Mikrodializa etanolu podczas samodzielnego podawania etanolu i oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Podsumowanie

Opisano metodę określania przebiegu czasowego stężenia etanolu w mózgach szczurów podczas samodzielnego podawania etanolu przez agenta. Chromatografia gazowa z detekcją płomieniowo-jonizacyjną służy do ilościowego oznaczania etanolu w próbkach dializatu, ponieważ ma czułość wymaganą dla wytwarzanych małych objętości.

Streszczenie

Metody samodzielnego podawania metodą instrumentalną są powszechnie używane do badania behawioralnych i farmakologicznych efektów wielu nadużywanych leków, w tym etanolu. Jednak etanol jest zazwyczaj podawany samodzielnie doustnie, a nie dożylnie, jak wiele innych narkotyków. Farmakokinetyka leków podawanych doustnie jest bardziej złożona niż leków podawanych dożylnie. Ponieważ zrozumienie związku między farmakologicznymi i behawioralnymi skutkami etanolu wymaga wiedzy na temat przebiegu czasowego, w którym etanol dociera do mózgu w trakcie i po wypiciu, stosujemy mikrodializę in vivo i chromatografię gazową z detekcją jonizacji płomieniowej do monitorowania stężeń etanolu w dializacie mózgu w czasie.

Połączone eksperymenty mikrodializowo-behawioralne obejmują użycie kilku technik. W tym artykule chirurgia stereotaktyczna, trening behawioralny i mikrodializa, które można dostosować do testowania wielu hipotez skoncentrowanych na samodzielnym podawaniu i neurochemii, są uwzględnione tylko w celu zilustrowania, w jaki sposób odnoszą się one do kolejnych faz pobierania próbek i analizy etanolu dializatu. Szczegółowo opisano analizę stężenia etanolu w dializacie za pomocą chromatografii gazowej z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, która jest specyficzna dla badań etanolu. Dane uzyskane za pomocą tych metod ujawniają wzorzec docierania etanolu do mózgu podczas procedury samodzielnego podawania, a w połączeniu z analizą neurochemiczną tych samych próbek dializatu pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących farmakologicznych i behawioralnych skutków etanolu.

Protokół

1. Chirurgia stereotaktyczna

1. Wszystkie procedury są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
2. Za pomocą aparatu stereotaktycznego, dobrze traktowanym szczurom Long-Evans, znieczulonym izofluranem, wszczepia się kaniulę o rozmiarze 21 (w celu późniejszego wprowadzenia sondy do mikrodializy) (Plastics One, Roanoke, VA) powyżej obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, a śruba mocująca jest wbudowana w stopień głowy (używany do podtrzymywania sprzętu do mikrodializy).
3. Uważnie monitoruj szczury w trakcie i po zabiegu. Upewnij się, że wszystkie zwierzęta otrzymują co najmniej tygodniową opiekę pooperacyjną i rekonwalescencję oraz są zdrowe przed rozpoczęciem poniższych procedur. Dostępny jest film JoVE przedstawiający metodę chirurgii stereotaktycznej. ¹

2. Trening operacyjny

1. Po tygodniu rekonwalescencji pooperacyjnej zwierzęta są szkolone w zakresie wyciskania dźwigni do 10% roztworu sacharozy w komorze operacyjnej Med Associates (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) wyposażonej w lizometr, wysuwaną dźwignię i rurkę do łykania (jak opisano wcześniej w Howard i in., 2009). ² Oprogramowanie firmy MedAssociates jest używane do projektowania wszystkich programów operacyjnych (MedAssociates, Inc., Vermont, USA).
2. Po przeszkoleniu w reagowaniu na sacharozę, szczury powinny przejść odpowiedni harmonogram treningowy, podczas którego etanol jest stopniowo dodawany do roztworu przez wiele sesji picia.
3. Na przykład nasze laboratorium stosuje obecnie 8-dniowy harmonogram treningowy, w którym etanol jest przenikany do roztworu, czego kulminacją jest roztwór do picia 10% etanolu / 10% sacharozy. Zwierzęta kontrolne otrzymują tylko 10% sacharozy lub nie otrzymują roztworu do picia. Konkretny rodzaj harmonogramu operacyjnego, który ma być zastosowany, może się znacznie różnić, ale ogólne procedury opisane poniżej dla pobierania próbek mikrodializy mogą być nadal przeprowadzane. ³

3. Procedury przed mikrodializą: Tethering

1. W noc poprzedzającą przedostatnią sesję treningową (w naszym przykładzie jest to siódma sesja treningowa) zwierzęta są przyzwyczajane do sprężyny mocującej, która mocuje się do mocującej na ich głowie. Sprężyna mocuje się do ramienia dźwigni obrotowej mikrodializy i przeciwwagi, które jest zawieszone obok klatki za pomocą stojaka na pierścień i zacisków, dzięki czemu zwierzę może swobodnie poruszać się w klatce. Zwierzęta na uwięzi spędzają noc w pomieszczeniu operacyjnym, w swojej domowej klatce z jedzeniem i wodą ad libitum, aby przyzwyczaić je do uwięzi.
2. Następnego dnia szczur kończy swój program operacyjny z uwięzią na miejscu, aby przyzwyczaić zwierzę do uczucia uwięzi podczas wykonywania zadań behawioralnych. Zamontuj urządzenie do wiązania na ścianie komory operacyjnej w pobliżu góry, aby umożliwić zawieszenie linki i obróć się powyżej środka dachu komory operacyjnej. Wszystko to umieszczone jest w komorze tłumiącej dźwięk. Po sesji należy umieścić szczura z powrotem w jego klatce domowej w pomieszczeniu operacyjnym, aby poczekać na wprowadzenie sondy do mikrodializy.

4. Procedury przed mikrodializą: Sonda do mikrodializy jest wkładana dzień przed eksperymentem mikrodializy, po tym jak szczur zakończył trening behawioralny na dany dzień

1. Dzień przed eksperymentem z mikrodializą, po tym, jak szczur zakończy sesję operacyjną na uwięzi, znieczulij szczura izofluranem i usuń zasłonę z kaniuli prowadzącej. Powoli (ponad ~ 5 min) wprowadzić sondę do mikrodializy, wypełnioną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), przez kaniulę prowadzącą czaszkę do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Korzystamy ze skonstruowanych laboratoryjnie sond i procedur mikrodializy wzorowanych na Doyon i wsp., 2003 oraz Pettit i Justice, 1991. ^{3, 4}
2. Użyj wcześniej omówionego aparatu do uwięzi, aby zawiesić przewody wlotowe i wylotowe sondy nad zwierzęciem.
3. Zmniejsz natężenie przepływu sondy do 0,2 μl/min. Po raz kolejny szczur spędza noc w pomieszczeniu operacyjnym.

5. Procedury mikrodializy: Pobieranie próbek podczas sesji samodzielnego podawania z oddzielonymi fazami apetytywnymi i konsumpcyjnymi

1. Co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu podkręć sondę do roboczego natężenia przepływu. Używamy 1,0 lub 2,0 μl/min w zależności od obszaru mózgu. Sprawdź, czy natężenie przepływu sondy jest stałe i co najmniej 90% ustawionego natężenia przepływu za pomocą strzykawki Hamilton do pomiaru objętości w czasie.
2. Próbki dializy (5 lub 7 minut) pobiera się przed, w trakcie i po sesji operacyjnej. Interwał pobierania próbek zależy od obszaru mózgu, analizowanego neuroprzekaźnika, stężenia dializatu analitu i czułości sprzętu chemii analitycznej, który ma być użyty do analizy. Fazy behawioralne są następujące:
   1. Wartość wyjściowa: Na początku doświadczenia należy pobrać próbki do dializy w klatce domowej zwierzęcia (4 próbki).
   2. Przeniesienie: Po pobraniu próbek z klatki domowej należy przenieść szczura do komory operacyjnej. Przenoszenie szczura na uwięzi wymaga szczególnej ostrożności, aby upewnić się, że przewód przesyłowy płynu do mikrodializy nie zostanie splątany, a szczur pozostanie spokojny. Natychmiast po transferze aktywuj program operacyjny podczas przechodzenia z próbki bazowej/transferowej na pierwszą próbkę oczekującą.
   3. Czekać: Kontynuuj zbieranie próbek, gdy szczur czeka, aż dźwignia wysunie się do komory (3-4 próbki w zależności od obszaru mózgu).
   4. Pić: Po przedstawieniu dźwigni i naciśnięciu butelka z roztworem do picia (10% sacharozy/10% etanolu lub 10% sacharozy) jest udostępniana szczurowi na około 20 minut (3-4 próbki).
   5. Po wypiciu: Po okresie picia butelka chowa się, ale szczur pozostaje w komorze operacyjnej przez około 20 minut (3-4 próbki).

6. Procedury mikrodializy: przygotowanie próbki mikrodializy do analizy etanolu

1. Dwie próbki przed samodzielnym podaniem roztworu etanolu przez zwierzęta i wszystkie późniejsze próbki są oceniane pod kątem stężenia etanolu. Odpipetować 1 lub 2 μl podwielokrotności z badanej próbki do szklanej fiolki o pojemności 2 ml. Następnie uszczelnić fiolkę hermetyczną przegrodą (9 mm czerwona nakrętka poliamidowa, PTFE/Sil Septa, Agilent Technologies). Objętość podwielokrotności podwielokrotności do analizy etanolu (1 lub 2 μl) zależy od całkowitej objętości próbki oraz objętości próbki wymaganej do wszelkich dodatkowych analiz.
2. Jeżeli próbki zostaną wykorzystane do późniejszej analizy neurochemicznej, należy je odpowiednio przechowywać po odpipetowaniu podwielokrotności w celu ilościowego oznaczania etanolu.
3. Na przykład nasze laboratorium analizuje próbki pod kątem dopaminy. W tym celu należy umieścić próbki na suchym lodzie podczas eksperymentu, a następnie przechowywać próbki w temperaturze -80 °C po zakończeniu eksperymentu. Do analizy etanolu używamy podwielokrotności 2 μl 5-minutowej próbki pobranej przy natężeniu przepływu 2,0 μl/min dla sond umieszczonych w jądrze półleżącym. Pozwala to na pozostawienie co najmniej 7 μl dopaminy do późniejszej analizy dopaminy za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną.
4. W przypadku próbek pobranych z kory przedczołowej, która ma znacznie niższe zewnątrzkomórkowe stężenia dopaminy, używamy podwielokrotności 1 μl do analizy etanolu pobranej z 7-minutowej próbki przy natężeniu przepływu 1,0 μl/min.

7. Procedury po mikrodializie

1. Po zakończeniu eksperymentu mikrodializy znieczulij szczura i wyjmij sondę. Wymień zasłonę, jeśli zwierzę nie zostanie natychmiast poddane eutanazji. Zbierz mózg w ciągu trzech dni od eksperymentu. W przeciwnym razie wizualizacja drogi sondy może nie być możliwa.
2. Mózg powinien zostać usunięty zgodnie z zatwierdzonymi protokołami stosowania na zwierzętach. Stosujemy przedawkowanie pentobarbitalu sodu (150 mg/kg, ip), następnie perfuzję serca solą fizjologiczną, a następnie formaliną w soli fizjologicznej. Zanurz mózg w roztworze formaliny i soli fizjologicznej na co najmniej 12 godzin przed cięciem.
3. Koronnie pokrój mózg na plastry o grubości 100 μm. Zabarwić plastry fioletem krezylo i sprawdzić, czy sonda jest prawidłowo umieszczona. ^{5, 6}

8. Analiza próbek pod kątem stężenia etanolu

1. Pobrane próbki, jak również wzorce zewnętrzne (0,3125 - 20 mM etanolu) są uruchamiane na naszym chromatografie gazowym z systemem detekcji płomieniowo-jonizacyjnej. System ten składa się z chromatografu gazowego Varian CP 3 800 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym, automatycznego samplera Bruker (Varian) o natężeniu 8 400 stopni Celsjusza podgrzanego do temperatury 50 °C oraz kolumny kapilarnej HP Innowax (30 m x 0,53 mm x 1,0 μm o grubości folii), z helem jako fazą ruchomą.
2. Chromatogramy są rejestrowane i analizowane za pomocą oprogramowania chromatograficznego, takiego jak oprogramowanie Varian Star Chromatography Workstation, które zostanie tutaj szczegółowo omówione.
3. Aby przygotować system do analizy etanolu, należy podgrzać płytkę automatycznego podajnika próbek za pomocą recyrkulacyjnej łaźni wodnej i otworzyć dwa dodatkowe zbiorniki gazu (powietrze i wodór; hel zawsze pozostawia się włączony, aby zachować kolumnę woskową).
4. Zapisz ciśnienie w zbiorniku gazu, a także liczbę próbek, które zamierzasz przeprowadzić, aby móc policzyć, ile razy włókno i przegroda zostały użyte, aby można je było zmienić w razie potrzeby (wstrzyknięcia włókna-500; przegroda-100 nakłuć).
5. Zainicjować metodę rozruchu, która przygotowuje system do uruchomienia próbek (parametry programu w tabeli 2). Poczekaj, aż system zgłosi, że jest "gotowy".
6. Zainicjuj 20-minutowe "spalanie", które przygotowuje włókno do analizy próbki, poddając je działaniu wysokiej temperatury w celu desorpcji wszelkich zanieczyszczeń, które wchłonęło w spoczynku.
7. Wzorce sporządza się przez rozcieńczenie 238 μl 95% etanolu z wodą do końcowej objętości 100 ml za pomocą kolby miarowej w dygestoriach chemicznych. W ten sposób powstaje roztwór etanolu o stężeniu 40 mM. Używamy rozcieńczenia szeregowego 1:1 do tworzenia wzorców 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM. Dla każdego stężenia wzorca należy użyć tej samej podwielokrotności objętościowej, która zostanie pobrana z próbek dializowanych. Odpipetować podwielokrotność porcji do szklanej fiolki o pojemności 2 ml, a następnie zamknąć fiolkę hermetyczną przegrodą.
8. Wszystkie próbki etanolu są podgrzewane w automatycznym podajniku próbek do momentu odparowania całej ciekłej porcji. Podgrzewamy nasze próbki przez około 30 minut.
9. W tej sekcji opisano oprogramowanie Star Workstation, którego używamy z naszym chromatografem gazowym. Można użyć innego oprogramowania, ale poniższy opis może nie mieć zastosowania.
10. Aby uruchomić próbki, należy utworzyć listę próbek, odnotowując, która próbka znajduje się w którym gnieździe automatycznego podajnika próbek i ile razy próbka powinna zostać nakłuta. Pamiętaj, aby przekierować pliki danych do wybranego folderu. Następnie wybierz metodę wyboru dla swoich próbek i rozpocznij przebieg. Używamy parametrów biegowych zanotowanych w tabeli 2.
11. Nasz program dializatu etanolowego absorbuje próbkę przez 3 minuty i desorbuje się do strumienia helu, który jest zasilany do kolumny woskowej przez 1 minutę. Jednak programy mogą być pisane tak, aby dostosować się do konkretnych potrzeb.
12. Składniki próbki oddzielają się w kolumnie woskowej, a następnie przechodzą przez detektor płomieniowo-jonizacyjny, w którym związki zawierające węgiel, takie jak etanol, spalają się i uwalniają jony. Powoduje to zwiększony przepływ elektronów od anody detektora do katody, tworząc prąd, który jest przekształcany na napięcie i rejestrowany, w wyniku czego powstają chromatogramy takie jak ten pokazany poniżej (rysunek 1). Zmiana napięcia jest proporcjonalna do ilości węgla przepływającego przez detektor w czasie.7
13. Po zakończeniu uruchamiania próbek przez system należy sprawdzić integrację każdego piku. W przypadku oprogramowania Star Workstation kliknij niebieską ikonę szczytu na pasku narzędzi. Kliknij kolor każdego szczytu i przeciągnij strzałki, aby dostosować linię bazową. Ponownie zintegruj każdy szczyt przed przejściem do następnej grupy szczytów. Oprogramowaniem do analizy pików może być dowolne ogólne oprogramowanie chromatograficzne.
14. W przypadku oprogramowania Star Workstation kliknij ikonę raportu wsadowego na pasku narzędzi. Przeciągnij każdą próbkę z określonego folderu do raportu wsadowego, aby wydrukować przykładowe raporty. Oprogramowanie do raportowania można dostosować do większości popularnych systemów oprogramowania chromatograficznego.
15. Raporty można zaprogramować tak, aby pokazywały wybrane przez siebie informacje. Obecnie używamy wysokości szczytu, ale raporty można również zaprogramować tak, aby korzystały z obszaru szczytu.
16. W celu wyłączenia systemu należy rozpocząć metodę wyłączania (parametry podane w tabeli 2), wyłączyć łaźnię wodną i zamknąć zbiorniki wodoru i powietrza, gdy temperatura pieca kolumnowego osiągnie 30 °C.

9. Dane dotyczące etanolu

1. Wykreślić wysokość piku jako funkcję każdego znanego stężenia etanolu we wzorcu zewnętrznym (rysunek 2A). Wykorzystać funkcję liniową określoną przez te punkty, aby obliczyć stężenie etanolu na podstawie wysokości piku podanej przez każdą próbkę dializatu.
2. Tworząc wykres stężenia etanolu w dialiacie w czasie, możemy zobaczyć wzorzec poziomów etanolu w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania podczas naszej sesji behawioralnej. Przykładowe dane, pokazane poniżej (Rysunek 2B), są przedstawione jako stężenie etanolu w dializacie w czasie podczas sesji samodzielnego podawania.

10. Ogólna konserwacja: Włókno powinno być wymieniane co 500 nakłuć, a przegroda co 100 nakłuć

Aby zmienić światłowód

1. Na klawiaturze chromatografu gazowego nacisnąć Menu, wybrać 8,400, nacisnąć enter; wybrać zmień strzykawkę, nacisnąć enter. Automatyczny podajnik próbek ustawi się tak, aby umożliwić usunięcie włókna (SPME Fiber Assembly, 75 μm Carboxen-PDMS, Supelco Analytical, Bellefonte, PA).
2. Otwórz drzwi zakrywające światłowód. Odkręć nakrętkę zabezpieczającą i przesuń zatrzask, aby umożliwić wyjęcie zespołu światłowodu. Wyjmij zespół światłowodu. Odkręć nakrętkę przytrzymującą włókno w zespole, a następnie odkręć włókno.
3. Wymień stare włókno na nowe i ponownie zmontuj zespół światłowodu. Wymień zestaw w automatycznym podajniku próbników, ponownie zatrzaskując i przykręcając zespół na miejsce. Po zakończeniu naciśnij przycisk "zmień gotowe" na klawiaturze, a autosampler będzie gotowy do użycia.

Aby zmienić przegrodę

1. Najpierw odkręć nakrętkę zakrywającą przegrodę (Hi-Temp .450 Dia. Generic Conditioned Septa, Varian), a następnie usuń starą przegrodę. Umieść nową przegrodę w złączce. Ponownie odkręć nakrętkę i dokręć ją kluczem. Następnie za pomocą igły iniekcyjnej należy przebić przegrodę, aby włókno nie pękło przy pierwszym nakłuciu przegrody.

11. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 pokazuje przykładowe chromatogramy dla trzech stężeń wzorców etanolu oraz dla próbki dializatu szczura pobranej pod koniec sesji samodzielnego podawania etanolu. Piki etanolu powinny być względnie symetryczne, mieć stałe czasy retencji, a stosunek sygnału do szumu > 10. Niespełnienie tych kryteriów oznacza, że system wymaga konserwacji. Wysokiej jakości chromatografia i prawidłowo przygotowane wzorce dają liniową krzywą wzorcową (R2 ≥ 0,99; Rysunek 2A) , który służy do obliczania stężenia etanolu w próbkach dializatu pobranych od zwierząt samodzielnie podając etanol w trakcie ich sesji samodzielnego podawania (ryc. 2B).

Rysunek 1. Przykładowe chromatogramy. Jeden μl próbki wzorca etanolu lub dializatu załadowano do fiolki z chromatografem gazowym i przeanalizowano zgodnie z opisem w tekście. A) Nakładanie pików generowanych z wzorców etanolu 2,5, 5,0 i 10 mM. B) Pik wygenerowany z próbki dializatu od szczura, który samodzielnie podał etanol.

Rysunek 2. Wyniki graficzne z przykładowego eksperymentu pokazanego na rysunku 1. A) Krzywa wzorcowa etanolu. B) Przebieg czasowy stężenia etanolu w dializacie podczas sesji samodzielnego podawania etanolu.

sprzęt parametr Ustawienia uruchamiania Ustawienie biegowe Ustawienie spoczynkowe 8,400 Automatyczny podajnik próbek Bruker (Varian)   Tryb wtrysku Spme (Grzyb Śród Spme (Grzyb Śród N/a   Głębokość penetracji rozpuszczalnika 0% 20% N/a   Głębokość penetracji próbki 20% 20% N/a   Czas wchłaniania 0,01 min Czas trwania: 3 min N/a   Czas desorpcji Czas trwania: 19 min 1 min N/a   Źródło rozpuszczalnika w trybie czystym ja ja N/a   Czas adsorpcji i desorpcji w trybie czystym 0,01 min 0,01 min N/a   Łaźnia wodna (podgrzewa automatyczny podajnik próbek)* 50 °C 50 °C od CP-3800 Chromatograf gazowy Varian Piekarnik z wtryskiwaczem Moc piekarnika na na na   Temperatura piekarnika 250 °C 220 °C 30 °C Piec kolumnowy Czas stabilizacji 0,10 min 0,10 min 0,10 min   temperatura 65 °C 65 °C 30 °C kolumna Natężenie przepływu fazy ruchomej 8,5 ml/min 8,5 ml/min N/a   Ciśnienie w kolumnie ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi Detektor FID Moc piekarnika na na na   temperatura 220 °C 220 °C 120 °C   elektronika na na od   Stała czasowa szybki szybki szybki   zakres 11 11 11   Automatyczne zerowanie tak tak tak

Tabela 2. Chromatograf gazowy z parametrami systemu detekcji płomieniowo-jonizacyjnej. W poniższej tabeli przedstawiono parametry trzech programów używanych do przygotowania (ustawienia uruchamiania), uruchomienia (ustawienia uruchomienia) i konserwacji systemu, gdy nie jest używany (ustawienia spoczynku).

Dyskusja

Zastosowania i ograniczenia

Samodzielne podawanie leków jest stosowane u gryzoni do modelowania uzależnienia od narkotyków. Wiele leków nadużywania, które są modelowane w ten sposób, może być podawanych dożylnie, w których lek jest dostarczany bezpośrednio do centralnego komory. Pozwala to na ścisłe monitorowanie dawki podczas sesji samodzielnego podawania. Ponieważ etanol jest zwykle podawany doustnie samodzielnie, znacznie trudniej jest monitorować poziom leku ze względu na indywidualne różnice w wchłanianiu i metabolizmie. Stosując mikrodializę do pobierania próbek z obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, jesteśmy w stanie nie tylko monitorować wzorzec docierania etanolu do tego obszaru, ale jesteśmy również w stanie jednocześnie monitorować zmiany neuroprzekaźników w tym samym regionie w czasie podczas każdej fazy samodzielnego podawania.

Zmiany neurochemiczne i reakcje wywołane lekami w mózgu są związane z nadużywaniem narkotyków i uzależnieniem; W związku z tym możliwość jednoczesnego pomiaru stężeń neurochemicznych i leków podczas określonych faz samodzielnego podawania stanowi bardzo potężne i unikalne narzędzie. Jedną z kwestii, o której należy pamiętać przy korelacji stężeń analitów w dializacie z zachowaniem, są fizyczne cechy hydrauliki do mikrodializy. W szczególności czas potrzebny na przeniesienie płynu ze światła sondy do mikrodializy do rurki zbiorczej ma kluczowe znaczenie, a krótsze czasy są lepsze. W naszym laboratorium konstruujemy sondy tak, aby czas wynosił około 90 sekund. Korzystając z tych warunków, stwierdziliśmy, że występuje wzrost dopaminy półleżącej na początku spożycia etanolu, który zmniejsza się w trakcie picia i po wypiciu wraz ze wzrostem stężenia etanolu w dializacie. ^2,3,8,9 Eksperymenty te, w połączeniu z danymi z badań farmakologicznych, pozwoliły nam przeanalizować ściśle farmakologiczne efekty etanolu związane z samodzielnym podawaniem wskazówek środowiskowych na zmiany stężeń neuroprzekaźników.

Należy zauważyć, że to szczególne zastosowanie połączonych technik mikrodializy behawioralnej jest zgodne z aktualnymi zainteresowaniami badawczymi naszego laboratorium. Ma on na celu ocenę czasowego wzorca docierania etanolu do mózgu w porównaniu ze wzorcem zmian neuroprzekaźników w tym samym regionie, dzięki czemu możemy odnieść te środki do synchronicznych zachowań związanych z samodzielnym podawaniem. Uzyskane stężenia etanolu w dializacie nie są korygowane pod kątem odzyskiwania sondy in vivo i stanowią jedynie ułamek stężenia etanolu w tkance mózgu. Jeżeli wymagana jest ilościowa mikrodializa etanolu, należy eksperymentalnie określić frakcję ekstrakcyjną etanolu, która dyfunduje z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do sondy. Zapoznaj się z poprzednimi publikacjami z naszego laboratorium, aby zapoznać się z metodami i dalszą dyskusją. ^10,11,12

Chociaż protokół ten ilustruje zastosowanie chromatografii gazowej wraz z mikroekstrakcją etanolu w fazie stałej z przestrzeni nad próbkami do mikrodializy, można zastosować inne metody analizy zawartości etanolu w próbce do mikrodializy. Jednak alternatywne metody mogą mieć pewne wady. Na przykład mniej czułe metody analityczne mogą wymagać większej objętości próbki, co wymaga czasu pobierania próbek dłuższego niż 5-7 minut przedstawionych tutaj. Omawiany tutaj typ systemu wykorzystuje mikroekstrakcję do fazy stałej, która koncentruje etanol w fazie gazowej w szczelnie zamkniętej fiolce z próbką, umożliwiając absorpcję przez włókno umieszczone w przestrzeni nad fiolką. Poprawia to granicę wykrywalności w porównaniu z bezpośrednim próbkowaniem w przestrzeni nad głową, które zwykle pozwala na wstrzyknięcie 50-100 μl pary. Kolejną ważną zaletą metody headspace jest to, że próbka wstrzykiwana do analizy jest wyjątkowo czysta i wolna od soli. Bezpośrednie wstrzykiwanie płynnej próbki mikrodializy może być również stosowane z większą czułością, ale będzie to wymagało dłuższego czasu przestoju urządzenia ze względu na regularną konserwację wymaganą do oczyszczenia wstrzykniętych soli.

Rozwiązywanie problemów i inne uwagi

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu daj sobie dużo czasu na sprawdzenie, czy zestawy do mikrodializy działają prawidłowo i rozwiązanie wszelkich problemów. Sugerujemy, abyś miał dodatkową konfigurację, wypełnioną ACSF, gotową do wymiany przy nieprawidłowo działającej konfiguracji, aby zaoszczędzić czas, ponieważ większość sesji operantowych ma tendencję do odbywania się o określonej porze każdego dnia.
2. Upewnij się, że sondy do mikrodializy są wkładane przez okres około 5 minut, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek spowodowane ścinaniem tkanki, gdy sonda wnika do mózgu.
3. Podczas przenoszenia szczura do komory operacyjnej pomocna jest pomoc drugiej osoby, aby linia transferowa (część zestawu do mikrodializy) nie uległa splątaniu i aby program operacyjny mógł zostać zainicjowany na czas.
4. Upewnij się, że masz wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie odpowiedniej temperatury w kąpieli wodnej automatycznego podajnika próbek. Nasz system zazwyczaj potrzebuje dwóch godzin, aby osiągnąć temperaturę 50 °C. Upewnij się również, że próbki są w pełni odparowane przed analizą próbek. Zazwyczaj wizualnie potwierdzamy, że miało to miejsce przed rozpoczęciem analizy próbki.
5. Należy przestrzegać standardowych dobrych praktyk chemii analitycznej. Obejmują one między innymi walidację osób, sprzętu i procedur. W skrócie stosujemy następujące wytyczne: Indywidualni użytkownicy powinni wykazać się zdolnością do generowania powtarzalnych wartości wysokości pików dla standardowych stężeń i liniowych krzywych wzorcowych (R2 ≥ 0,99) przez wiele dni. Aby sprawdzić, czy system GC-FID działa prawidłowo, wzorce powinny być zawsze analizowane przed wstrzyknięciem jakichkolwiek próbek dializatu. Wygenerowana krzywa standardowa powinna mieć R2 ≥ 0,99.
6. Większość używanego przez nas sprzętu została zakupiona za pośrednictwem firmy Varian, Inc., która została przejęta przez Agilent Technologies w 2010 roku. W tym czasie firma Bruker Scientific Instruments przejęła firmę Varian zajmującą się laboratoryjnymi instrumentami do chromatografii gazowej. W przypadku przyszłych zakupów skonsultuj się z jedną z firm.
7. Obecny protokół pokazuje operacyjne zachowanie szczurów, ale widz powinien być świadomy, że w przypadku mniejszego modelu myszy prawdopodobnie wystąpi więcej zakłóceń w zachowaniu. Inną kwestią, o której należy pamiętać, jest to, że umieszczenie sondy do mikrodializy w obszarach mózgu innych niż przyśrodkowa kora przedczołowa lub jądro półleżące może zakłócić zachowanie instrumentantów w większym stopniu niż pokazano tutaj. Ważne jest, aby dokładnie zbadać wiele parametrów behawioralnych, aby określić, czy uszkodzenia spowodowane umieszczeniem sondy powodują poważne zmiany w zachowaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
95% etanol	AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY	E190, 111000190
Ultra-czysta sacharoza	MP Biomedicals, LLC, Solon, OH	821721
wysokiej czystości	Hel Air Gas	HE UHP300
	Gas	AIZ300
Wodór	Air Gas	AIZ300
GC 2 ml Fiolki	Agilent Technologies	#8010-0015
Nakrętki na fiolki GC z przegrodą PTFE/silikon	Agilent Technologies	#8010-0084
Tabela 1. Specyficzne odczynniki