Nanotopologia adhezji komórek w mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM)

Summary

Topologia adhezji komórek na podłożu jest mierzona z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM).

Abstract

Topologia powierzchni, np. komórek rosnących na podłożu, jest określana z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM). Komórki hoduje się na przezroczystych szkiełkach i inkubuje z markerem fluorescencyjnym równomiernie rozmieszczonym w błonie plazmatycznej. Oświetlenie odbywa się za pomocą równoległej wiązki laserowej pod zmiennymi kątami całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) o różnych głębokościach penetracji ulotnego pola elektromagnetycznego. Zapis obrazów fluorescencyjnych po naświetlaniu pod około 10 różnymi kątami pozwala na obliczenie odległości komórka-substrat z dokładnością do kilku nanometrów. W ten sposób określa się różnice w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, np. komórkami nowotworowymi i komórkami mniej złośliwymi. Ponadto można zbadać możliwe zmiany adhezji komórek po leczeniu chemicznym lub fotodynamicznym. W porównaniu z innymi metodami mikroskopii superrozdzielczej, ekspozycja na światło jest utrzymywana na bardzo małym poziomie i nie oczekuje się, że dojdzie do uszkodzenia żywych komórek.

Introduction

Gdy wiązka światła rozchodząca się przez ośrodek o współczynniku załamania światła n₁ spotyka się z interfejsem do drugiego ośrodka o współczynniku załamania światła n₂ < n₁, całkowite wewnętrzne odbicie występuje pod wszystkimi kątami padania Θ, które są większe niż kąt krytyczny Θ_c=arcsin(n₂/n₁). Pomimo całkowitego odbicia, padająca wiązka światła wywołuje ulotne pole elektromagnetyczne, które przenika do drugiego ośrodka i zanika wykładniczo wraz z prostopadłą odległością z od granicy faz zgodnie z I(z) = I_{0 ^e-z/d(Θ)}. I(z) odpowiada natężeniu pola elektromagnetycznego, a d(Θ) gł....

Protocol

1. Siew i inkubacja komórek

1. Wysiewać pojedyncze komórki, np. komórki glejaka U373-MG lub U-251-MG o typowej gęstości 100 komórek/^mm2 na szkiełku podstawowym i hodować je przez 4872 godziny w pożywce hodowlanej (np. RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą i antybiotykami) przy użyciu inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Inkubować komórki za pomocą markera błonowego, np. 6-dodekanoilo-2-dimetyloaminonaftalenu (laurdanu) stosowanego przez 60 minut w stężeniu 8 μM (w pożywce hodowlanej)⁴ lub markera cytoplazmy, np. acetometliestu kalceiny stosowanego przez 40 minut....

Discussion

Opisano metodę pomiaru odległości między komórką a substratem z nanometrową precyzją. Obecnie dużym zainteresowaniem cieszą się metody mikroskopii superrozdzielczej, np. oparte na oświetleniu^{strukturalnym7} lub detekcji pojedynczych cząsteczek^8-10 , a także mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED)¹¹ . Żadna z tych technik nie pozwala jednak na osiągnięcie rozdzielczości osiowej poniżej 50 nm. Ponadto w przypadku metod jednocząsteczkowych potrzebne jest dość wysokie natężeni.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inkubator		Nunc Nunc Cellstar QM1300SVBA
Przepływ laminarny	Holten	Safe S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicylina / Streptomycyna	BIOCHROM		Podłoże uprawowe
Szkiełka szklane	Marienfeld	Pure white Szkło	Zastosowano specjalną procedurę czyszczenia
6-dodekanoilo-2-dimetyloamina naftalen (laurdan)	Sondy molekularne		Marker fluorescencyjny (roztwór podstawowy: 2 mM w etanolu)
Mikroskop	Carl Zeiss	Axioplan 1
Dioda laserowa	PicoQuant	LDH 400 ze sterownikiem PDL 800-B	Długość fali: 391 nm
System światłowodowy jednomodowy	Źródło punktowe	kineFlex	Używany z optyką kolimacyjną
Kamera EMCCD	Andor	DV887DC	Kamera z podświetleniem tylnym