Izolacja mysiej wysepek Langerhansa przy użyciu kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy

Podsumowanie

Szczegółowy opis izolacji mysich wysp trzustkowych jest opisany za pomocą techniki in-situ kanulacji przewodowej trzustki i perfuzji kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy.

Streszczenie

Badanie ekspresji i funkcji genów komórek beta in vitro na przestrzeni lat uległo gwałtownemu przesunięciu z badania linii komórek rakotwórczych gryzoni na badanie izolowanych wysepek gryzoni. Pierwotne wyspy trzustkowe mają wyraźną zaletę, ponieważ wierniej odzwierciedlają biologię wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i odpowiedzi wydzielniczych. Podczas gdy metoda izolacji wysp trzustkowych przy użyciu preparatów enzymu dysocjującego tkanki (TDE) została dobrze ugruntowana w wielu laboratoriach^1-4, różnice w konsystencji plonu i jakości wysepek trzustkowych z dowolnego szczepu gryzoni ograniczają zakres i wykonalność pierwotnych badań wysp trzustkowych. Różnice te często występują w wyniku surowych, częściowo oczyszczonych TDE stosowanych w procedurze izolacji wysp trzustkowych; TDE często wykazują różnice w aktywności między partiami i często wymagają dostosowania dawki stosowanego enzymu. W niewielkiej liczbie doniesień stosowano oczyszczone TDE do izolacji komórek gryzoni^{5, 6}, ale praktyka ta nie jest powszechna pomimo rutynowego stosowania i zalet oczyszczonych TDE do izolacji ludzkich wysp trzustkowych. We współpracy z VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN) opracowaliśmy zmodyfikowany protokół izolacji mysich wysp trzustkowych oparty na protokole opisanym przez Gotoh^{7, 8}, w którym TDE są perfundowane bezpośrednio do przewodu trzustkowego myszy, a następnie następuje frakcjonowanie surowych tkanek przez gradient histopatyczny⁹ i izolacja oczyszczonych wysp trzustkowych. Istotną różnicą w naszym protokole jest zastosowanie kombinacji oczyszczonej kolagenazy (CIzyme MA) i neutralnej proteazy (CIzyme BP). Kolagenaza charakteryzowała się zastosowaniem testu aktywności^degradacji kolagenu 6 fluorescencji (CDA), który wykorzystywał znakowane fluorescencyjnie rozpuszczalne włókienka skóry cielęcej jako substrat⁶. Ten substrat jest bardziej predykcyjny pod względem kinetyki degradacji kolagenu w macierzy tkankowej, ponieważ opiera się na natywnym kolagenie jako substracie. Proteazę scharakteryzowano czułym fluorescencyjnym testem kinetycznym¹⁰. Wykorzystanie tych ulepszonych testów wraz z bardziej tradycyjną analizą biochemiczną umożliwia bardziej konsekwentną produkcję TDE, co prowadzi do poprawy spójności wydajności między partiami. Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem maksymalnej wydajności wysepek i optymalnej morfologii wysp przy użyciu myszy C57BL/6. Podczas opracowywania tego protokołu oceniono kilka kombinacji kolagenazy i proteaz obojętnych w różnych stężeniach, a końcowy stosunek kolagenazy do proteazy neutralnej wynoszący 35:10 reprezentuje wydajność enzymu porównywalną z Sigma typu XI. Ponieważ odnotowano znaczną zmienność średnich plonów wysp trzustkowych z różnych szczepów szczurów i myszy, należy wprowadzić dodatkowe modyfikacje składu TDE w celu poprawy wydajności i jakości wysepek odzyskanych z różnych gatunków i szczepów.

Protokół

A. Potrzebne materiały: Zobacz Tabelę 1 (odczynniki) przed przygotowaniem

1. HBSS(P/S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H₂0 + 1% penicylina/streptomycyna (przechowywane w lodówce lub przechowywane na lodzie).
2. 20% wywaru BSA jest wytwarzane w wodzie, a następnie przechowywane w temperaturze -20 °C.
3. HBSS(BSA): 200 ml 1X HBSS(P/S) + 3 ml 20% BSA (końcowe stężenie BSA wynosi 0,3%)
4. Podłoże wysepkowe: RPMI + 10% FBS + 1% glutamina + 1% penicylina/streptomycyna
5. Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
6. Szew 4-0 (McKesson): pokrojony na 2 3/4 cala i przechowywany na 10-centymetrowej szalce Petriego
7. Instrumenty: Zegnij kleszcze z Fine Science Tools pod kątem 90 ° i spiłuj ząbkowane zęby wszystkich trzech par kleszczy. Celem jest zatępienie zębów, a nie ich usunięcie.
8. Kaniula do podawania mieszaniny kolagenazy i proteazy: igła 27G 1/2 cala, igła 30 1/2 cala, rurka PE50 pocięta na 12 cali części. Spiłuj obie igły do gładkiego, zaokrąglonego końca, który nie ma ostrych krawędzi. Włóż igłę 27G do jednego końca 12-calowej igły. kawałek rurki PE50. Wyjmij igłę 30G z obudowy, rozbijając osłonkę szczypcami, obracając osłonkę za każdym razem o 1/4 obrotu. Wyjmij igłę szczypcami z obudowy i włóż ją do drugiego końca rurki PE50 pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że nie zginasz rurki podczas wkładania igły do rurki PE50. Igła 27G to koniec, do którego dołączysz strzykawkę z kolagenazą.
9. Kolagenaza (CIzyme MA) i proteaza obojętna (CIzyme BP). Rozpuść TDE zgodnie z instrukcjami producenta. Zapoznać się z certyfikatem analizy dla danej partii w celu obliczenia stężenia aktywności enzymu. Przenieś łącznie 350 000 jednostek rozkładu kolagenu (CDA) odtworzonej kolagenazy i 100 000 neutralnych jednostek proteazy odtworzonej proteazy BP do stożkowej probówki i rozcieńcz do 15 ml łącznie w HBSS (P / S)

B. Protokół krok po kroku

1. Inflacja trzustki za pomocą mieszaniny kolagenazy i proteazy

1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, nasyc tułów myszy 70% EtOH, całkowicie otwórz jamę brzuszną od odbytu do przepony za pomocą nożyczek i kleszczy preparacyjnych.
2. Umieść mysz na platformie mikroskopu preparacyjnego.
3. Wyciągnij kątnicę i okrężnicę wstępującą i umieść je na zewnątrz jamy ciała po lewej stronie. Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z podsumowaniem następujących kroków.
4. Ustaw płaty wątroby przy przeponie; powinny tam pozostać, jeśli jama ciała jest wystarczająco otwarta. Znajdź tętnicę wątrobową, żyłę wrotną i wiązkę dróg żółciowych prowadzącą do wątroby, chwytając dwunastnicę zakrzywionymi kleszkami. Za pomocą kolejnej pary zakrzywionych kleszczy sięgnij pod tętnicę, żyłę i wiązkę przewodów i wciągnij 23/4 do środka. Kawałek szwu 4-0 pod tętnicą, żyłą, przewodem żółciowym i zawiąż go raz i mocno pociągnij jak najbliżej wątroby.
5. Za pomocą dwóch par zakrzywionych kleszczy ostrożnie chwyć dwunastnicę i znajdź przewód żółciowy przyczepiony do dwunastnicy przy brodawce. Użyj szczypiec kleszczyków, aby przebić się przez trzustkę i tkankę łączną tuż pod przewodem żółciowym w pobliżu brodawki. Szybko przebij kleszcze przez narząd, aby zrobić dziurę, a następnie przełóż przez nie oba szczypce kleszczy i chwyć przez nie kolejny kawałek szwu 4-0 o długości 23/4 cala i zawiąż go raz i pociągnij do małego koła, ale NIE ciągnij mocno.
6. Zamień się na kleszcze 90 ° i nożyczki Superfine Vannas. Za pomocą kleszczy 90 ° ostrożnie uszczypnij i pociągnij jelito cienkie, aż przewód żółciowy będzie napięty. Wykonaj jedno poziome cięcie w poprzek brodawki nożyczkami, wbijając otwarte nożyczki w jelito, a następnie tnąc jednym ruchem. Staraj się wykonać tylko jedno cięcie w poprzek brodawki, nie usuwając przewodu żółciowego z brodawki.
7. Trzymając jelito kleszczami 90 °, włóż kaniulę do przewodu żółciowego do połowy długości przewodu żółciowego, a następnie delikatnie mocno naciągnij szew wokół kaniuli.
8. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml 2,0 ml mieszaniny kolagenazy/proteazy i wstrzyknij do kaniuli w powolnym, stałym tempie.
9. Po zakończeniu pompowania trzustki usuń kaniulę z przewodu żółciowego i użyj zakrzywionych kleszczy i zakrzywionych nożyczek sprężynowych, aby usunąć napompowaną trzustkę, zaczynając od okrężnicy zstępującej i przecinając tkankę łączną podczas ciągnięcia jelit do góry. Kontynuuj usuwanie trzustki z jelit, aż dotrzesz do przewodu żółciowego, następnie usuń trzustkę ze śledziony, następnie żołądka, a następnie z wnętrzności jamy brzusznej. Zakończ usuwanie, odcinając szwy. Dodać trzustkę do 50 ml probówki zawierającej 5 ml HBSS(P/S). Ta rurka powinna być na lodzie.
10. Powtórz powyższą procedurę dla każdego zwierzęcia do czterech zwierząt. Aby uzyskać optymalne wyniki, oddziel tylko cztery trzustki jednocześnie. Zazwyczaj, podczas gdy pierwsze cztery znajdują się w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, nadmuchujemy kolejne cztery trzustkę.

2. Dysocjacja trzustki

1. Umieścić 50 ml probówek zawierających trzustkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut.
2. Delikatnie kołysz rurką i sprawdź, czy nie ma dysocjacji tkanek, upewnij się, że tkanka łatwo się rozpada, a następnie zakręć rurkami 12 razy, trzymając rurkę za pokrywkę.
3. Dodać nie więcej niż 30 ml HBSS (BSA) (może to być mniejsza ilość, w zależności od tego, ile jest potrzebne do zrównoważenia probówek do etapu wirowania) i wirować przy 290 x g przez jedną minutę.
4. Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić niewielką ilość supernatantu (2-3 ml) na dnie, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
5. Za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml dołączonej do igły 14G dodać nie więcej niż 10 ml HBSS(BSA) i odessać zawiesinę 2 razy w górę i w dół.
6. Przefiltruj mieszaninę komórek przez plastikowe sitko do herbaty do probówki o pojemności 50 ml i spłucz kolejnymi 10 ml HBSS (BSA).
7. Wirować przy 330 x g przez 2 min.
8. Zdekantować supernatant i odwrócić probówki do odsączenia na chłonnym ręczniku papierowym przez 1 min.
9. Zawiesić każdą probówkę w 10 ml zimnego roztworu 1100 histopaque.
10. Nałożyć na histopak 10 ml HBSS(BSA) i odwirować przy 900 x g przez 18 minut.
11. Usunąć całe 20 ml supernatantu za pomocą pipety o pojemności 25 ml i przepuścić supernatant przez odwrócony filtr 70 μm.
12. Wypłucz wysepki na 10-centymetrową szalkę Petriego, pipetując 10 ml pożywki z wysepek przez filtr, trzymając ją prawą stroną do góry nad szalką.
13. Hodować wysepki w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do momentu przygotowania do eksperymentów. Zazwyczaj wysepki są ręcznie wybierane i liczone przed eksperymentami.

3. Reprezentatywne wyniki

Plony wysepek, morfologia i jakość to ogólne parametry używane do oceny sukcesu izolacji wysepek. W naszych rękach wydajność wysepek z przeciętnej myszy C57BL/6 mieści się w zakresie 150-250 wysepek przy użyciu tego protokołu (patrz Tabela 2) i jest porównywalna z danymi uzyskanymi przy użyciu zoptymalizowanej kolagenazy Sigma typu XI. Jednak plony mogą się różnić w zależności od użytej odmiany myszy i wieku myszy. Większość zatrudnionych przez nas zwierząt jest w wieku 8-16 tygodni Protokół ten został przetestowany na wielu szczepach myszy, w tym C57BL/6 (180-250 wysepek/mysz), CD1 (200-300 wysepek/mysz), 129/B6 (200-300 wysepek/mysz), BLKS-db/db (120-200 wysepek/mysz), NOD (10-tygodniowe, 100-150 wysepek/mysz) i NOD-SCID (100-150 wysepek/mysz). Typowa morfologia wysepek jest pokazana na rysunku 2, na którym wysepki mają kształt okrągły do podłużnego o stosunkowo jednolitym rozmiarze (chociaż jednorodność wielkości może się różnić w zależności od odmiany). Rycina 3 przedstawia naszą typową analizę stymulowanego glukozą wydzielania insuliny z mysich wysp wysepkowych C57BL/6 wyizolowanych przy użyciu oczyszczonych TDE w porównaniu z kolagenazą Sigma typu XI. Zazwyczaj wysokiej jakości preparat na wyspach trzustkowych powoduje stymulację insuliną przy poziomie 25 mM glukozy, który jest 6-20 razy większy niż obserwowany przy 2,5 mM glukozy. Inne zastosowania mogą być również wykorzystywane do badania jakości izolowanych wysp trzustkowych, a należą do nich m.in. stosowanie technik peryfuzji, obrazowania Ca²⁺ (z Fura2) i PCR z odwrotną transkrypcją¹¹.

Rysunek 1. Podsumowanie kaniulacji przewodu żółciowego.

Rysunek 2. Typowy wygląd wysepek C57BL/6 po 24 godzinach od izolacji. Obrazy uzyskano pod mikroskopem odwróconym przy 40-krotnym powiększeniu.

Rysunek 3. Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny przez wyspy trzustkowe C57BL/6. Po 24 godzinach od izolacji 100 wysepek inkubowano w 12-dołkowym naczyniu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w roztworze buforowanym przez Krebsa-Ringera HEPES zawierającym 2,5 mM glukozy. Wyspy trzustkowe przeniesiono następnie do Krebs-Ringer HEPES przy 2,5 mM glukozy przez dodatkową godzinę, po czym pobrano supernatant do pomiaru insuliny za pomocą dwumiejscowego immunospecyficznego testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymami (ELISA) (Crystal Chem). Te same wysepki przeniesiono następnie do roztworu buforowanego przez Krebsa-Ringera HEPES zawierającego 25 mM glukozy, a uwalnianie insuliny do pożywki mierzono metodą ELISA po 1 godzinie inkubacji.

Dyskusja

W tym protokole opisaliśmy naszą procedurę kaniulacji, perfuzji kolagenazy i dysocjacji mysiej trzustki, której celem jest wyizolowanie wysepek Langerhansa. Technicznie rzecz biorąc, nasza metoda, po opanowaniu, powinna pozwolić na izolację trzustki w ciągu 4 minut od eutanazji zwierzęcia, a do 1 godziny powinna skutkować izolacją wysp trzustkowych od pojedynczego zwierzęcia. Szybkość tej techniki pozwala nam na odizolowanie wysepek od maksymalnie 12 myszy na typowym odcinku, co skutkuje izolacją do 3000 wysepek.

W przeciwieństwie do innych protokołów, które wykorzystują surowe preparaty kolagenazy, nasz protokół obejmuje użycie oczyszczonych proteaz, CIzyme Collagenaza MA i CIzyme BP Protease. Różnice w konsystencji preparatów TDE, które są dostępne na rynku, wymagają, aby każda partia była indywidualnie testowana i optymalizowana przed ogólnym użyciem. Ta zmienność między partiami skłoniła nas do rozważenia zastosowania oczyszczonych TDE z VitaCyte. Te wysoce oczyszczone TDE charakteryzują się wieloma metodami, w tym zastosowaniem czułych testów substratów znakowanych fluorescencyjnie. Test fluorescencji CDA jest bardziej czuły na różne molekularne formy kolagenazy, które mają różną kinetykę w degradacji kolagenu natywnego. Historyczne testy substratów peptydowych zapewniają niepełną ocenę kolagenazy. Scharakteryzowanie kolagenazy wieloma metodami zapewnia większą aktywność enzymatyczną między partiami.

Opierając się na naszych wewnętrznych testach z wykorzystaniem różnych preparatów kolagenazy dostępnych na rynku, stwierdziliśmy, że oczyszczone kombinacje enzymów dały powtarzalne wyniki między partiami. Głównymi zaletami stosowania wysoce oczyszczonych i rygorystycznie scharakteryzowanych TDE w tym zastosowaniu jest to, że po określeniu optymalnego składu enzymatycznego zapewniona jest spójność wydajności między partiami. Ta konsystencja eliminuje pracochłonny proces kwalifikacji partii, zwykle wymagany w przypadku surowych lub wzbogaconych produktów kolagenazy. Oczyszczone TDE umożliwiają również dodatkowe modyfikacje składu w celu poprawy wydajności i jakości wysepek odzyskanych z różnych szczepów myszy. Raportowanie optymalnych kompozycji enzymatycznych do izolacji wysp trzustkowych od różnych szczepów myszy może być skuteczniej komunikowane. To z kolei prowadzi do bardziej produktywnego wykorzystania zasobów i większej elastyczności w projektowaniu eksperymentów.

Istnieje wiele krytycznych kroków, które mogą mieć wpływ na wynik izolacji wysp trzustkowych przy użyciu naszego protokołu. Pierwszym z nich jest konieczność osiągnięcia efektywnej inflacji trzustki podczas perfuzji preparatu enzymatycznego. Ważne jest, aby rozpocząć pompowanie z delikatną siłą na strzykawce i zwiększać siłę w miarę napełniania się trzustki. Pomocne jest poruszanie jelitami i podnoszenie trzustki podczas pompowania, tak aby kolagenaza przenikała przez cały narząd. Kolejnym krytycznym etapem jest siła, z jaką potrząsa się probówkami po inkubacji w temperaturze 37 °C (krok 2.2). Odkryliśmy, że mocne potrząsanie trzustką o pokrywę rurki powoduje fragmentację wysepek, ale bez jakiejkolwiek formy dysocjacji mechanicznej na tym etapie, wydajność wysepek może drastycznie spaść. Konieczne jest również, aby podczas etapu dysocjacji za pomocą strzykawki (krok 2.5) podczas ruchu tłoka w górę i w dół została przyłożona siła o średnim natężeniu; Zapewnia to odpowiednią dysocjację tkanek przed etapem filtracji (2.6), w którym bardzo mało tkanki powinno pozostać na filtrze sitka do herbaty. Ostatnim krokiem, który należy dokładnie wykonać, jest aspiracja całych 20 ml histopakujących frakcjonowanych wysp trzustkowych. Chociaż wysepki znajdują się zazwyczaj na granicy histopaque i HBSS, odkryliśmy, że tracimy wysepki, gdy próbujemy usunąć tylko interfejs; Zamiast tego usuwamy teraz całe 20 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml z dużym otworem. Dodaliśmy filtrację przez odwrócony filtr 70 μm (krok 2.11), aby wyeliminować potrzebę wielokrotnego odwirowywania wysepek w celu wypłukania histopaku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10X HBSS	Life Technologies	14065
RPMI	Fisher Scientific	10-040
BSA	Sigma Aldrich	any
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771
Histopaque 1119	Sigma Aldrich	11191
4-0 Szew 100 jardów rolka	McKesson	451521
Igła 14 g z końcem	Fisher Scientific	14-8216M
Vannas Superfine Nożyczki	Fisher Scientific	501778
Zakrzywione nożyczki sprężynowe	Fisher Scientific	14127
Kleszcze zakrzywione (2)	Fisher Scientific	15914G
Kleszczyki zakrzywione (do 90 stopni)	Fine Science Tools	11052-10
Igła 27G 1/2 cala	Fisher Scientific	305109
30G Igła 1/2 cala	Rurka PE Fisher Scientific	305106
Becton	Dickinson	427411
Collagenase MA	Vitacyte, LLC	001-2030
BP Proteaza	Vitacyte, LLC	003-1000
Strzykawka 3 ml	Fisher Scientific 309585
Strzykawka 30 ml	Fisher Scientific	309650
70 μ m filtr	Fisher Scientific	352350
10 cm2 Szalka Petriego	Fisher Scientific	351005
Plastikowe sitko do herbaty	Dowolne zaopatrzenie
Sigma type XI (l010M8618) MA (100615) BP (110329) MA (081104) BP ( 100823) MA (091211) BP (101109) 216 (± 74) 260 (± 45) 157 (± 37) 200 (± 4)
Tabela 2. Średnie plony wysepek (± SD) przy użyciu różnych partii TDE* *Dane reprezentują średnie plony wysepek z co najmniej 10 myszy. Numery partii w nawiasach