Mikrodializa etanolu podczas operacyjnego samopodawania etanolu oraz oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Podsumowanie

Opisano metodę określania przebiegu czasowego stężenia etanolu w mózgach szczurów podczas operantowej samopodaży etanolu. Do ilościowego oznaczenia etanolu w próbkach dialyzatu zastosowano chromatografię gazową z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, ponieważ charakteryzuje się ona czułością wymaganą dla generowanych małych objętości.

Streszczenie

Metody operantowej samopodaży są powszechnie stosowane do badania efektów behawioralnych i farmakologicznych wielu substancji psychoaktywnych, w tym etanolu. Jednak etanol jest zazwyczaj podawany drogą doustną, a nie dożylną, jak ma to miejsce w przypadku wielu innych narkotyków. Farmakokinetyka leków podawanych doustnie jest bardziej złożona niż w przypadku leków podawanych dożylnie. Ponieważ zrozumienie związku między efektami farmakologicznymi a behawioralnymi etanolu wymaga wiedzy na temat przebiegu czasowego przenikania etanolu do mózgu w trakcie i po piciu, stosujemy mikrodializę in vivo oraz chromatografię gazową z detekcją zapłonową w celu monitorowania stężeń etanolu w dialyzacie mózgowym w czasie.

Połączone eksperymenty behawioralne i mikrodializacyjne obejmują zastosowanie kilku technik. W niniejszym artykule zabieg stereotaksyczny, trening behawioralny oraz mikrodializa, które mogą być dostosowane do testowania wielu hipotez dotyczących samopodawania i neurochemii, zostały ujęte jedynie w celu zilustrowania ich związku z późniejszymi etapami pobierania próbek i analizy etanolu w dializacie. Szczegółowo opisano analizę stężenia etanolu w dializacie za pomocą chromatografii gazowej z detekcją jonizacji płomieniowej, która jest specyficzna dla badań nad etanolem. Dane uzyskane tymi metodami ujawniają wzorzec przenikania etanolu do mózgu podczas procedury samopodawania, a w połączeniu z analizą neurochemiczną tych samych próbek dializatu pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących efektów farmakologicznych i behawioralnych etanolu.

Protokół

1. Chirurgia stereotaktyczna

1. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee.
2. Przy użyciu aparatu stereotaktycznego, u oswojonych szczurów Long-Evans znieczulonych izofluranem, implantuje się kaniulę o rozmiarze 21G (do późniejszego wprowadzenia sondy do mikrodializy) (Plastics One, Roanoke, VA) powyżej badanego obszaru mózgu, a w podstawie czaszki montuje się śrubę mocującą (służącą do podtrzymywania sprzętu do mikrodializy).
3. Szczury należy uważnie monitorować w trakcie i po operacji. Należy upewnić się, że wszystkie zwierzęta otrzymały co najmniej tydzień opieki i rekonwalescencji pooperacyjnej oraz są zdrowe przed rozpoczęciem kolejnych procedur. Dostępny jest film JoVE przedstawiający metodę operacji stereotaktycznej.¹

2. Trening operantowy

1. Po tygodniowej rekonwalescencji pooperacyjnej zwierzęta są szkolone w naciskaniu dźwigni w celu otrzymania 10% roztworu sacharozy w komorze operantowej Med Associates (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) wyposażonej w likometr, chowaną dźwignię oraz rurkę do picia (jak opisano wcześniej w Howard et al., 2009).² Do zaprojektowania wszystkich programów operantowych wykorzystuje się oprogramowanie firmy MedAssociates (MedAssociates, Inc., Vermont, USA).
2. Po wytrenowaniu zwierząt do reagowania w celu otrzymania sacharozy, należy wprowadzić szczury na odpowiedni schemat treningowy, podczas którego do roztworu stopniowo dodaje się etanol w ciągu wielu sesji picia.
3. Na przykład nasze laboratorium stosuje obecnie 8-dniowy schemat treningowy, w którym etanol jest stopniowo wprowadzany do roztworu, aż do uzyskania końcowego roztworu do picia zawierającego 10% etanolu i 10% sacharozy. Zwierzęta kontrolne otrzymują jedynie 10% sacharozy lub nie otrzymują żadnego roztworu do picia. Konkretny rodzaj stosowanego schematu operantowego może być bardzo zróżnicowany, jednak ogólne procedury pobierania próbek metodą mikrodializy opisane poniżej mogą zostać nadal przeprowadzone. ³

3. Procedury przed mikrodializą: Przymocowanie (tethering)

1. W noc poprzedzającą przedostatnią sesję treningową (w naszym przykładzie jest to 7^ma sesja treningowa), zwierzęta są habituowane do sprężyny wiążącej, która łączy się ze śrubą wiążącą na ich implantach głowowych. Sprężyna mocowana jest do obrotowego złącza mikrodializy oraz ramienia dźwigni przeciwwagi, które jest zawieszone obok klatki za pomocą statywu z obejmami, aby zwierzę mogło swobodnie poruszać się wewnątrz klatki. Zwierzęta z zamocowanym wiązaniem spędzają noc w pomieszczeniu operantowym, w swojej klatce domowej z dostępem ad libitum do pożywienia i wody, aby przyzwyczaić je do zestawu wiążącego.
2. Następnego dnia szczur kończy program operantowy z założonym wiązaniem, aby habituować zwierzę do odczucia związane z wiązaniem podczas wykonywania zadań behawioralnych. Zamontuj aparat wiążący do ściany komory operantowej w pobliżu górnej krawędzi, aby umożliwić zawieszenie wiązania i złącza obrotowego nad środkiem dachu komory operantowej. Całość znajduje się wewnątrz komory wygłuszającej. Po sesji przenieś szczura z powrotem do klatki domowej w pomieszczeniu operantowym, gdzie będzie oczekiwał na wprowadzenie sondy do mikrodializy.

4. Procedury przed mikrodializą: Sonda do mikrodializy jest wprowadzana w dniu poprzedzającym eksperyment mikrodializacyjny, po zakończeniu treningu behawioralnego szczura w danym dniu

1. Dzień przed eksperymentem z mikrodializą, po zakończeniu przez szczura sesji operantowej w systemie wiązanym, znieczulić zwierzę izofluranem i usunąć obturator z kaniuli prowadzącej. Powoli (w ciągu ok. 5 min) wprowadzić sondę do mikrodializy, przepłukaną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), przez czaszkową kaniulę prowadzącą do docelowego obszaru mózgu. Stosujemy sondy wykonane w laboratorium oraz procedury mikrodializy opracowane na podstawie prac Doyon et al., 2003 oraz Pettit and Justice, 1991.^{3, 4}
2. Użyć wcześniej omówionego aparatu do wiązania, aby zawiesić linie wlotową i wylotową sondy nad zwierzęciem.
3. Zmniejszyć szybkość przepływu w sondzie do 0,2 μl/min. Szczur ponownie spędza noc w pomieszczeniu z aparaturą operantową.

5. Procedury mikrodializy: Pobieranie próbek podczas sesji samopodawania z rozdzielonymi fazami apetytyczną i konsumpcyjną

1. Przynajmniej 2 h przed rozpoczęciem eksperymentu ustaw sondę na roboczy przepływ. W zależności od regionu mózgu stosujemy przepływ 1,0 lub 2,0 μl/min. Sprawdź, czy przepływ sondy jest stabilny i wynosi co najmniej 90% wartości zadanej, mierząc objętość w czasie za pomocą strzykawki Hamiltona.
2. Próbki dializy (5 lub 7 min) są pobierane przed, w trakcie i po sesji operantowej. Interwał próbkowania zależy od regionu mózgu, analizowanego neuroprzekaźnika, stężenia analitycznego w dializacie oraz czułości aparatury chemii analitycznej wykorzystywanej do analizy. Fazy behawioralne przebiegają następująco:
   1. Linia bazowa: na początku eksperymentu pobierz próbki dializy w domowej klatce zwierzęcia (4 próbki).
   2. Transfer: po pobraniu próbek bazowych z domowej klatki przenieś szczura do komory operantowej. Transfer przymocowanego szczura wymaga szczególnej ostrożności, aby linia przesyłowa płynu do mikrodializy nie zaplątała się i aby szczur zachował spokój. Bezpośrednio po transferze uruchom program operantowy, przechodząc z próbki bazowej/transferowej do pierwszej próbki z fazy oczekiwania.
   3. Oczekiwanie: kontynuuj pobieranie próbek, podczas gdy szczur czeka na wysunięcie dźwigni do komory (3-4 próbki w zależności od regionu mózgu).
   4. Picie: po prezentacji i naciśnięciu dźwigni szczur otrzymuje dostęp do butelki z roztworem do picia (10% sacharozy/10% etanolu lub 10% sacharozy) na około 20 min (3-4 próbki).
   5. Po piciu: po okresie picia butelka zostaje wciągnięta, ale szczur pozostaje w komorze operantowej przez około 20 min (3-4 próbki).

6. Procedury mikrodializy: Przygotowanie próbki z mikrodializy do analizy etanolu

1. Dwie próbki pobrane przed samopodawaniem roztworu etanolu przez zwierzęta oraz wszystkie próbki pobrane po tym procesie są analizowane pod kątem stężenia etanolu. Do szklanej fiolki o pojemności 2 ml pipetuje się alikwot 1 lub 2 μl z badanej próbki. Następnie fiolkę zamyka się szczelną przegrodą (9 mm Red Poly Screw Cap, PTFE/Sil Septa, Agilent Technologies). Objętość alikwotu do analizy etanolu (1 lub 2 μl) zależy od całkowitej objętości próbki oraz objętości próbki wymaganej do ewentualnych dodatkowych analiz.
2. Jeśli próbki mają zostać wykorzystane do późniejszej analizy neurochemicznej, należy je odpowiednio przechowywać po pobraniu alikwotu do oznaczania ilości etanolu.
3. Przykładowo, w naszym laboratorium próbki są analizowane pod kątem zawartości dopaminy. W tym celu podczas eksperymentu próbki umieszcza się na suchym lodzie, a po zakończeniu doświadczenia przechowuje w temperaturze -80 °C. Do analizy etanolu w próbkach pobieranych przez 5 min przy szybkości przepływu 2,0 μl/min z sond umieszczonych w jądrze półleżącym stosujemy alikwoty o objętości 2 μl. Pozwala to na pozostawienie co najmniej 7 μl do późniejszej analizy dopaminy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną.
4. W przypadku próbek pobranych z kory przedczołowej, w której stężenia dopaminy w przestrzeni zewnątrzkomórkowej są znacznie niższe, do analizy etanolu stosujemy alikwot 1 μl pobrany z próbki zbieranej przez 7 min przy szybkości przepływu 1,0 μl/min.

7. Procedury po mikrodializie

1. Po zakończeniu eksperymentu z mikrodializą, znieczul szczura i wyjmij sondę. Włóż obturator, jeśli zwierzę nie zostanie natychmiast poddane eutanazji. Pobierz mózg w ciągu trzech dni od zakończenia eksperymentu. W przeciwnym razie wizualizacja toru sondy może być niemożliwa.
2. Mózg należy usunąć zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dotyczącymi wykorzystania zwierząt. Stosujemy przedawkowanie pentobarbitalu sodowego (150 mg/kg, ip), a następnie perfuzję serca solą fizjologiczną, a potem formaliną w soli fizjologicznej. Zanurz mózg w roztworze formaliny z solą fizjologiczną na co najmniej 12 hr przed wykonaniem skrawków.
3. Wykonaj przekroje koronalne mózgu o grubości 100 μm. Pobarw skrawki fioletem krezylowym i sprawdź, czy sonda została umieszczona prawidłowo.^{5, 6}

8. Analiza stężenia etanolu w próbkach

1. Zebrane próbki, jak i wzorce zewnętrzne (etanol 0,3125 - 20 mM), analizuje się na chromatografie gazowym z systemem detekcji jonizacji płomieniowej. System ten składa się z chromatografu gazowego Varian CP 3,800 z detektorem jonizacji płomieniowej, autosamplera headspace Bruker (Varian) 8,400 podgrzewanego do 50 °C oraz kolumny kapilarnej HP Innowax (30 m x 0,53 mm x 1,0 μm grubości warstwy), z helem jako fazą ruchomą.
2. Chromatogramy są rejestrowane i analizowane za pomocą oprogramowania do chromatografii, takiego jak Varian Star Chromatography Workstation, które będzie tutaj szczegółowo omówione.
3. Aby przygotować system do analizy etanolu, należy podgrzać płytkę autosamplera za pomocą cyrkulacyjnej łaźni wodnej i otworzyć dwa dodatkowe zbiorniki z gazem (powietrze i wodór; hel jest stale włączony, aby chronić kolumnę woskową).
4. Należy odnotować ciśnienia w zbiornikach z gazem oraz liczbę próbek przeznaczonych do analizy, aby kontrolować liczbę użyć włókna i septa i wymienić je w odpowiednim momencie (włókno – 500 wtrysków; septum – 100 nakłuć).
5. Uruchom procedurę startową, która przygotowuje system do analizy próbek (parametry programu w Tabeli 2). Należy poczekać, aż system zgłosi status „Ready”.
6. Przeprowadź 20-minutowe „wypalanie” (burn), które przygotowuje włókno do analizy próbek poprzez poddanie go wysokiej temperaturze w celu desorpcji zanieczyszczeń zaabsorbowanych podczas spoczynku.
7. Wzorce przygotowuje się poprzez rozcieńczenie 238 μl 95% etanolu wodą do końcowej objętości 100 ml w kolbie miarowej w dygestorium. Pozwala to na otrzymanie roztworu etanolu o stężeniu 40 mM. Następnie stosujemy rozcieńczenia seryjne 1:1, aby przygotować wzorce o stężeniach 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM. Dla każdego stężenia wzorca należy użyć takiej samej objętości alikwotu, jaka będzie pobierana z próbek dializatu. Alikwot należy pipetować do szklanej fiolki o pojemności 2 ml, a następnie szczelnie zamknąć fiolkę septem.
8. Wszystkie próbki etanolu są podgrzewane w autosamplerze do momentu całkowitego odparowania alikwotu cieczy. Próbki podgrzewamy przez około 30 min.
9. Niniejsza sekcja opisuje oprogramowanie Star Workstation, którego używamy z naszym chromatografem gazowym. Można stosować inne oprogramowanie, jednak poniższy opis może być wtedy nieadekwatny.
10. Aby przeprowadzić analizę próbek, należy utworzyć listę próbek, zaznaczając, która próbka znajduje się w którym gnieździe autosamplera oraz ile razy próbka powinna zostać nakłuta. Należy upewnić się, że pliki danych są kierowane do wybranego folderu. Następnie należy wybrać odpowiednią metodę dla danych próbek i rozpocząć analizę. Stosujemy parametry pracy podane w Tabeli 2.
11. Nasz program analizy etanolu w dializacie zakłada absorpcję próbki przez 3 min oraz desorpcję do strumienia helu, który zasila kolumnę woskową, przez 1 min. Programy te można jednak modyfikować, aby dostosować je do specyficznych potrzeb.
12. Składniki próbki rozdzielają się w kolumnie woskowej, a następnie przechodzą przez detektor jonizacji płomieniowej, gdzie związki zawierające węgiel, takie jak etanol, ulegają spaleniu i uwalniają jony. Powoduje to zwiększenie przepływu elektronów z anody do katody detektora, co generuje prąd zamieniany na napięcie; w wyniku tego powstają chromatogramy, takie jak ten przedstawiony poniżej (Rysunek 1). Zmiana napięcia jest proporcjonalna do ilości węgla przechodzącego przez detektor w czasie.
13. Po zakończeniu analizy próbek przez system należy sprawdzić integrację każdego piku. W oprogramowaniu Star Workstation należy kliknąć niebieską ikonę piku na pasku narzędzi. Należy kliknąć kolor każdego piku i przeciągać strzałki, aby dostosować linię bazową. Każdy pik należy zreintegrować przed przejściem do następnej grupy pików. Jako oprogramowanie do analizy pików można wykorzystać dowolne ogólne oprogramowanie chromatograficzne.
14. W oprogramowaniu Star Workstation należy kliknąć ikonę raportu serii (batch report) na pasku narzędzi. Przeciągnij każdą próbkę z wybranego folderu do raportu serii, aby wydrukować raporty z próbek. Oprogramowanie raportujące można dostosować w większości powszechnie stosowanych systemów chromatograficznych.
15. Raporty można zaprogramować tak, aby wyświetlały wybrane informacje. Obecnie stosujemy wysokość piku, ale raporty można skonfigurować tak, aby wykorzystywały pole piku.
16. Aby wyłączyć system, należy uruchomić procedurę wyłączania (parametry podano w Tabeli 2), wyłączyć łaźnię wodną oraz zamknąć zbiorniki z wodorem i powietrzem, gdy temperatura pieca kolumny osiągnie 30 °C.

9. Dane dotyczące etanolu

1. Nanieś wysokość piku jako funkcję każdego znanego stężenia zewnętrznego standardu etanolu (Rysunek 2A). Wykorzystaj funkcję liniową wyznaczoną przez te punkty, aby obliczyć stężenie etanolu na podstawie wysokości piku uzyskanej z każdej próbki dializatu.
2. Wykreślając stężenie etanolu w dializacie w funkcji czasu, możemy zaobserwować wzorzec poziomów etanolu w analizowanym obszarze mózgu podczas sesji behawioralnej. Przykładowe dane, przedstawione poniżej (Rysunek 2B), obrazują stężenie etanolu w dializacie w czasie trwania sesji samopodania.

10. Konserwacja ogólna: Włókno należy wymieniać co 500 nakłuć, a septum co 100 nakłuć

Aby wymienić światłowód

1. Na klawiaturze chromatografu gazowego naciśnij Menu, wybierz 8,400 i zatwierdź klawiszem enter; wybierz opcję „change syringe” i zatwierdź klawiszem enter. Autosampler ustawi się w pozycji umożliwiającej wyjęcie włókna (SPME Fiber Assembly, 75 μm Carboxen-PDMS, Supelco Analytical, Bellefonte, PA).
2. Otwórz drzwiczki osłaniające włókno. Odkręć nakrętkę blokującą i przesuń zatrzask, aby umożliwić wyjęcie zespołu włókna. Wyjmij zespół włókna. Odkręć nakrętkę mocującą włókno w zespole, a następnie wykręć włókno.
3. Zastąp stare włókno nowym i ponownie złóż zespół włókna. Umieść zespół w autosamplerze, ponownie zapinając zatrzask i przykręcając zespół na miejscu. Po zakończeniu naciśnij „change done” na klawiaturze, a autosampler przygotuje się do pracy.

Aby wymienić septum

1. Najpierw odkręć nasadkę zakrywającą septum (Hi-Temp .450 Dia. Generic Conditioned Septa, Varian), a następnie usuń stare septum. Osadź nowe septum w złączce. Ponownie zakręć nasadkę i dokręć ją kluczem. Następnie użyj igły wstrzykiwującej, aby przebić septum, tak aby światłowód nie uległ uszkodzeniu podczas pierwszego przebicia septum.

11. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia przykładowe chromatogramy dla trzech stężeń wzorców etanolu oraz dla próbki dialyzatu szczura pobranej pod koniec sesji samopodawania etanolu. Piki etanolu powinny być stosunkowo symetryczne, mieć spójne czasy retencji oraz stosunek sygnału do szumu > 10. Niespełnienie tych kryteriów oznacza, że system wymaga konserwacji. Wysoka jakość chromatografii oraz prawidłowo przygotowane wzorce pozwalają na uzyskanie liniowej krzywej wzorcowej (R2 ≥ 0,99; Rysunek 2A), która służy do obliczenia stężenia etanolu w próbkach dialyzatu pobranych od zwierząt podczas sesji samopodawania etanolu (Rysunek 2B).

Rycina 1. Przykładowe chromatogramy. 1 μl standardu etanolu lub próbki dializatu wprowadzono do fiolki do chromatografu gazowego i przeanalizowano zgodnie z opisem w tekście. A) Nałożenie na siebie pików uzyskanych ze standardów etanolu o stężeniach 2,5, 5,0 i 10 mM. B) Pik uzyskany z próbki dializatu szczura, który podał sobie etanol.

Rycina 2. Wyniki graficzne z przykładowego eksperymentu przedstawionego na Rycini 1. A) Krzywa wzorcowa etanolu. B) Przebieg czasowy stężenia etanolu w dializacie podczas sesji samopodawania etanolu.

Sprzęt	Parametr	Ustawienia startowe	Ustawienia pomiarowe	Ustawienia spoczynkowe
8,400 Bruker (Varian) Autosampler
	Tryb wstrzykiwania	Spme	Spme	n/d
	Głębokość penetracji rozpuszczalnika	0%	20%	n/d
	Głębokość penetracji próbki	20%	20%	n/d
	Czas adsorpcji	0.01 min	3 min	n/d
	Czas desorpcji	19 min	1 min	n/d
	Źródło rozpuszczalnika w trybie czyszczenia	I	I	n/d
	Czas adsorpcji i desorpcji w trybie czyszczenia	0.01 min	0.01 min	n/d
	Kąpiel wodna (ogrzewa autosampler)*	50 °C	50 °C	Wył.
CP-3800 Varian Gas Chromatograph
Termostat injektora	Zasilanie termostatu	Wł.	Wł.	Wł.
	Temperatura termostatu	250 °C	220 °C	30 °C
Termostat kolumny	Czas stabilizacji	0.10 min	0.10 min	0.10 min
	Temperatura	65 °C	65 °C	30 °C
Kolumna	Przepływ fazy ruchomej	8.5 ml/min	8.5 ml/min	n/d
	Ciśnienie kolumny	~ 6 psi	~ 6 psi	≥ 0.1 psi
Detektor FID	Zasilanie termostatu	Wł.	Wł.	Wł.
	Temperatura	220 °C	220 °C	120 °C
	Elektronika	Wł.	Wł.	Wył.
	Stała czasowa	Szybka	Szybka	Szybka
	Zakres	11	11	11
	Autozero	Tak	Tak	Tak

Tabela 2. Parametry chromatografu gazowego z detekcyjnym systemem jonizacji płomieniowej. W tabeli przedstawiono parametry dla trzech programów wykorzystywanych do przygotowania (ustawienia startowe), analizy (ustawienia robocze) oraz konserwacji systemu podczas braku użytkowania (ustawienia spoczynkowe).

Dyskusja

Zastosowania i ograniczenia

Samopodawanie leków jest wykorzystywane u gryzoni do modelowania uzależnienia od substancji. Wiele nadużywanych substancji modelowanych w ten sposób może być podawanych dożylnie, co pozwala na dostarczenie leku bezpośrednio do przedziału centralnego. Umożliwia to ścisłe monitorowanie dawki podczas sesji samopodawania. Ponieważ etanol jest zazwyczaj podawany doustnie, monitorowanie jego poziomu jest znacznie trudniejsze ze względu na indywidualne różnice w wchłanianiu i metabolizmie. Dzięki zastosowaniu mikrodializy do pobierania próbek z interesującego regionu mózgu, jesteśmy w stanie nie tylko monitorować wzorzec docierania etanolu do tego obszaru, ale także jednocześnie śledzić zmiany w poziomie neurotransmiterów w tym samym regionie w czasie, podczas każdej fazy samopodawania.

Zmiany neurochemiczne i odpowiedzi indukowane lekami w mózgu są powiązane z nadużywaniem substancji i uzależnieniem; zatem możliwość jednoczesnego pomiaru stężeń substancji neurochemicznych i leków podczas konkretnych faz samopodawania stanowi niezwykle potężne i unikalne narzędzie. Kwestią, którą należy wziąć pod uwagę przy korelowaniu stężeń analitów w dializacie z zachowaniem, są właściwości fizyczne układu mikrodializacyjnego. W szczególności krytyczny jest czas transportu płynu z światła sondy do mikrodializy do probówki zbiorczej, przy czym krótszy czas jest korzystniejszy. W naszym laboratorium konstruujemy sondy w taki sposób, aby czas ten wynosił około 90 sec. W tych warunkach stwierdziliśmy wzrost poziomu dopaminy w jądrze półleżącym przy rozpoczęciu spożywania etanolu, który następnie spada w trakcie picia oraz w okresach po piciu, w miarę jak wzrasta stężenie etanolu w dializacie.^2,3,8,9 Eksperymenty te, w połączeniu z danymi z badań farmakologicznych, pozwoliły nam wyodrębnić ściśle farmakologiczne efekty etanolu oraz wpływ sygnałów środowiskowych związanych z samopodawaniem na zmiany stężeń neuroprzekaźników.

Należy zauważyć, że to konkretne zastosowanie połączonych technik behawioralnych i mikrodializy jest dostosowane do aktualnych zainteresowań badawczych naszego laboratorium. Zostało ono zaprojektowane w celu oceny wzorca czasowego docierania etanolu do mózgu w porównaniu do wzorca zmian neuroprzekaźników w tym samym obszarze, co pozwala nam powiązać te pomiary z synchronicznymi zachowaniami samopodawania. Uzyskane stężenia etanolu w dialyzacie nie są korygowane o odzysk sondy in vivo i stanowią jedynie ułamek stężenia etanolu w tkance mózgowej. Jeśli wymagana jest ilościowa mikrodializa etanolu, frakcję ekstrakcji etanolu dyfundującego z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do sondy należy wyznaczyć doświadczalnie. Metody i dalsza dyskusja znajdują się w poprzednich publikacjach naszego laboratorium.^10,11,12

Choć niniejszy protokół ilustruje zastosowanie chromatografii gazowej wraz z mikroekstrakcją w fazie stałej etanolu z przestrzeni nadpróbkowej próbek z mikrodializy, do analizy zawartości etanolu w próbkach z mikrodializy można zastosować inne metody. Metody alternatywne mogą jednak wiązać się z pewnymi wadami. Na przykład mniej czułe metody analityczne mogą wymagać większej objętości próbki, co wymusza wydłużenie czasu pobierania poza przedział 5-7 min przedstawiony w niniejszym opracowaniu. Opisany tutaj typ systemu wykorzystuje mikroekstrakcję w fazie stałej, która zagęszcza etanol w fazie par w zamkniętej fiolce z próbką poprzez absorpcję na włóknie umieszczonym w przestrzeni nadpróbkowej fiolki. Poprawia to granicę wykrywalności w porównaniu z bezpośrednim pobieraniem z przestrzeni nadpróbkowej, w którym zazwyczaj wstrzykuje się 50-100 μl par. Inną istotną zaletą metody analizy przestrzeni nadpróbkowej jest fakt, że próbka wstrzykiwana do analizy jest niezwykle czysta i wolna od soli. Można również zastosować bezpośredni wtrysk ciekłej próbki z mikrodializy, co pozwala na uzyskanie wyższej czułości, jednak będzie to wymagać częstszych przestojów urządzenia ze względu na regularną konserwację niezbędną do usunięcia wstrzykniętych soli.

Rozwiązywanie problemów i inne uwagi

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu zarezerwuj wystarczająco dużo czasu, aby sprawdzić, czy zestawy do mikrodializy funkcjonują prawidłowo, oraz aby rozwiązać ewentualne problemy. Sugerujemy przygotowanie dodatkowego zestawu, perfundowanego ACSF, który można będzie szybko zamienić z niesprawnym urządzeniem w celu zaoszczędzenia czasu, ponieważ większość sesji operacyjnych odbywa się zazwyczaj o określonej godzinie każdego dnia.
2. Należy upewnić się, że sondy do mikrodializy są wprowadzane w czasie około 5 min, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki spowodowane jej rozrywaniem podczas penetracji mózgu przez sondę.
3. Przy przenoszeniu szczura do komory operacyjnej pomoc drugiej osoby jest przydatna, aby linia transferowa (część zestawu do mikrodializy) nie zaplątała się, a program operacyjny mógł zostać uruchomiony punktualnie.
4. Należy zapewnić odpowiednią ilość czasu na osiągnięcie właściwej temperatury w łaźni wodnej autosamplera. Nasz system zazwyczaj wymaga dwóch hr, aby osiągnąć 50 °C. Należy również upewnić się, że próbki są całkowicie odparowane przed ich analizą. Zazwyczaj potwierdzamy to wizualnie przed rozpoczęciem analizy próbek.
5. Należy przestrzegać standardowych zasad dobrej praktyki chemii analitycznej. Obejmują one między innymi walidację personelu, sprzętu i procedur. W skrócie stosujemy następujące wytyczne: poszczególni użytkownicy powinni wykazać zdolność do generowania powtarzalnych wartości wysokości piku dla stężeń wzorców oraz liniowych krzywych wzorcowych (R2 ≥ 0.99) w ciągu wielu dni. Aby zweryfikować prawidłowe działanie systemu GC-FID, wzorce powinny być zawsze analizowane przed wstrzyknięciem jakichkolwiek próbek dialyzatu. Wygenerowana krzywa wzorcowa powinna mieć R2 ≥ 0.99.
6. Większość używanego przez nas sprzętu została zakupiona w Varian, Inc., która w 2010 r. została przejęta przez Agilent Technologies. W tym czasie Bruker Scientific Instruments przejął działalność Varian w zakresie laboratoryjnych instrumentów do chromatografii gazowej. W przypadku przyszłych zakupów należy skonsultować się z którąkolwiek z tych firm.
7. Niniejszy protokół przedstawia zachowanie operacyjne u szczurów, jednak widz powinien mieć świadomość, że w przypadku mniejszego modelu mysiego prawdopodobne jest wystąpienie większych zaburzeń zachowania. Innym aspektem, na który należy zwrócić uwagę, jest fakt, że umieszczenie sondy do mikrodializy w obszarach mózgu innych niż przyśrodkowa kora przedczołowa lub jądro półleżące może zaburzyć zachowanie operacyjne w większym stopniu niż pokazano tutaj. Ważne jest dokładne zbadanie licznych parametrów behawioralnych, aby ustalić, czy uszkodzenia spowodowane umieszczeniem sondy wywołują poważne zmiany w zachowaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
95% etanol	AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY	E190, 111000190
Sacharoza ultra-czysta	MP Biomedicals, LLC, Solon, OH	821721
Hel o ultra-wysokiej czystości	Air Gas	HE UHP300
Powietrze	Air Gas	AIZ300
Wodór	Air Gas	AIZ300
Fiolki do GC 2 ml	Agilent Technologies	#8010-0015
Nakrętki do fiolek GC z septami PTFE/silikonowymi	Agilent Technologies	#8010-0084
Tabela 1. Specyficzne odczynniki