Przedstawiamy łatwą do wdrożenia modyfikację klasycznej techniki dwóch mankietów stosowanej w ortotopowym przeszczepieniu wątroby u szczura.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowa transplantacja wątroby u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Postępy kliniczne w dziedzinie transplantacji wątroby były w dużej mierze wspierane przez modele zwierzęce1,2. Od czasu publikacji pierwszej ortotopowej transplantacji wątroby szczura w 1979 roku przez Kamadę et al.3, model ten pozostaje złotym standardem, pomimo różnych proponowanych technik alternatywnych4. Niemniej jednak jego szersze zastosowanie jest ograniczone przez trudny proces nauki tej metody5.
W niniejszym artykule wideo przedstawiamy prostą i łatwą do wdrożenia modyfikację techniki dwóch mankietów Kamady. Anastomoza żyły głównej górnej nadwątrobowej jest wykonywana ręcznie za pomocą szwu ciągłego, natomiast anastomozy żyły wrotnej oraz żyły głównej dolnej podwątrobowej są realizowane przy użyciu systemu mankietów typu quick-linker6. Sposób wykonania zestawu quick-linker został zaprezentowany w oddzielnym artykule wideo.
Protokół
1. Operacja dawcy
- Zanestezjować samce szczurów o masie 200±20 g przy użyciu izofluranu przez maskę stożkową (3% do indukcji, 2% w trakcie operacji, przepływ powietrza 1 l/min, FiO2 70%).
- Wyonać szeroką laparotomię pośrodkową i poprzeczną, a następnie przyżegać naczynia nabrzuszne po obu stronach.
- Przeciąć więzadło okrągłe wątroby i oddzielić lewą żyłę przeponową od żyły głównej górnej w odcinku nadwątrobowym. Na koniec przeciąć żyłę przeponową pomiędzy dwiema ligaturami z jedwabiu 7-0.
- Przeciąć więzadło trójkątne lewe oraz więzadło wątrobowo-żołądkowe.
- Przeciąć więzadło i tętnicę wątrobowo-przełykową pomiędzy ligaturami 7-0 (alternatywnie można zastosować koagulację).
- Wypreparować żyłę główną dolną w odcinku podwątrobowym aż do lewej żyły nerkowej. Oddzielić prawą żyłę nerkową od tkanek otaczających i przeciąć ją pomiędzy ligaturą 10-0 a 7-0, odpowiednio na jej końcu proksymalnym i dystalnym.
- Przeciąć prawą żyłę nadnerczową pomiędzy ligaturami 7-0 i uwolnić wątrobę z więzadeł tylnych poprzez cięcie przy delikatnej trakcji.
- Wypreparować żyłę żołądkowo-śledzionową i przeciąć ją pomiędzy ligaturą 10-0 a 7-0, odpowiednio na jej końcu proksymalnym i dystalnym.
- Przeciąć właściwą tętnicę wątrobową pomiędzy wiązaniami 7-0.
- Wypreparować żyłę dwunastniczo-trzustkową i przeciąć ją pomiędzy ligaturą 10-0 a 7-0, odpowiednio na jej końcu proksymalnym i dystalnym.
- Wprowadzić stent 22G o długości 3,5 mm do wspólnego przewodu żółciowego, wykonując niewielkie nacięcie w odległości 1 cm od wnęki wątroby. Zabezpieczyć stent w pozycji za pomocą ligatury 7-0.
- Wstrzyknąć 10 UI heparyny, rozcieńczonej w 1 ml soli fizjologicznej, przez grzbietową żyłę prącia.
- Kaniulować żyłę wrotną (jak najdalej od wnęki) igłą 21G i delikatnie przepłukać wątrobę 20 ml zimnego mleczka Ringera z mleczanami (lub innych roztworów konserwujących). Jednocześnie przeciąć żyłę główną dolną poniżej żył nerkowych, aby zapewnić odpowiedni odpływ. Zimna perfuzja wątroby powinna trwać od jednej do dwóch minut.
- Przeciąć żyłę wrotną poniżej żyły dwunastniczo-trzustkowej.
- Przeciąć wspólny przewód żółciowy poniżej ligatury wokół stentu.
- Dokończyć nacięcie żyły głównej dolnej w odcinku podwątrobowym.
- Przeciąć żyłę główną górną w odcinku nadwątrobowym aż do przepony i usunąć wątrobę.
- Umieścić wątrobę w naczyniu wypełnionym zimnym mleczkiem Ringera z mleczanami i postawić naczynie na podkładce z lodu.
2. Przygotowanie przeszczepu
- Wprowadź vena porta do mankietu, a następnie wywiń naczynie wokół krawędzi, aby odsłonić błonę wewnętrzną (intima). Zabezpiecz wywinięty segment na mankiecie ligaturą 7-0.
- Powtórz tę samą operację na infrahepatycznej vena cava.
- Umieść mikroklamrę (o długości 4-6 mm) na proksymalnej części infrahepatycznej vena cava. Zabieg ten zapobiega utracie krwi po reperfuzji wrotnej.
- Odwróć wątrobę i wprowadź dwa szwy z prolenu 8-0 w przeciwległych krawędziach bocznych suprahepatycznej vena cava, od zewnątrz do wewnątrz.
- Przechowuj przeszczep (zanurzony w roztworze mleczanu Ringera) w lodówce w temperaturze 0-4 °C.
3. Operacja biorcy
- Zanurzyć samce szczurów o masie 200±20 g w narkozie izofluranem za pomocą maski stożkowej (3% podczas indukcji, 2% w trakcie operacji, przepływ powietrza 1 l/min, FiO2 70%) i utrzymać na ogrzewanej podkładce. Należy pamiętać, aby masy ciała biorcy i dawcy były zbliżone (±40 g).
- Przed laparotomią wstrzyknąć podskórnie 10 ml soli fizjologicznej oraz domięśniowo 0,03 g piperacyliny/tazobaktamu.
- Wykonać laparotomię w linii pośrodkowej od wyrostka miecza do łonu.
- Odchylić wyrostek miecza za pomocą kleszczyków autostatycznych, aby lepiej odsłonić wątrobę.
- Przeciąć więzadła przednie i przeciąć lewą żyłę przeponową między dwiema podwiązkami 7-0.
- Przeciąć więzadło wątrobowo-przełykowe oraz tętnicę między podwiązkami 7-0 (alternatywnie można zastosować koagulację). Nie pokazano tego na filmie (procedura identyczna z operacją dawcy).
- Wyizolować żyłę główną dolną poniżej wątroby aż do prawej żyły nerkowej.
- Przeciąć prawą żyłę nadnerczową między podwiązkami 7-0 i uwolnić wątrobę od jej tylnych więzadeł, przecinając je pod delikatnym naciągiem (nie pokazano na filmie (procedura identyczna z operacją dawcy)).
- Założyć podwiązkę 7-0 wokół wspólnego przewodu żółciowego, tuż poniżej miejsca jego podziału. Założyć kolejną podwiązkę jeden milimetr niżej i przeciąć w międzyczasie.
- Wyizolować tętnicę wątrobową w obrębie wnęki i przeciąć ją między podwiązkami 7-0.
- Delikatnie rozdzielić lewą i prawą gałąź wrotna. Należy uważać, aby nie uszkodzić wspólnej tętnicy wątrobowej ani żyły żołądkowo-śledzionowej.
- Umieścić pierścień kawalny wokół żyły głównej dolnej, szyjnie w stosunku do prawej żyły nerkowej. Następnie przymocować ścianę naczynia do pierścienia, zakładając cztery główne szwy 9-0.
- Powtórzyć tę samą operację z pierścieniem wrotnym na żyle wrotnej.
- Wstrzyknąć 10 UI heparyny, rozcieńczonej w 1 ml soli fizjologicznej, przez żyłę grzbietową prącia.
- Ustawić narkozę na poziomie 0,25% oraz FiO2 na 100%.
- Zacisnąć klemą żyłę główną dolną poniżej wątroby, tuż nad prawą żyłą nerkową, następnie zacisnąć żyłę wrotną tuż nad żyłą żołądkowo-śledzionową. Na koniec zacisnąć żyłę główną nad wątrobą, upewniając się, że objęto co najmniej 2 mm przepony.
- Przeciąć żyłę główną nad wątrobą blisko miąższu.
- Przeciąć lewą i prawą gałąź wrotną i rozdzielić znajdującą się między nimi przegrodę.
- Przeciąć żyłę główną dolną poniżej wątroby blisko miąższu, uważając, aby nie przeciąć żadnego z wcześniej założonych szwów. Usunąć wątrobę i umieścić przeszczep w jamie brzusznej.
- Wykonać anastomozę koniec-do-końca między żyłą główną nad wątrobą przeszczepu a biorcy. Rozpocząć od szwu ciągłego tylnej ściany od lewej do prawej, a następnie przejść do ściany przedniej od prawej do lewej. Pozostawić szew przedni luźny aż do końca, aby umożliwić dokładne przepłukanie wnętrza światła przed ściągnięciem końców.
- Wsunąć gałąź szyjną aproksymatora do uchwytu pierścienia wrotnego; następnie wsunąć żyłę wrotną przeszczepu w szczelinę gałęzi głowicowej aproksymatora, tak aby mankiet wrotny znalazł się w gnieździe.
- Zamknąć aproksymator, jednocześnie przepłukując żyłę wrotną biorcy solą fizjologiczną i pozwalając mankietowi wsunąć się do naczynia. Zabezpieczyć żyłę wrotną biorcy wokół mankietu okrężną podwiązką 7-0.
- Usunąć aproksymator. Otworzyć klemę na żyle głównej nad wątrobą i na żyle wrotnej w tej kolejności: przepływ wrotny zostaje przywrócony.
- Usunąć pierścień wrotny, przecinając podwiązki 9-0 za pomocą mikronożyczek.
- Wsunąć gałąź szyjną aproksymatora do uchwytu pierścienia kawalnego; następnie wsunąć żyłę główną dolną poniżej wątroby przeszczepu w szczelinę gałęzi głowicowej aproksymatora, tak aby mankiet kawalny znalazł się w gnieździe.
- Zamknąć aproksymator, jednocześnie przepłukując żyłę główną dolną biorcy solą fizjologiczną i pozwalając mankietowi wsunąć się do naczynia. Zabezpieczyć żyłę główną biorcy wokół mankietu okrężną podwiązką 7-0.
- Usunąć aproksymator. Otworzyć mikroklemami żyłę główną dolną poniżej wątroby przeszczepu i biorcy w tej kolejności: przepływ żylny zostaje przywrócony.
- Wykonać częściowe nacięcie wspólnego przewodu żółciowego biorcy, zastosować delikatny naciąg w stronę głowy i wsunąć wolny koniec stentu wcześniej wprowadzonego do przewodu żółciowego przeszczepu. Zabezpieczyć stent okrężną podwiązką 7-0.
- Zamknąć zwierzę warstwowo szwami 5-0. Po przebudzeniu zapewnić swobodny dostęp do wody i pożywienia.
- Zastosować skuteczne leki przeciwbólowe zgodnie z lokalnymi protokołami instytucjonalnymi. Zalecany minimalny czas podawania to 24 h.
Należy zauważyć, że w przypadku gdy wymaga tego projekt eksperymentalny, można przeprowadzić zespolenie tętnicy wątrobowej koniec do końca (tętnica ta nie jest niezbędna do przeżycia szczura w długim okresie po transplantacji wątroby).
4. Reprezentatywne wyniki
Opisana technika została z sukcesem opanowana przez nasz zespół po około 10 zabiegach treningowych. Pozwoliło to na 100% długoterminową (>21 dni) przeżywalność w 36 kolejnych transplantacjach od szczurów Lewis do Lewis oraz od szczurów Dark Agouti do Lewis po krótkim okresie treningowym (liczba biorców syngeneicznych przeszczepów wątroby pozostaje żywa od ponad 12 miesięcy). Testy funkcji wątroby w 1. dobie po transplantacji syngeneicznej wykazały medianę aminotransferazy asparaginianowej (AST): 84 U/l (51,7 - 92,7) oraz medianę aminotransferazy alaninowej (ALT): 172,5 U/l (127,5 - 240,2). Średni czas fazy anhepatycznej (od zaklemowania vena porta do reperfuzji przeszczepu) wynosił 14 ±2 min, a najdłuższym etapem był czas wykonania anastomozy żyły głównej dolnej nad wątrobą (szew ciągły), który wynosił 9±2 min.
System szybkich łączników (quick-linker) umożliwił zastosowanie mankietów o średnicy 1,55 mm na żyle wrotnej (vena porta) oraz mankietów o średnicy 2,40 mm na żyle głównej (vena cava) (odbiorcy o masie 200 ±20 g). W przeciwieństwie do tego, podczas prób przeszczepiania przy użyciu techniki Kamady, wartości te nie mogły przekroczyć odpowiednio 1,40 mm i 2,16 mm (szczury o tej samej linii i masie). Jak pokazano na Rysunku 7, pierścienie szybkich łączników są zaprojektowane tak, aby utrzymać naczynia odbiorcy w optymalnym rozciągnięciu, co pozwala zminimalizować straty w kalibrze i długości, a w konsekwencji prowadzi do uzyskania wyników hemodynamicznych bardziej zbliżonych do fizjologicznych.
Rycina 1. Wymiary pierścieni.
Rysunek 2. Wymiary mikroklemp.
Rycina 3. Zestaw szybkozłączek.
Rycina 4. Uzbrojony szybki łącznik (quick-linker).
Rysunek 5. Zamknięty szybki łącznik (quick-linker).
Rycina 6. Zacisk SHVC.
Rysunek 7. Hemodynamika anastomozy mankietowej wykonanej metodą klasyczną oraz przy użyciu łącznika szybkosprzęgalnego (quick-linker).
Rysunek 8. Przygotowanie skóry dawcy i biorcy oraz nacięcie.
Dyskusja
Przedstawiony model transplantacji wątroby szczura można łatwo wprowadzić. Z naszego doświadczenia wynika, że kilka kluczowych punktów pomaga zminimalizować ryzyko śmierci (≤20%). Wczesne zgony, następujące w ciągu pierwszych trzech godzin od reperfuzji, najczęściej wynikają z zawału jelit będącego następstwem długotrwałego zaklemowania żyły wrotnej. Zaleca się zatem utrzymanie fazy anhepatycznej w optymalnym limicie 15 minut (do 20 minut jest wciąż dopuszczalne). Przyczyną nagłej śmierci może być również centralna zatorowość powietrzna, dlatego obowiązkowe jest przepłukanie wszystkich żył przed wykonaniem anastomozy.
Zgony występujące między pierwszym a trzecim dniem po operacji są często wynikiem niewydolności wątroby lub zakrzepicy żyły głównej. Należy zatem unikać agresywnego płukania przeszczepu przed eksplantacją u dawcy (płuczemy 20 ml przez około 60 sekund) i zapewnić odpowiednią konserwację w niskiej temperaturze (pełne zanurzenie w roztworze mleczanu Ringera o temperaturze 0-4 °C). Ryzyko zakrzepicy można zmniejszyć poprzez ograniczenie manipulacji w obrębie wewnętrznej błony naczyń i zachowanie jej nienaruszonej struktury. Nie zalecamy stosowania leków przeciwkrzepliwych po operacji.
Zgony między czwartym a dziewiątym dniem po operacji często są związane z bakteryjnym zapaleniem dróg żółciowych7. W oparciu o nasze doświadczenie, pojedyncza dawka piperacyliny z tazobaktamem (0,03 g) podana przed laparotomią jest wystarczająca, aby zminimalizować ryzyko zakażenia przewodu żółciowego wspólnego.
Zgon jest rzadkim zdarzeniem po 10. dniu. Jednakże, ze względu na brak przepływu tętniczego, mogą wystąpić problemy z drogami żółciowymi z cholestazą8. W zależności od potrzeb badacza można rozważyć tętnicową rekonstrukcję9. Warto zauważyć, że czas zimnego niedokrwienia do 24 godzin można uznać za dopuszczalny10.
System quick-linker został pierwotnie zaprojektowany do przeprowadzania przeszczepienia wątroby z trzema anastomosami mankietowymi (bardzo krótka faza anhepatyczna). Jednak technika trzech mankietów wymaga użycia bardzo małych zacisków dla mankietu żyły głównej górnej (SHVC) i nie zyskała szerokiego uznania ze względu na ryzyko problemów z odpływem krwi z wątroby11-14. Dlatego preferujemy technikę trzech mankietów wspomaganą systemem quick-linker tylko wtedy, gdy wymagany jest czas ciepłego niedokrwienia krótszy niż dziesięć minut. W większości badań jednak dopuszczalne są fazy implantacji trwające do 15-18 minut, co pozwala na zastosowanie techniki dwóch mankietów i bardziej fizjologiczny drenaż SHVC. Jak pokazano w tym filmie, rutynowo stosujemy system quick-linker tylko w drugiej części implantacji. Chociaż pozycjonowanie uchwytów quick-linkera wymaga dodatkowego czasu chirurgicznego, ta część procedury wiąże się z minimalnym ryzykiem i pozwala na skrócenie krytycznej fazy anhepatycznej dzięki łatwiejszemu wprowadzaniu mankietów. Innymi zaletami systemu quick-linker są lepsze dopasowanie naczyń przeszczepu i biorcy oraz możliwość zastosowania szerszych mankietów z lepszymi efektami hemodynamicznymi w porównaniu do wcześniej opisanych technik (w tym techniki opisanej przez Kamada et al.)6(Rys. 7).
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
CT otrzymał wsparcie od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (grant SCORE 3232230-126233). Badanie zostało wsparte przez Fundację Artères, Fundację Astellas Europe oraz Fundację Boninchi.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Narzędzie / Odczynnik | Firma | Nr katalogowy | Komentarz |
| Mankiet wrotny | altecweb.com lub smiths-medical.com | Coil 01-96-1729 800/100/420 | Śwred: 1.55mm Ścianka: 0.30mm Długość: 3.5 mm |
| Mankiet żyły głównej dolnej w odcinku podwątrobowym | altecweb.com lub smiths-medical.com | Coil 01-96-1733 800/100/540 | Śwred: 2.40mm Ścianka: 0.30mm Długość: 3.5 mm |
| Stent przewodu żółciowego wspólnego | standardowy kaniule Venflon 22G | ||
| nici jedwabne 7-0 | georgetiemann.com | 160-1226-7/0 | |
| prolene 10-0 | ethicon.com | ||
| prolene 9-0 | ethicon.com | ||
| prolene 8-0 | ethicon.com | ||
| Prosta mikropinceta | s-and-t.net | FRC-15RM-8 | |
| Zakrzywiona mikropinceta | s-and-t.net | FRS-15-RM-8 | |
| Portiklica do preparowania tkanek | s-and-t.net | B-15-8.2 | |
| Portiklica do anastomoz | rumex.net | 8-021T | |
| Mikrokleszcze | finescience.com | 18055-03 | 6 x 1mm |
| Aplikator do mikrokleszczy | finescience.com | 18057-14 | |
| Kleszcze do żyły głównej dolnej w odcinku nadwątrobowym | pharmap.ch | 13.349.14 | |
| Pierścienie Quick-Linker | dltchiropody.co.uk | PAR 10 | zmodyfikowane ostrza skalpela |
| Aproksymator Quick-Linker | pharmap.ch | UD-04-275 | zmodyfikowana kleszczyka Kochera’ |
Bibliografia
- Starzl, T. E., Marchioro, T. L., Porter, K. A. Experimental and clinical observation after homotransplantation of the whole liver. Revue internationale d'hepatologie. 15, 1447(1965).
- Starzl, T. E. Evolution of liver transplantation. Hepatology. 2, 614S-636S (1982).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47(1979).
- Kashfi, A. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation proceedings. 37, 185-188 (2005).
- Hori, T. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World Journal of Gastroenterology: WJG. 16, 3120(2010).
- Oldani, G. A novel technique for rat liver transplantation using Quick Linker system: a preliminary result. Journal of Surgical Research. 149, 303-309 (2008).
- Nosaka, T., Bowers, J. L., Cay, O., Clouse, M. E. Biliary complications after orthotopic liver transplantation in rats. Surg. Today. 29, 963-965 (1999).
- Li, G. L. High incidence of biliary complications in rat liver transplantation: can we avoid it. World J. Gastroenterol. 17, 3140-3144 (2011).
- Peng, Y., Gong, J. P., Yan, L. N., Li, S. B., Li, X. H. Improved two-cuff technique for orthotopic liver transplantation in rat. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 3, 33-37 (2004).
- Urata, K. Decreased survival in rat liver transplantation with extended cold preservation: role of portal vein clamping time. Hepatology. 28, 366-373 (1998).
Przedruki i uprawnienia
