Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4152

⸱

11 października 2012

 ,  , 
1Life Science Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Department of Comparative Biochemistry, University of California, Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Streszczenie

Interakcje między komórkami a ich otaczającym mikrośrodowiskiem mają funkcjonalne konsekwencje dla zachowania komórkowego. Na poziomie pojedynczej komórki odmienne mikrośrodowiska mogą wymuszać fenotypy różnicowania, migracji i proliferacji, a na poziomie tkanki mikrośrodowisko wpływa na procesy tak złożone jak morfogeneza i tumorigenesis1. Na komórki wewnątrz mikrośrodowiska wpływają nie tylko zawartości komórkowe i molekularne, ale także elastyczność2 i geometria3 tkanki. Mikrośrodowisko, definiowane jako suma interakcji między komórkami, między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz między komórkami a czynnikami rozpuszczalnymi, dodatkowo uwzględniając cechy fizyczne, jest układem złożonym. Fenotypy komórek w obrębie tkanki wynikają częściowo z ich zawartości genomicznej, a częściowo z kombinatorycznych interakcji z mikrośrodowiskiem. Głównym wyzwaniem jest powiązanie konkretnych kombinacji komponentów mikrośrodowiska z charakterystycznymi zachowaniami.

W niniejszej pracy przedstawiamy platformę mikrotablicową mikrośrodowiska (MEArray) do funkcjonalnego przesiewania interakcji z kombinatorycznymi mikrośrodowiskami opartych na komórkach4. Metoda ta umożliwia jednoczesną kontrolę składu molekularnego oraz modułu sprężystości, łącząc wykorzystanie powszechnie dostępnych technologii mikrotablic i mikrowzorowania. Przesiewy MEArray wymagają zaledwie 10 000 komórek na tablicę, co ułatwia badania funkcjonalne rzadkich typów komórek, takich jak dorosłe komórki progenitorowe. Ograniczeniem tej technologii jest fakt, że całe mikrośrodowiska tkankowe nie mogą zostać w pełni odwzorowane na MEArray. Niemniej jednak porównanie odpowiedzi tego samego typu komórek na liczne powiązane mikrośrodowiska, na przykład na pary kombinacji białek ECM charakterystycznych dla danej tkanki, pozwoli zrozumieć, w jaki sposób składniki mikrośrodowiska wywołują tkankowo specyficzne fenotypy funkcjonalne.

MEArrays można drukować, wykorzystując szeroką gamę rekombinowanych czynników wzrostu, cytokin i oczyszczonych białek ECM oraz ich kombinacje. Platforma ta jest ograniczona jedynie dostępnością konkretnych odczynników. MEArrays nadają się do analizy poklatkowej, jednak najczęściej stosuje się je do analiz końcowych funkcji komórkowych, które można zmierzyć za pomocą sond fluorescencyjnych. Przykładowo, powszechnie mierzy się syntezę DNA, apoptozę, nabywanie stanów zróżnicowanych lub produkcję specyficznych produktów genów. W skrócie, podstawowy przebieg eksperymentu z użyciem MEArray polega na przygotowaniu szkiełek pokrytych podłożami do druku oraz przygotowaniu płyty głównej z białkami przeznaczonymi do wydruku. Następnie macierze są drukowane za pomocą robota do mikromacierzy, po czym pozwala się komórkom przytwierdzić i rosnąć w kulturze, a po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu są one utrwalane chemicznie. Do ujawnienia odpowiednich fenotypów molekularnych i komórkowych wykorzystuje się testy fluorescencyjne lub kolorymetryczne, obrazowane za pomocą tradycyjnych mikroskopów lub skanerów do mikromacierzy (Rysunek 1).

Protokół

1. Przygotowanie podłoży do drukowania

Decyzja o zastosowaniu szkiełek powlekanych polidimetylosiloksanem (PDMS) lub poliakrylamidem (PA) zależy od istotnych parametrów projektu eksperymentalnego. Moduł sprężystości obu polimerów można dostosować tak, aby naśladował sztywność różnych tkanek, zmieniając stosunek bazy do utwardzacza w przypadku PDMS oraz stosunek akrylamidu do bis-akrylamidu w przypadku PA. PDMS może naśladować tkanki sztywniejsze w zakresie 1-10MPa (np. chrząstkę, rogówkę i ściany tętnic), natomiast PA może naśladować tkanki miększe w zakresie 100Pa-100kPa (np. pierś, mózg, wątrobę i prostatę) 5. PDMS jest niedrogi, łatwy w przygotowaniu, a geometria wydrukowanych elementów będzie identyczna z kształtem głowic pinów drukujących. Dzięki temu rozmiar i kształt elementów można precyzyjnie kontrolować, stosując piny o różnych geometriach końcówek. PDMS jest bardziej hydrofobowy niż PA, co stwarza pewne trudności podczas etapów manipulacji komórkami i immunobarwienia, a także może być niekompatybilny z niektórymi liniami komórkowymi. Ponieważ PA jest hydrożelem i natywną powierzchnią nieprzywierającą (non-fouling), komórki będą przytwierdzate wyłącznie do obszarów, w których znajdują się białka wspierające adhezję komórkową. Geometria wydrukowanych elementów na żelach PA nie odzwierciedla precyzyjnie geometrii głowicy pinu; zazwyczaj przyjmują one kształt kół z powodu dyfuzji, niezależnie od zastosowanej geometrii głowicy. Parametry czasu kontaktu podczas drukowania oraz średnicy pinu można wyznaczyć empirycznie w celu uzyskania optymalnego rozmiaru elementów na żelach PA.

Polidimetylosiloksan (PDMS)

  1. W jednorazowym plastikowym kubku połączyć bazę elastomeru silikonowego Sylgard 184 z utwardzaczem w stosunku 10:1, energicznie wymieszać za pomocą drewnianego lub plastikowego szpatla, a następnie odgazować w komorze próżniowej w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  2. Umieścić standardowe szkiełko mikroskopowe na uchwycie próżniowym spin coatera, a następnie nalać 0,5 ml zmieszanego polimeru elastomerowego na środek powierzchni szkiełka. Wirować z prędkością 6 000 rpm przez 60 sec.
  3. Utwardzać szkiełka powlekane PDMS w piekarniku w temperaturze 70 °C lub na cyfrowej płycie grzejnej (chroniąc przed kurzem) przez 4 hr lub przez noc.
  4. Utwardzone szkiełka można wykorzystać natychmiast lub przechowywać przez kilka miesięcy w kasecie na szkiełka, zamkniętej w plastikowej torebce Ziploc i umieszczonej w szufladzie. PDMS przyciąga kurz, dlatego musi być dobrze chroniony przed cyrkulacją powietrza w pomieszczeniu.
  5. Uwaga: Podczas pracy z zestawem elastomeru PDMS należy używać rękawiczek nitrylowych lub innych rękawiczek beztalenowych. Przypadkowy kontakt z rękawiczkami lateksowymi hamuje polimeryzację PDMS.

Poliakrylamid (PA)

  1. Trawienie NaOH: Umieścić szkiełka na bloku grzewczym w temperaturze 80 °C. Na każde szkiełko nanieść 1 ml 0.1N NaOH, upewniając się, że cała powierzchnia szkiełka jest pokryta. Pozostawić NaOH do odparowania (na powierzchni szkiełka powinna utworzyć się biała warstwa). Ponieważ żel PA może trwale przylegać jedynie do powierzchni trawionych NaOH, żel PA odklei się podczas etapu wysuszania, jeśli cała powierzchnia szkiełka nie zostanie pokryta NaOH. Jeśli powierzchnia szkiełka nie została pokryta całkowicie, powtórzyć czynność, dodając 1 ml 0.1N NaOH. Szkiełka można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka dni. Uwaga: Alternatywą dla trawienia NaOH jest czyszczenie szkiełek ozonem lub plazmą.
  2. Powlekanie 3-aminopropyltrietoksysilanem (APES): W dygestorium umieścić szkiełka w naczyniu o pojemności 15 ml i nanieść 300 μl APES na każde szkiełko trawione NaOH. Pozostawić APES do przereagowania ze szkiełkami NaOH przez 5 min. Przekroczenie tego czasu utrudni wypłukanie nieprzereagowanego odczynnika APES. Dokładnie wypłukać APES wodą dejonizowaną dwa lub trzy razy z obu stron szkiełek. Jeśli płukanie nie zostanie wykonane całkowicie, APES zostanie utleniony przez glutaraldehyd, co spowoduje powstanie brązowego osadu na szkiełkach w kroku 1.8.
  3. Utlenianie glutaraldehydem: Odessać wszystkie roztwory z powierzchni szkiełek. Do każdego naczynia o średnicy 15 cm dodać 25 ml 0.5% glutaraldehydu w PBS. Inkubować przez 30 min w ciemnym miejscu. Po 30 min odessać cały glutaraldehyd i użyć niepozostawiających włókien chusteczek laboratoryjnych (np. Kimwipes), aby ostrożnie osuszyć szkiełka. Szkiełka można następnie przechowywać w RT do jednego dnia.
  4. Przygotowanie żelu: Po przygotowaniu mieszanin PA zawierających akrylamid, bis-akrylamid i ddH2O zgodnie z poniższą tabelą, odgazować przez 30 min, a następnie umieścić mieszaniny PA na lodzie, aby spowolnić polimeryzację. Bezpośrednio przed przygotowaniem żeli dodać APS oraz TEMED i dobrze wymieszać. Nanieść pipetą mieszaniny PA na powierzchnie szkiełek i położyć na wierzchu szkiełka nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm, nr 1. Należy unikać dociskania szkiełka nakrywkowego do szkiełka podstawowego oraz unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Dla żeli >40,000 Pa użyć 100 μl, dla pozostałych żeli użyć 350 μl.
Pożądany moduł (Pa)Akrylamid%Bis-akrylamid%Akrylamid z roztworu stokowego 40% (ml)Bis-akrylamid z roztworu stokowego 2% (ml)Woda dejonizowana (ml)APS (μl)TEMED (μl)
480±16030,060,750,38,9510010
4470±119050,151,250,75810010
40,400±239080,4822,45,610010

Opracowano na podstawie 6,7.

  1. Pozostawić żel PA do polimeryzacji na 2 hr, a następnie usunąć szkiełka przykrywne pod wodą dejonizowaną.
  2. Przemywać szkiełka z żelem PA w dużych naczyniach Coplan w wodzie przez noc (~8 hr), aby usunąć niezwiązane akrylamidy.
  3. Suszyć szkiełka w piecu w temperaturze 37 °C przez 2-4 hr lub do całkowitego utwardzenia żelu PA.
  4. Szkiełka z żelem PA można przechowywać w temperaturze 4 °C przez miesiąc w szczelnym pudełku na szkiełka.

2. Przygotowanie płyty głównej z białkami

  1. Wszystkie białka należy rozdzielić na alikwoty w postaci 10-krotnych roztworów zapasowych w buforach zalecanych przez dostawcę i przechowywać w temperaturze -80 °C. Większość białek ECM rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej, jednak może być konieczne skorygowanie pH za pomocą kropel kwasu octowego. Większość czynników wzrostu, cytokin oraz rekombinowanych domen zewnątrzkomórkowych receptorów przygotowuje się w PBS z dodatkiem BSA, choć warunki mogą się różnić w zależności od producenta. Przed przechowywaniem przefiltruj alikwoty białek przez nylonowy filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,45 μm i średnicy 4 mm (Nalgene).
  2. Zaprojektuj płytkę matkę zgodnie z pożądanymi kombinacjami i rozcieńczeniami białek. Komórki adherentne zazwyczaj wymagają obecności co najmniej jednego kompatybilnego białka ECM do pośrednictwa w adhezji komórkowej, choć czasami za przytwierdzanie mogą odpowiadać również przeciwciała przeciwko epitopom powierzchni komórki. Warto dodać wolny barwnik FITC lub białko sprzężone z fluorophorem do co najmniej jednej studzienki, aby ułatwić późniejszą orientację macierzy.
  3. Przygotuj płytkę matkę, rozcieńczając kombinacje białek w buforze do drukowania składającym się z 100 mM Tris-acetate/20% glicerolu/0,05% Triton-100X o pH 5,2. Zazwyczaj każda studzienka płytki 384-dołkowej zawiera nie więcej niż 10 μl.
  4. Zapisz zawartość każdej studzienki każdej płytki matki w pliku bazy danych z rozdzielaczem tabulator i przypisz każdej płytce matce unikalny numer identyfikacyjny. W tym celu często stosuje się sześciocyfrową datę, po której następują inicjały projektanta (MMDDYYinicjały). Ze względu na małe objętości w studzienkach, alikwoty białek można efektywnie wykorzystać do wygenerowania dużej liczby płyt powtórznych. Zaleca się przechowywanie płytek matek w temperaturze -80 °C; każda płytka matka nie powinna przechodzić więcej niż dwóch cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Drukowanie MEArray

  1. MEArrays można drukować przy użyciu większości konwencjonalnych robotów do drukowania mikromacierzy. Dobrze sprawdzają się drukarki z igłami typu Quill, wykorzystujące piny silikonowe lub ze stali nierdzewnej, jednak problematyczna może być lepkość białek. Idealnymi robotami do drukowania mikromacierzy w tej aplikacji są drukarki kapilarne, ponieważ dobrze współpracują z lepkimi roztworami białek.
  2. Aby uzyskać odpowiednią moc statystyczną w obrębie macierzy, zaleca się wykonanie od 10 do 12 powtórzeń każdego punktu (spotu) dla każdego mikrośrodowiska. Taki projekt pozwoli na porównanie aktywności w jednym mikrośrodowisku w stosunku do innego w tej samej macierzy przy użyciu prostego testu t-Studenta. Do porównania aktywności w środowisku kontrolnym z innymi mikrośrodowiskami można zastosować test Dunnetta. Projekt ten sprawdza się najlepiej, gdy przed wykonaniem eksperymentów z MEArray przypisano fenotyp funkcjonalny do kontrolnego mikrośrodowiska.
  3. Wilgotność powinna być utrzymywana na poziomie około 50%. Kontrola wilgotności jest istotna, ponieważ zbyt niska wilgotność może doprowadzić do wyschnięcia roztworu wewnątrz pinów lub w dołkach płytki matrycowej, co spowoduje nieefektywne nanoszenie na podłoże drukarskie. Wilgotność można skutecznie kontrolować, przykrywając robota nieporowatą folią plastikową i używając jednocześnie nawilżacza oraz osuszacza ustawionych na utrzymanie wilgotności 50%. Chłodzone platformy drukujące mogą być przydatne do stabilizacji niektórych białek, jednak należy zachować ostrożność, aby uniknąć skraplania się wody na szkiełkach.
  4. Każda wydrukowana macierz powinna zostać oznaczona mrozoodpornymi etykietami do szkiełek z zakodowanym numerem seryjnym, który składa się z identyfikatora płytki matrycowej oraz trócyfrowej liczby (MMDDYYinitial-nnn). W miarę wykorzystywania lub dystrybucji każdej macierzy, szczegóły dotyczące ich obróbki eksperymentalnej powinny być prowadzone w bazie danych. Śledzenie dat drukowania oraz liczby cykli zamrażania i rozmrażania płytek matrycowych pomoże zidentyfikować optymalne warunki dla zachowania powtarzalności.
  5. Wydrukowane MEArrays powinny być przechowywane w szczelnych pudełkach na szkiełka w temperaturze -20 °C nie dłużej niż przez jeden miesiąc. Po tym czasie powtarzalność wyraźnie spada.

4. Hodowla komórek ssaków na macierzach MEArray do analizy funkcjonalnej

  1. Mocowanie komór hodowlanych: Aby ograniczyć objętość medium i liczbę komórek wymaganych do hodowli na MEArray, wokół wydrukowanego układu montuje się plastikową komorę. W przypadku wielu układów można zastosować pojedynczą komorę z okienka 2-komorowego (Nunc) o powierzchni 4,2 cm2. Należy usunąć komory z gotowego okienka i przeciąć je na pół żyletką. Za pomocą strzykawki 3 ml nanieść cienki pasek silikonu akwariowego (DAP) na krawędź komory, a następnie docisnąć ją do powierzchni MEArray. Należy unikać nakładania silikonu akwariowego na elementy strukturalne układu.
  2. Blokowanie i płukanie: MEArray muszą zostać dokładnie wypłukane, aby usunąć nieprzereagowane monomery, które mogą być toksyczne dla komórek. Jeśli zastosowano okienka powlekane PDMS, obszary pomiędzy wydrukowanymi elementami muszą zostać najpierw zablokowane powłoką zapobiegającą osadzaniu (non-fouling), aby zapobiec adhezji komórek; należy inkubować układy w 1% Pluronic F108 (BASF) w wodzie lub 2% BSA w wodzie przez 15 min w próżni. Okienka z żelu PA nie wymagają etapu blokowania. We wszystkich przypadkach układy należy płukać medium do hodowli komórek trzykrotnie przez pięć minut (wybór medium zależy od użytych komórek, jednak zaleca się stosowanie antybiotyków niezależnie od rodzaju medium lub komórek). Żele PA wymagają dodatkowej 30-minutowej inkubacji w medium w celu rehydratacji żelu.
  3. Przyczepianie komórek: Od czterech do pięciu układów może zmieścić się w jednej sterylnej płytce Petriego o średnicy 15 cm. Przykryć płytkę pokrywką, aby zachować sterylność układów. Dodać połowę końcowej objętości medium do MEArray, wprowadzając komórki w medium do uzyskania końcowego stężenia od 10 000 do 1 000 000 komórek/ml. Komórki będą przyczepiać się do wydrukowanych elementów z różną prędkością, w zależności od składu wydrukowanego mikrośrodowiska. Jednorodność przyczepiania należy sprawdzać, obserwując układy pod mikroskopem odwróconym w odstępach 15–20 min. Poprzez delikatne potrząsanie MEArray w przód i w tył można odróżnić komórki przyczepiające się w sposób uporządkowany od komórek pływających i nieprzyczepionych.
  4. Usuwanie nieprzyczepionych komórek: W przypadku MEArray powlekanych PA nieprzyczepione komórki można odessać, a medium zastąpić odpowiednią objętością. W przypadku MEArray powlekanych PDMS medium nigdy nie może zostać całkowicie usunięte z dołka, ponieważ komórki wysychają i giną niemal natychmiast. Dlatego na MEArray powlekanych PDMS nieprzyczepione komórki należy usuwać poprzez proces sukcesywnych wymian połowy objętości medium, aż do momentu usunięcia wszystkich nieprzyczepionych komórek, co należy potwierdzić w badaniu mikroskopowym. Efekt odpychania cieczy (de-wetting) w przypadku PDMS jest mniej wyraźny przy użyciu mediów zawierających surowicę w porównaniu do mediów definiowanych, a także gdy do blokowania niezadrukowanych obszarów stosuje się BSA zamiast Pluronics F108.
  5. Komórki mogą być hodowane na MEArray umieszczonych w płytkach Petriego 15 cm przez wiele dni, przy standardowych wymianach medium. Wymiany medium na okienkach PDMS muszą być przeprowadzane poprzez sukcesywne wymiany połowy objętości medium.
  6. Powszechnie stosowane utrwalacze, takie jak paraformaldehyd oraz metanol/aceton, są kompatybilne z systemami MEArray. Podczas barwienia komórek na MEArray powlekanych PA utrwalacze można dodawać i wypłukiwać w taki sam sposób, jak w konwencjonalnej procedurze barwienia. Jednak podczas barwienia komórek na MEArray powlekanych PDMS powierzchnia musi pozostać mokra nawet podczas utrwalania. Odessać połowę medium i zastąpić ją utrwalaczem. Powtórzyć ten proces kilka razy, aż dołek zostanie wypełniony w większości utrwalaczem. Po utrwalaniu utrwalacz jest stopniowo zastępowany w ten sam sposób buforem blokującym, odpowiednim dla kolejnego etapu analizy.
  7. Immunobarwienie jest powszechnie stosowane do analizy funkcji komórkowych. Procedury barwienia mogą się różnić, ale podczas pracy z MEArray PDMS każdy etap płukania i aspiracji należy przeprowadzać jak opisano powyżej, stopniowo wymieniając roztwory i nie dopuszczając do wyschnięcia powierzchni (de-wetting). Wyschnięcie powierzchni spowoduje powstanie artefaktów w barwieniu.
  8. Komory można usunąć za pomocą żyletki. Na zabarwionych MEArray można zamontować szkiełka nakrywki, używając Fluoromount-G (Southern Biotech). Detekcję można przeprowadzić za pomocą większości wielokolorowych skanerów mikroarray fluorescencyjnych lub na mikroskopach konfokalnych z motoryzowanymi trybami akwizycji obrazów mozaikowych (tiled image acquisition).

5. Reprezentatywne wyniki

Przykład wzorcowego osadzania białek na wydrukowanej płytce MEArray pokrytej PDMS, z wykorzystaniem krzemowych pinów o kwadratowym czubku w robocie do drukowania mikromacierzy typu quill pin, przedstawiono na Rysunku 2. Osadzenie różnych wydrukowanych białek można zweryfikować za pomocą immunofluorescencji z użyciem przeciwciał (Rysunek 2A). Rozcieńczenia roztworów białek w płytce matrycowej odzwierciedlają ilość (intensywność fluorescencji) osadzoną na powierzchni podłoża drukującego (Rysunek 2B). Komórki powinny przytwierdzać się do wydrukowanych elementów w wyraźny, wzorcowy sposób (Rysunek 2C).

Przykład eksperymentu MEArray wykazującego, że odwrotne rozcieńczenia dwóch białek mikrośrodowiska wywołały specyficzne profile ekspresji keratyn w sposób zależny od stężenia białka w ludzkiej multipotencjalnej linii komórek progenitorowych nabłonka piersi (komórki D920), przedstawiono na Rysunku 3. Wykresy bąbelkowe są przydatne do określenia, czy specyficzne fenotypy są narzucane komórkom na powtórzonych elementach serii rozcieńczeń. Na przykład, jeśli konkretna cząsteczka w mikrośrodowisku wywołuje wyraźny fenotyp, to po odpowiednim rozcieńczeniu komponentu instrukcyjnego w neutralnym tle ECM fenotyp ten powinien ulec zmianie lub zaniknąć. Detekcję immunofluorescencyjną białek filamentów pośrednich keratyny 8 i keratyny 14 przeprowadzono za pomocą skanera mikromacierzy Axon 4200a (Molecular Devices). Na każdej macierzy MEArray wydrukowano dwanaście powtórnych serii rozcieńczeń, a stosunek log2 średniej intensywności fluorescencji keratyny 8 do keratyny 14 przedstawiono na wykresie bąbelkowym, aby uzyskać realistyczny obraz zmienności i powtarzalności sygnału. Przedstawiono dane z MEArray utrwalonego po przywieraniu komórek i wypłukaniu komórek nieprzywierających (Rysunek 3A) oraz po 24 h hodowli (Rysunek 3B). W tej stosunkowo niewielkiej analizie zastosowano jednoczynnikową analizę ANOVA w celu określenia wariancji od średniego sygnału w każdym punkcie czasowym, a dwustronne testy T dla grup zastosowano, aby ustalić, czy różne rozcieńczenia kolagenu typu I i rekombinowanej ludzkiej P-kadheryny spowodowały zmiany w ekspresji keratyn. Nie stwierdzono odchyleń od średniej wśród komórek na elementach bezpośrednio po przywieraniu; jednak po 24 h ekspozycji na różne mikrośrodowiska wystąpiły istotne różnice w ekspresji keratyn. Testy T potwierdziły, że wysokie stężenia kolagenu typu I wywołały wyższą ekspresję keratyny 8, natomiast wysokie stężenia P-kadheryny wywołały silny sygnał keratyny 14 po 24 h. Wynik ten był zgodny z wcześniejszymi doniesieniami, że mikrośrodowiska zawierające P-kadherynę narzucają fenotyp mioepitelialny wykazujący ekspresję K14 bipotencjalnym komórkom progenitorowym piersi4.

Przykład całego zeskanowanego MEArray nadrukowanego na żelu PA 40 000 Pa przedstawiono na Rysunku 4.

Schemat procesu MEArray: przygotowanie slajdów, hodowla komórek, bioanaliza, akwizycja obrazów, analiza.
Rysunek 1. Schemat procedury MEArray. W pierwszym kroku przygotowywane są podłoża do druku przy użyciu PDMS lub PA. Po drugie, przygotowywane są płyty matrycowe i opisywane w bazie danych. Po trzecie, MEArray są drukowane i kodowane numerami seryjnymi. Po czwarte, mocowane są komory hodowlane, powierzchnie są blokowane i/lub płukane, następnie umożliwia się przywieranie komórek, a komórki nieprzywierające są wypłukiwane. Po piąte, po okresie inkubacji zależnym od projektu eksperymentalnego, komórki można poddać barwieniu lub bioanalizie. Na koniec można uzyskać obrazy MEArray i przeanalizować je za pomocą odpowiedniego skanera i oprogramowania.

Równowaga statyczna; intensywność fluorescencji w funkcji rozcieńczenia; kolagen IV, laminina I; wyniki mikroskopowe.
Rysunek 2. Osadzenie i względna zawartość nadrukowanych białek mogą zostać zweryfikowane za pomocą immunobarwienia przed przyczepieniem komórek. A) Do weryfikacji obecności kolagenu typu IV oraz lamininy-111 w nadrukowanych strukturach MEArray zastosowano przeciwciała rozpoznające te białka. B) Wykorzystując funkcję analizy średniej intensywności pikseli w oprogramowaniu NIH ImageJ, można jakościowo ocenić względną zawartość dwóch białek w serii rozcieńczeń, zaczynając od roztworu białka o stężeniu 200 μg/ml. C) Mikrograf fazowy komórek D920 przyczepionych do kwadratowych struktur nadrukowanego MEArray powleczonego PDMS.

Analiza adhezji i proliferacji komórek w 3D macierzy kolagenowej; wyniki testu p-kadheryny, wykres time-lapse.
Rysunek 3. Przykład analizy MEArray z wykorzystaniem zmian ekspresji keratyny w multipotencjalnej linii komórek progenitorowych w zależności od czasu i mikrośrodowiska. Każda bańka reprezentuje stosunki poziomów białek keratyny 8 i keratyny 14 z 10-15 komórek przytwierdzonych do elementu w MEArray. Ekspresję określono za pomocą sond immunofluorescencyjnych. A) Przedstawia stosunki keratyn w komórkach tuż po adhezji, a B) przedstawia stosunki keratyn po 24 hr na macierzy wysianej równolegle. Maksymalne stężenie obu białek wynosiło 200 μg/ml i zostało rozcieńczone 2-krotnie. Średnica bańki reprezentuje wartość log2 stosunku średniej intensywności keratyny 8 do keratyny 14, a pomarańczowe i białe kodowanie kolorystyczne wskazuje odpowiednio wartości >0 i <0. Przedstawiono wartości F dla jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, wartości P z testów T oraz nawiasy ze strzałkami identyfikujące porównywane populacje.

Mikroskopia fluorescencyjna MEArray; synteza DNA, analiza komórek; DAPI, EdU; wizualizacja danych.
Rysunek 4. Przykład skanu MEArray wykonanego w trybie akwizycji mozaikowej (tiled acquisition) przy użyciu konfokalnego mikroskopu skanującego. Komórki HCC1569 poddano inkubacji z analogiem DNA EdU przez 4 hr przed utrwaleniem. Przedstawiono barwienia DAPI (niebieski) i EdU (czerwony).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda MEArray umożliwia analizy funkcjonalne interakcji komórek i kombinatorycznych mikrośrodowisk4. Analiza MEArray łączy wykorzystanie podstawowych technologii mikrowzorowania, biologii komórki, robotów do drukowania macierzy mikroprzewodowych oraz urządzeń analitycznych dostępnych w wielu placówkach wieloużytkowych. Przesiewy MEArray są kompatybilne z większością typów komórek adherentnych, choć w niektórych przypadkach składy mediów bezsurowiczych mogą wymagać dostosowania poprzez doda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Podziękowania

ML jest wspierany przez NIA (R00AG033176 oraz R01AG040081) oraz przez Laboratory Directed Research and Development, kontrakt Departamentu Energii USA nr DE-AC02-05CH11231.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka przedmiotowe 25 mm x 75 mmVWR48311-600
Szkiełka nakrywki (nr 1) 24 mm x 50 mmVWR48393-241
Kuweta do barwienia (lub naczynie Coplana)VWR25461-003
Szalki Petriego (15 cm)BD Falcon351058
NaOH (1,0 N)Sigma-AldrichS2567
APES (>98% (3-aminopropyl)trietoksysilan)Sigma-AldrichA3648
GlutaraldehydSigma-AldrichG765150% w wodzie
APS (>98% nadsiarczan amonu)Sigma-AldrichA3678Przygotować 10% roztwór roboczy w ddH2O2O
TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina)Sigma-AldrichT9281
Akrylamid (40%)Sigma-AldrichA4058
Bis-akrylamid (2% m/v)Fisher BioReagentsBP1404-250
0.45 μFiltr strzykawkowy nylonowy 4 mmNalgene176-0045
FITCSigma-AldrichF4274
PDMS (polidimetylosiloksan)Dow Corning3097358-1004Zestaw elastomeru Sylgard 184 od Ellsworth Adhesives
szkiełka z 2 komoramiNUNC177380
Pluronic F108BASF30089186
Uszczelniacz do akwariówDow CorningDAP 00688
Fluormount-GSouthern Biotech0100-01
Jednorazowe kubki plastikowe
Szpatułki do badania gardła
Rękawiczki nitrylowe
Plastikowe pudełka na preparaty mikroskopowe
Wirówka do nanoszenia warstwWS-400B-6NPP/LITELaurell Technologies Corporation
Piec / Inkubator
Cyfrowa płyta grzejna
płytki 384-dołkoweMarka odpowiednia dla robota do mikroarrayów
Robot do drukowania macierzy mikroprzepływowych
Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy i fluorescencyjny
Skanery mikroarray AxonMolecular DevicesIstnieje wiele konfiguracji

Bibliografia

  1. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  2. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  3. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  4. LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
  5. Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
  6. Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
  7. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10(2010).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
  9. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37(2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Platforma MEArraykombinatoryczne mikro rodowiskapod o e z PDMSel poliakrylamidowydrukowanie mikromacierzyadhezja kom rektesty fluorescencyjneanaliza time lapsekom rki progenitorowe

Powiązane artykuły