestracja obrazów fluorescencji podczas naświetlania pod około 10 różnymi kątami pozwala na obliczenie odległości między komórką a podłożem z precyzją kilku nanometrów. W ten sposób określa się różnice w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, np. komórkami nowotworowymi a komórkami o mniejszej złośliwości. Dodatkowo można badać ewentualne zmiany adhezji komórkowej po działaniu chemicznym lub fotodynamicznym. W porównaniu z innymi metodami mikroskopii superrozdzielczej ekspozycja na światło jest utrzymywana na bardzo niskim poziomie, dzięki czemu nie spodziewa się uszkodzeń żywych komórek.
Wprowadzenie
Kiedy wiązka światła rozchodząca się w ośrodku o współczynniku załamania n1 napotyka granicę z drugim ośrodkiem o współczynniku załamania n2 < n1, następuje całkowite wewnętrzne odbicie dla wszystkich kątów padania Θ, które są większe od kąta krytycznego Θc=arcsin(n2/n1). Pomimo całkowitego odbicia, padająca wiązka światła wzbudza ewanescentne pole elektromagnetyczne, które przenika do drugiego ośrodka i zanika wykładniczo wraz z odległością z prostopadłą do granicy ośrodków zgodnie z równaniem I(z) = I0 e-z/d(Θ). I(z) odpowiada natężeniu pola elektromagnetycznego, a d(Θ) głębokości wnikania dla długości fali λ, zgodnie z wzorem
d(Θ) = (λ/4π) (n12 sin2Θ - n22)-1/2
Jak opisano w literaturze1,2, I0 odpowiada natężeniu światła padającego Ie pomnożonemu przez współczynnik transmisji T(Θ) oraz stosunek n2/n1. Jeśli wektor pola elektrycznego tej wiązki światła jest spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania (t.j. płaszczyzny wyznaczonej przez wiązkę padającą i odbitą), współczynnik transmisji ten jest określony wzorem
T(Θ) = 4 cos2 Θ / [1 - (n2/nL1)2]
W przypadku natężenia fluorescencji wykrytego w pomiarach TIRFM, absorpcję światła należy zintegrować dla wszystkich warstw próbki i pomnożyć przez wydajność kwantową fluorescencji η odpowiedniego barwnika oraz przez kąt zbierania Ω. Jak zgłoszono wcześniej3, natężenie to można opisać wzorem
IF (Θ) = A T(Θ)òc(z) e-z/d(Θ) dz
jeśli wszystkie czynniki niezależne od kąta padania Θ i współrzędnej z zostaną uwzględnione w stałej eksperymentalnej A. Równanie 3 można rozwiązać analitycznie, przyjmując, że stężenie c(z) fluoroforów jest niemal stałe
- we wszystkich współrzędnych z ≥ Δ, np. w cytoplazmie komórek znajdujących się w odległości Δ od powierzchni międzyfazowej. W takim przypadku całkę należy obliczyć od z= Δ do z= ∞, co daje wynik
IF = A c T(Θ) d(Θ) e-Δ/d(Θ)
- lub między z = Δ - t/2 a z = Δ + t/2, t.j. w obrębie cienkiej warstwy o grubości t, np. błony komórkowej znajdującej się w odległości Δ od granicy faz. W takim przypadku intensywność fluorescencji może zostać obliczona jako
IF = A c T(Θ) t e-Δ/d(Θ),
jeśli t jest małe w porównaniu z Δ.
Z równań (4) i (5) można obliczyć odległości komórka-podłoże Δ, jeżeli obrazy natężenia fluorescencji IF zostaną zarejestrowane dla zmiennych kątów Θ, a wartość ln (IF / T d) (Równ. 4) lub ln (IF / T) (Równ. 5) zostanie wyznaczona jako funkcja 1/d dla tych kątów. W przypadku markera błonowego laurdan użytego w niniejszej pracy (patrz poniżej), analiza została przeprowadzona zgodnie z równaniem 5.
Jak zgłoszono wcześniej3, akwizycja i ocena obrazu wymagają
- jednorodnego rozkładu światła wzbudzenia na próbce,
- spełnienia założeń modelu 2-warstwowego (z współczynnikami załamania n1 i n2 odpowiednio dla podłoża i cytoplazmy). Warunek ten jest zachowany, jeżeli błona plazmatyczna jest bardzo cienka, a warstwa medium zewnątrzkomórkowego (pomiędzy komórką a podłożem) jest mała w porównaniu z długością fali światła padającego.
Dodatkowo, korzystne jest zastosowanie obiektywu mikroskopowego o umiarkowanej aperturze numerycznej (zazwyczaj A ≤ 0.90), aby uniknąć odchyleń jasności wynikających z anizotropii promieniowania w polu bliskim interfejsu dielektrycznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Wysiew i inkubacja komórek
- Wysiać pojedyncze komórki, np. komórki glejaka U373-MG lub U-251-MG, z typową gęstością 100 cells/mm2 na szkiełku przedmiotowym i hodować je przez 48–72 hr w pożywce hodowlanej (np. RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej i antybiotyki) w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
- Inkubować komórki z markerem błonowym, np. 6-dodekanoylo-2-dimetyloaminonaftaliną (laurdanem) przez 60 min w stężeniu 8 μM (w pożywce hodowlanej)4, lub markerem cytoplazmatycznym, np. octonianem kalceiny przez 40 min w stężeniu 5 μM3, lub związanym z błoną fotosensybilizatorem, np. protoporfiryną IX indukowaną poprzez 4 hr inkubacji z jej prekursorem, kwasem 5-aminolewulinowym (5-ALA; 1 mM)4,5.
- Przemyć komórki pożywką hodowlaną lub roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przed badaniem w mikroskopii fluorescencyjnej.
2. VA-TIRFM
- Należy użyć mikroskopu pionowego, np. Zeiss Axioplan, i zastąpić jego kondensor urządzeniem oświetleniowym, zgodnie z opisem w Ref. 3, z półkulowym lub półcylindrycznym pryzmatem szklanym sprzężonym optycznie z przedmiotnikiem (patrz Rycina 1).
- Należy zastosować równoległą kolimowaną wiązkę laserową, która po obrazowaniu przez pryzmat szklany i dalsze komponenty optyczne (np. zwierciadło wklęsłe) ponownie tworzy wiązkę równoległą na powierzchni próbki (promień źrenicy telecentrycznej). Należy zadbać, aby wektor pola elektrycznego był spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania.
- Należy użyć regulowanego zwierciadła znajdującego się wewnątrz kondensora, które jest obrazowane w płaszczyźnie próbki i oświetla próbkę pod zmiennym kątem padania (promień obiektu). Regulowane zwierciadło może być napędzane silnikiem krokowym, gdzie każda pozycja odpowiada ściśle określonemu kątowi padania, wyznaczonemu za pomocą pomiarów goniometrycznych3.
- Należy skalibrować pozycję kątową regulowanego zwierciadła, przyjmując kąt krytyczny Θc=61.3° dla przejścia szkło-woda jako wartość stałą. Θc można zwizualizować podczas zmiany Θ, gdy w wodzie rozpuszczony jest barwnik fluorescencyjny (np. 1 mM mononukleotyd flawinowy, FMN). Pozycja zwierciadła dla Θ=Θc jest zapisywana w programie pozycjonowania zwierciadła.
- Należy ustawić parametry kamery (z podświetleniem tylnym Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, U.K.6), w tym temperaturę, wzmocnienie, czas rejestracji oraz prędkość przesunięcia.
- Należy użyć obiektywu o odpowiednim powiększeniu i najlepiej umiarkowanej aperturze numerycznej (np. 40×/0.75 lub 63×/0.90 w immersji wodnej) i zlokalizować przedmiotnik w mikroskopie. Należy zastosować olej immersyjny, aby zapewnić kontakt optyczny próbki z pryzmatem szklanym. Należy zarejestrować obrazy fluorescencyjne identycznych próbek przy zmianie kąta oświetlenia (Θ≥Θc, gdzie Θc odpowiada 64.5° dla interfejsu komórka-szkło). Zaleca się zakres kątowy od 66° do 74° z krokiem 0.5° lub 1°. Do detekcji fluorescencji należy użyć odpowiedniego filtra długoprzepustowego lub pasmowo-przepustowego.
3. Analiza danych
- Odczytaj obrazy (np. (w formacie ASCII) zarejestrowane pod różnymi kątami Θ, a także ustawienia kamery (do dyskryminacji tła), długość fali wzbudzenia oraz współczynniki załamania światła dla szkła (n1 = 1,52) oraz komórek (n2 = 1,37) do programu ewaluacyjnego (LabView; NanoCell). Dla każdego zestawu parametrów głębokość penetracji d(Θ) oraz współczynnik transmisji T(Θ) są obliczane automatycznie.
- Wybierz obrazy wykorzystane do oceny odległości między komórką a podłożem Δ zgodnie z równaniem 5 (marker błony) lub równaniem 4 (marker cytoplazmy). Można wykluczyć pojedyncze obrazy o niejednorodnym oświetleniu (wykazujące np. pasy).
- Oblicz obrazy topologii komórka-podłoże i wybierz odpowiedni kod kolorystyczny do wyświetlania. Podczas ewaluacji można wyświetlić profile poszczególnych pikseli, jak pokazano w Rysunek 2Profile te mogą służyć jako wskaźnik jakości dopasowania.
- Zarchiwizuj protokół oceny.
4. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne eksperymenty są przeprowadzane z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych komórek glejaka U251-MG, udostępnionych przez prof. Jana Mollenhauera z Katedry Onkologii Molekularnej Uniwersytetu Południowej Danii w Odense. W dwóch subklonach tych komórek U251 geny supresorowe TP53 lub PTEN są nadeksprymowane przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Tet-On, w wyniku czego komórki te wykazują obniżony potencjał nowotworowy i mogą być uznane za mniej złośliwe. Jako kontrole wykorzystuje się silnie złośliwe komórki U251-MG pozbawione genu supresorowego, natomiast komórki U251-MG typu dzikiego służą do dalszych porównań. Jako źródło wzbudzenia zastosowano diodę laserową emitującą quasi-ciągłą serię impulsów pikosekundowych (LDH400 ze sterownikiem PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Niemcy; długość fali: 391 nm; energia impulsu: 12 pJ; częstotliwość repetycji: 40 MHz).
Na Rysunku 3 przedstawiono obrazy TIRFM komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym TP53, inkubowanych z laurdanem (8 μM; 60 min), dla kątów padania 66,0°, 69,0° i 73,0°, co odpowiada głębokościom penetracji ewanescentnego pola elektromagnetycznego wynoszącym odpowiednio około 140 nm, 75 nm i 60 nm. Wraz ze zmniejszeniem głębokości penetracji intensywność fluorescencji spada (patrz skale) i pochodzi z bardziej powierzchownych obszarów komórek (np. kontaktów ogniskowych na ich krawędziach). Odległości komórka-podłoże (zwizualizowane na Rysunku 3d za pomocą kodu kolorystycznego w zakresie 0-600 nm) wykazują silne zróżnicowanie w obrębie komórek, od zaledwie kilku nanometrów (biało-żółte) do 250-300 nm (ciemnoczerwone), tzn. kontakty ogniskowe i większe odległości komórka-podłoże znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie. To samo dotyczy komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym PTEN (Rysunek 4d), podczas gdy odległości komórka-podłoże są raczej stałe dla kontrolnych komórek U251-MG oraz komórek typu dzikiego, z typowymi wartościami 80-100 nm (żółte; Rysunek 4b) i 150-200 nm (pomarańczowo-czerwone; Rysunek 4a).
Rycina 1. Urządzenie oświetleniowe dla VA-TIRFM w mikroskopie pionowym. Regulowane lustro napędzane silnikiem krokowym zapewnia rozdzielczość kątową ±0.25°.
Rycina 2. Profil ewaluacji dla jednego piksela (schemat). Gdy ln[IF/T(Θ)] zostaje naniesiony jako funkcja 1/d(Θ), nachylenie reprezentuje odległość komórka-podłoże Δ. Nachylenie to jest zazwyczaj wyznaczane z precyzją wynoszącą około ±10%. Jedna wartość – wynikająca z niejednorodnego oświetlenia – została zaznaczona i wykluczona z ewaluacji.
Rycina 3. Obrazy TIRFM komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym TP53 po inkubacji z laurdanem (8 μM; 60 min) zarejestrowane pod różnymi kątami oświetlenia (a-c); odległości komórka-podłoże w zakresie 0-600 nm przedstawione za pomocą kodu kolorystycznego (d); długość fali wzbudzenia: 391 nm, detekcja: ≥420 nm; rozmiar obrazu: 210 μm × 210 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię.
Rysunek 4. Odległości komórka-podłoże komórek glejaka U251-MG w zakresie 0-600 nm przedstawione za pomocą kodu kolorystycznego; (a) typ dziki (b) kontrole; (c) komórki z aktywowanym genem supresorowym TP53; (d) komórki z aktywowanym genem supresorowym PTEN; długość fali wzbudzenia: 391 nm, detekcja: ≥420 nm; rozmiar obrazu: 210 μm × 210 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisano metodę pomiaru odległości między komórką a podłożem z precyzją nanometrową. Obecnie znaczne zainteresowanie budzą metody mikroskopii superrozdzielczej, np. oparte na oświetleniu strukturalnym7 lub detekcji pojedynczych cząsteczek8-10, a także mikroskopia z eliminacją emisji stymulowanej (STED)11. Żadna z tych technik nie pozwala jednak na uzyskanie rozdzielczości osiowej poniżej 50 nm. Ponadto w metodach detekcji pojedynczych cząsteczek wymagane jest dość wysokie natężeni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują krajowi Baden-Württemberg oraz Unii Europejskiej – Europejskiemu Funduszowi Rozwoju Regionalnego – za sfinansowanie ZAFH-PHOTONn, Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań (BMBF) za sfinansowanie grantu badawczego nr 1792C08, a także Baden-Württemberg-Stiftung GmbH za sfinansowanie projektu „Aurami”.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inkubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA | |
| Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
| DMEM + 10%FCS + 1 % penicylina / streptomycyna | BIOCHROM | Pożywka hodowlana | |
| Szklane przedmioty do mikroskopu | Marienfeld | Czyste białe szkło | Zastosowano specjalną procedurę czyszczenia |
| 6-dodekanoil-2-dimetylamino naftalen (laurdan) | Molecular Probes | Marker fluorescencyjny (roztwór zapasowy: 2 mM w etanolu) | |
| Mikroskop | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
| Dioda laserowa | PicoQuant | LDH 400 ze sterownikiem PDL 800-B | Długość fali: 391 nm |
| System jednomodowego światłowodu | Point Source | kineFlex | Stosowany z optyką kolimującą |
| Kamera EMCCD | Andor | DV887DC | Kamera z podświetleniem tylnym |
Bibliografia
- Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
- Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
- Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
- Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).
- Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
- Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
- Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
- Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
- Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
- Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
- Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
