Method Article

Nanotopologia adhezji komórek w mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM)

DOI:

10.3791/4133

⸱

October 2nd, 2012

 ,  ,  , 
1Hochschule Aalen, Institut für Angewandte Forschung

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Topologia adhezji komórek na podłożu jest mierzona z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Topologia powierzchni, np. komórek rosnących na podłożu, jest określana z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o zmiennym kącie całkowitego wewnętrznego odbicia (VA-TIRFM). Komórki hoduje się na przezroczystych szkiełkach i inkubuje z markerem fluorescencyjnym równomiernie rozmieszczonym w błonie plazmatycznej. Oświetlenie odbywa się za pomocą równoległej wiązki laserowej pod zmiennymi kątami całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) o różnych głębokościach penetracji ulotnego pola elektromagnetycznego. Zapis obrazów fluorescencyjnych po naświetlaniu pod około 10 różnymi kątami pozwala na obliczenie odległości komórka-substrat z dokładnością do kilku nanometrów. W ten sposób określa się różnice w adhezji między różnymi liniami komórkowymi, np. komórkami nowotworowymi i komórkami mniej złośliwymi. Ponadto można zbadać możliwe zmiany adhezji komórek po leczeniu chemicznym lub fotodynamicznym. W porównaniu z innymi metodami mikroskopii superrozdzielczej, ekspozycja na światło jest utrzymywana na bardzo małym poziomie i nie oczekuje się, że dojdzie do uszkodzenia żywych komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy wiązka światła rozchodząca się przez ośrodek o współczynniku załamania światła n1 spotyka się z interfejsem do drugiego ośrodka o współczynniku załamania światła n2 < n1, całkowite wewnętrzne odbicie występuje pod wszystkimi kątami padania Θ, które są większe niż kąt krytyczny Θc=arcsin(n2/n1). Pomimo całkowitego odbicia, padająca wiązka światła wywołuje ulotne pole elektromagnetyczne, które przenika do drugiego ośrodka i zanika wykładniczo wraz z prostopadłą odległością z od granicy faz zgodnie z I(z) = I0 e-z/d(Θ). I(z) odpowiada natężeniu pola elektromagnetycznego, a d(Θ) głębokości penetracji przy długości fali λ, zgodnie ze wzorem

d(Θ) = (λ/4π) (n12 sin2Θ - n22)-1/2

Jak podaje literatura1,2, I0 odpowiada intensywności padającego światła Ie pomnożonej przez współczynnik transmisji T(Θ) i stosunek n2/n1. Jeżeli wektor pola elektrycznego tej wiązki światła jest spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania (tj. płaszczyzny, w której pada wiązka i promienia odbita), to ten współczynnik transmisji jest określony wzorem

T(Θ) = 4 cos2 Θ / [1 - (n2/nL1)2]

Dla wykrytej intensywności fluorescencji w pomiarach TIRFM, absorpcja światła musi być zintegrowana na wszystkich warstwach próbki i pomnożona przez η kwantowej fluorescencji odpowiedniego barwnika, jak również przez kąt bryłowy wykrywania Ω. Jak podano wcześniej3, intensywność tę można opisać za pomocą wzoru

IF (Θ) = A T(Θ)òc(z) e-z/d(Θ) dz

jeśli wszystkie czynniki, które są niezależne od kąta padania Θ i współrzędnej z są zawarte w stałej eksperymentalnej A. Równanie 3 można rozwiązać analitycznie, jeśli stężenie c(z) fluoroforów uważa się za prawie stałe

- albo na wszystkich współrzędnych z ≥ Δ, np. w cytoplazmie komórek mających odległość Δ od interfejsu. W takim przypadku całkę należy obliczyć od z= Δ do z= ∞, co daje

IF = A c T(Θ) d(Θ) e-Δ/d(Θ)

- lub między z = Δ - t/2 i z = Δ + t/2, tj. w cienkiej warstwie o grubości t, np. błonie komórkowej znajdującej się w pewnej odległości Δ od granicy faz. W takim przypadku intensywność fluorescencji można obliczyć jako

IF = A c T(Θ) t e-Δ/d(Θ),

jeśli t jest małe w porównaniu z Δ.

Z równań (4) i (5) odległości komórka-podłoże Δ mogą być obliczone, jeśli obrazy intensywności fluorescencji IF są rejestrowane dla zmiennych kątów Θ, i jeśli ln (IF / T d) (Równanie 4) lub ln (IF / T) (Równanie 5) jest obliczane jako funkcja 1/d dla tych kątów. Dla markera błonowego laurdan użytego w tej pracy (patrz poniżej) ocenę przeprowadzono zgodnie z równaniem 5.

Jak wspomniano wcześniej3, pozyskiwanie i ocena obrazu wymaga
- Jednorodny rozkład światła wzbudzającego na próbce,
- trafność modelu dwuwarstwowego (z indeksami załamania światła n1 i n2 odpowiednio dla substratu i cytoplazmy). Dzieje się tak, jeśli błona plazmatyczna jest bardzo cienka, a warstwa ośrodka zewnątrzkomórkowego (między komórką a substratem) jest mała w porównaniu z długością fali padającego światła.

Ponadto, umiarkowana apertura numeryczna (zazwyczaj A ≤ 0,90) obiektywu mikroskopu jest korzystna, aby uniknąć odchyleń jasności spowodowanych anizotropią promieniowania w bliskim polu granicy faz dielektrycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Siew i inkubacja komórek

  1. Wysiewać pojedyncze komórki, np. komórki glejaka U373-MG lub U-251-MG o typowej gęstości 100 komórek/mm2 na szkiełku podstawowym i hodować je przez 4872 godziny w pożywce hodowlanej (np. RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą i antybiotykami) przy użyciu inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Inkubować komórki za pomocą markera błonowego, np. 6-dodekanoilo-2-dimetyloaminonaftalenu (laurdanu) stosowanego przez 60 minut w stężeniu 8 μM (w pożywce hodowlanej)4 lub markera cytoplazmy, np. acetometliestu kalceiny stosowanego przez 40 minut w stężeniu 5μM3, lub fotosensybilizatora związanego z błoną, np. protoporfiryny IX indukowanej po 4 godzinach inkubacji z jej prekursorem kwasem 5-aminolewulinowym (5-ALA; 1 mM)4,5.
  3. Przemyć komórki pożywką hodowlaną lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) przed mikroskopią fluorescencyjną.

2. VA-TIRFM

  1. Użyj mikroskopu pionowego, np. Zeiss Axioplan, i zastąp jego kondensor urządzeniem oświetleniowym, jak opisano w ref. 3, półsferycznym lub półcylindrycznym szklanym pryzmatem optycznie sprzężonym ze szkiełkiem podstawowym (patrz rysunek 1).
  2. Stosować równoległą skolimowaną wiązkę laserową, która po zobrazowaniu przez szklany pryzmat i dalsze elementy optyczne (np. wklęsłe lustro) ponownie powoduje powstanie równoległej wiązki na powierzchni próbki (telecentryczny promień źrenicy). Zwróć uwagę, aby wektor pola elektrycznego był spolaryzowany prostopadle do płaszczyzny padania.
  3. Użyj regulowanego lustra umieszczonego wewnątrz kondensatora, które jest obrazowane w płaszczyźnie próbki i oświetla próbkę pod zmiennym kątem padania (promień obiektu). Regulowane zwierciadło może być napędzane silnikiem krokowym, gdzie każde położenie odpowiada ściśle określonemu kątowi padania, określonemu za pomocą pomiarów goniometrycznych3.
  4. Skalibruj położenie kątowe regulowanego zwierciadła, używając kąta krytycznego Θc=61,3° dla przejścia szkło-woda jako wartości stałej. Θc można uwidocznić przy zmianie Θ, gdy barwnik fluorescencyjny (np. 1 mM mononukleotyd flawinowy, FMN) jest rozpuszczony w wodzie. Położenie lustra przy Θ=Θc jest zapisane w programie pozycjonowania lustra.
  5. Ustaw parametry kamery (podświetlana od tyłu Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Technology, Belfast, Wielka Brytania 6), w tym temperaturę, wzmocnienie, czas nagrywania i prędkość zmiany biegów.
  6. Użyj soczewki obiektywu o odpowiednim powiększeniu i preferencyjnie umiarkowanej aperturze numerycznej (np. 40×/0,75 lub 63×/0,90 zanurzenie w wodzie) i zlokalizuj szkiełko obiektu w mikroskopie. Użyj olejku immersyjnego, aby zapewnić kontakt optyczny próbki ze szklanym pryzmatem. Rejestrować obrazy fluorescencyjne identycznych próbek przy zmianie kąta oświetlenia (Θ≥Θc, przy czym Θc odpowiada 64,5° dla granicy faz komórka-szkło). Zalecany jest zakres kątowy 66°-74° z krokami co 0,5° lub 1°. Użyj odpowiedniego filtra długoprzepustowego lub pasmowoprzepustowego do wykrywania fluorescencji.

3. Analiza danych

  1. Odczyt obrazów (np. w formacie ASCII) zarejestrowanych pod różnymi kątami Θ, a także ustawień kamery (do dyskryminacji tła), długości fali wzbudzenia i współczynników załamania światła dla szkła (n1 = 1,52) i komórek (n2 = 1,37) do programu oceniającego (LabView; NanoKomórka). Dla każdego zestawu parametrów głębokość penetracji d(Θ) i współczynnik transmisji T(Θ) są obliczane automatycznie.
  2. Wybrane obrazy używane do oceny odległości komórka-substrat Δ zgodnie z równaniem 5 (marker błonowy) lub równaniem 4 (marker cytoplazmy), Pojedyncze obrazy o niejednorodnym oświetleniu (odsłaniające np. paski) mogą być wykluczone.
  3. Oblicz obrazy topologii komórka-podłoże i wybierz odpowiedni kod kolorystyczny do wyświetlenia. Podczas oceny mogą być wyświetlane profile poszczególnych pikseli, jak pokazano na rysunku 2. Profile te mogą być używane jako wskaźnik jakości dopasowania.
  4. Przechowuj protokół oceny.

4. Reprezentatywne wyniki

Reprezentatywne eksperymenty są przeprowadzane z genetycznie modyfikowanymi komórkami glejaka U251-MG, które zostały dostarczone przez prof. Jana Mollenhauera, Wydział Onkologii Molekularnej, Uniwersytet Południowej Danii, Odense. W dwóch subklonach tych komórek U251 geny supresorowe TP53 lub PTEN ulegają nadmiernej ekspresji przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Tet-On, tak że komórki te wykazują zmniejszony potencjał rakotwórczy i mogą być uważane za mniej złośliwe. Wysoce złośliwe komórki U251-MG bez genu supresorowego są używane jako kontrole, a komórki typu dzikiego U251-MG służą do dalszego porównania. Jako źródło wzbudzenia wykorzystywana jest dioda laserowa emitująca quasi-ciągłą serię impulsów pikosekundowych (LDH400 ze sterownikiem PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Niemcy; długość fali: 391 nm; energia impulsu: 12 pJ; częstotliwość powtarzania: 40 MHz).

Na rysunku 3 obrazy TIRFM komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym TP53 i inkubowanych z laurdanem (8 μM; 60 min) są przedstawione dla kątów padania 66,0°, 69,0° i 73,0° odpowiadających głębokościom penetracji ulotnego pola elektromagnetycznego około 140 nm, 75 nm i 60 nm, odpowiednio. Wraz ze zmniejszającą się głębokością penetracji fluorescencja zmniejsza swoją intensywność (patrz skale) i pochodzi z bardziej powierzchownych miejsc komórek (np. styków ogniskowych na ich krawędziach). Odległości komórka-substrat (wizualizowane na rysunku 3d za pomocą kodu kolorystycznego w zakresie 0-600 nm) silnie różnią się w komórkach między zaledwie kilkoma nanometrami (biało-żółty) a 250-300 nm (ciemnoczerwony), tj. kontakty ogniskowe i większe odległości komórka-podłoże znajdują się w bliskim sąsiedztwie. To samo dotyczy komórek glejaka U251-MG z aktywowanym genem supresorowym PTEN (ryc. 4d), podczas gdy odległości między komórkami a substratem są raczej stałe dla komórek kontrolnych U251-MG i komórek typu dzikiego o typowych wartościach 80-100 nm (żółty; Rysunek 4b) i 150-200 nm (pomarańczowo-czerwony; Rysunek 4a).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Urządzenie oświetleniowe do VA-TIRFM w mikroskopie pionowym. Regulowane lustro napędzane silnikiem krokowym pozwala na rozdzielczość kątową ±0,25°.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Profil oceny dla jednego piksela (schemat). Gdy ln[IF/T(Θ)] jest wykreślane jako funkcja 1/d(Θ), nachylenie reprezentuje odległość komórka-substrat Δ. Nachylenie to jest zwykle określane z dokładnością około ±10%. Jedna wartość - wynikająca z niejednorodnego oświetlenia - została oznaczona i wykluczona z oceny.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Obrazy TIRFM komórek glejaka wielopostaciowego U251-MG z aktywowanym genem supresorowym TP53 po inkubacji z laurdanem (8 μM; 60 min) zarejestrowane pod różnymi kątami oświetlenia (a-c); odległości komórka-podłoże w zakresie 0-600 nm oznaczone kodem kolorystycznym (d); długość fali wzbudzenia: 391 nm, detekcja: ≥420 nm; Rozmiar obrazu: 210 μm × 210 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-protocol-4
Rysunek 4. Odległości komórka-substrat komórek glejaka U251-MG w zakresie 0-600 nm pokazane kodem kolorystycznym; a) typ dziki; b) kontrola; c) komórki z aktywowanym genem supresorowym TP53; d) komórki z aktywowanym genem supresorowym PTEN; długość fali wzbudzenia: 391 nm, detekcja: ≥420 nm; Rozmiar obrazu: 210 μm × 210 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę pomiaru odległości między komórką a substratem z nanometrową precyzją. Obecnie dużym zainteresowaniem cieszą się metody mikroskopii superrozdzielczej, np. oparte na oświetleniustrukturalnym7 lub detekcji pojedynczych cząsteczek8-10 , a także mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED)11 . Żadna z tych technik nie pozwala jednak na osiągnięcie rozdzielczości osiowej poniżej 50 nm. Ponadto w przypadku metod jednocząsteczkowych potrzebne jest dość wysokie natężeni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Land Baden-Württemberg oraz Europäische Union -Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung - za finansowanie ZAFH-PHOTONn, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) za sfinansowanie grantu badawczego nr 1792C08 oraz Baden-Württemberg-Stiftung GmbH za finansowanie projektu "Aurami".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
InkubatorNunc Nunc Cellstar
QM1300SVBA
Przepływ laminarnyHoltenSafe S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicylina / StreptomycynaBIOCHROMPodłoże uprawowe
Szkiełka szklaneMarienfeldPure white SzkłoZastosowano specjalną procedurę czyszczenia
6-dodekanoilo-2-dimetyloamina naftalen (laurdan)Sondy molekularneMarker fluorescencyjny (roztwór podstawowy: 2 mM w etanolu)
MikroskopCarl ZeissAxioplan 1
Dioda laserowaPicoQuantLDH 400 ze sterownikiem PDL 800-BDługość fali: 391 nm
System światłowodowy jednomodowy Źródło punktowekineFlexUżywany z optyką kolimacyjną
Kamera EMCCDAndorDV887DCKamera z podświetleniem tylnym

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
  2. Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
  3. Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
  4. Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317(2008).
  5. Lassalle, H. -P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
  6. Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
  7. Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
  8. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
  10. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
  11. Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
  12. Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
  13. Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
  14. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
  15. Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
  16. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  17. Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Variable Angle TIRFMCell Adhesion TopologyFluorescence MicroscopyEvanescent Field PenetrationTotal Internal ReflectionFluorescent Membrane MarkerAdjustable Mirror CalibrationSubstrate Distance MeasurementCancer Cell ComparisonNanometer Resolution Imaging

Related Articles