Wytwarzanie i zastosowanie błon z błękitu bengalskiego i chitosanu w laserowej naprawie tkanek

Podsumowanie

Do naprawy tkanek podczas procedur chirurgicznych zazwyczaj niezbędne są szwy. Jednak ich stosowanie może być problematyczne, ponieważ są one inwazyjne i mogą uszkodzić tkankę. W niniejszym opracowaniu przedstawiono metody wytwarzania i aplikacji nowatorskiego kleju tkankowego. Ta folia adhezyjna jest aktywowana laserowo i nie wymaga stosowania szwów.

Streszczenie

Fotochemiczne łączenie tkanek (PTB) to bezszwowa technika naprawy tkanek, którą osiąga się poprzez naniesienie roztworu błękitu różowego (RB) pomiędzy dwa brzegi tkanek^1,2. Następnie są one naświetlane laserem, którego promieniowanie jest selektywnie absorbowane przez RB. Wynikające z tego reakcje fotochemiczne prowadzą prawdopodobnie do sieciowania włókien kolagenowych w tkance przy minimalnej emisji ciepła³. W niniejszym raporcie RB został włączony do cienkich błon chitozanowych w celu opracowania nowego, aktywowanego laserowo kleju tkankowego. Błony adhezyjne na bazie chitozanu zawierające ~0,1% masowych RB zostały wykonane i przyklejone do jelita cielęcego oraz nerwów piszczelowych szczura za pomocą lasera w stanie stałym (λ=532 nm, Fluence~110 J/cm², rozmiar plamki~0,5 cm). Do badania wytrzymałości wiązania użyto tensjometru jednokolumnowego połączonego z komputerem osobistym. Klej RB-chitozan silnie wiąże się z jelitem z wytrzymałością 15 ± 6 kPa (n=30). Wytrzymałość adhezji spada do 2 ± 2 kPa (n=30), gdy laser nie jest stosowany do aktywacji kleju. Anastomozę nerwów piszczelowych można również przeprowadzić bez użycia szwów. Opracowano nowy klej chitozanowy, który wiąże się z tkanką fotochemicznie i nie wymaga stosowania szwów.

Protokół

1. Przygotowanie kleju z chitozanu

1. Proszek chitozanu jest rozpuszczalny w roztworze kwasu octowego; aby przygotować roztwór zapasowy kwasu octowego (2% v/v), należy dodać 10 ml lodowatego kwasu octowego do 490 ml wody dejonizowanej (DI-H₂O).
2. Aby przygotować roztwór zapasowy błękitu różowego (Rose Bengal, RB) (0,01% w/v) w kwasie octowym, należy odważyć 5 mg RB do fiolki owiniętej folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu. Dodać 0,5 ml DI-H₂O w celu rozpuszczenia proszku, a następnie dodać 49,5 ml roztworu zapasowego kwasu octowego (opisanego w sekcji 1.1).
3. Aby przygotować roztwór chitozanu (1,7% w/v), należy odważyć 0,85 g proszku chitozanu (średnia masa cząsteczkowa, 85% stopień acetylacji) i dodać go do 50 ml roztworu RB w kwasie octowym. Grupę kontrolną przygotowano poprzez rozpuszczenie chitozanu w roztworze kwasu octowego bez dodatku RB.
4. Do mieszaniny chitozanu dodać mieszadło magnetyczne i mieszać w temperaturze pokojowej. Aby zapewnić całkowite rozpuszczenie składników, chitozan w kwasie octowym z RB należy mieszać przez dwa tygodnie, a chitozan w samym kwasie octowym przez 5 dni (kontrola). Po rozpuszczeniu chitozanu pH roztworu wzrasta z ~2,6 do ~3,9. Należy zauważyć, że RB jest słabo rozpuszczalny przy niskim pH i wymaga zwiększenia pH roztworu oraz wydłużonego czasu mieszania, aby się rozpuścić.
5. Roztwory wirować przy 3270 x g przez 1 hr i zebrać nadsącz, używając np. sterylnej strzykawki 10 ml. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu zanieczyszczeń. Na tym etapie roztwór zostaje oczyszczony z zanieczyszczeń makroskopowych i substancji nierozpuszczalnych.
6. Za pomocą sterylnej strzykawki nanieść (odwirowany) roztwór chitozanu na płaską płytkę z pleksiglasu. Grubość wysuszonej błony zależy od stosunku ilości naniesionego roztworu do powierzchni, na której został on rozprowadzony. Należy upewnić się, że roztwór jest wolny od pęcherzyków powietrza i równomiernie rozprowadzony na płytce. Aby uzyskać cienkie błony o grubości ~13 μm, należy nanieść ~1 ml roztworu na powierzchnię 12 cm² (wymiary ~3x4 cm, Rycina 1A).
7. Przykryć płytkę z pleksiglasu ekranem, np. z folii aluminiowej, aby zapobiec fotoblaknięciu roztworu. Należy zapewnić odpowiednią wentylację powietrza, aby umożliwić wyschnięcie roztworu pod ekranem.
8. Pozostawić roztwór do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (25 °C) i pod ciśnieniem atmosferycznym (1 atm), aż powstała błona stanie się nierozpuszczalna w wodzie i nie będzie makroskopowo pęcznieć. Zazwyczaj osiąga się to w ciągu 2 tygodni.
9. Ostrożnie oddzielić błony za pomocą cienkiej, płaskiej szpatułki; błony te można łatwo odkleić od płytki z pleksiglasu bez ich uszkodzenia.
10. Zmierzyć grubość błon za pomocą mikrometru.
11. Wyciąć klej w prostokątne paski za pomocą czystych, ostrych nożyczek i umieścić je między sterylnymi szkiełkami przedmiotowymi, aby zachować ich płaski kształt. Szkiełka owinąć folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej. Oznaczyć kleje z RB i bez RB odpowiednio jako „klej różowy” (rose adhesive) lub „klej chitozanowy” (chitosan adhesive).
12. Błony kleju różowego można sterylizować za pomocą etanolu (90%) lub promieniowaniem gamma (0,1 KGy/h przez 24 hr)^4,5.

2. Tłumienie optyczne kleju

1. Zamocuj klej różany wewnątrz kuwety kwarcowej.
2. Zarejestruj jego widmo tłumienia w zakresie 400 - 800 nm przy użyciu dwuwiązkowego spektrofotometru⁴.
3. Przyjmując ważność prawa Beera, oblicz długość tłumienia kleju według wzoru: I = I₀e^-Ax, gdzie I₀ to natężenie wiązki padającej, 1/A to długość tłumienia, a x to grubość filmu.
4. Powtórz kroki od 2.1 do 2.3 dla kleju z chitosanu, aby służył on jako kontrola.

3. Zastosowanie In Vitro: Laserowe łączenie tkanek jelita

1. Pobierz jelito cielęce natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia i przechowuj w temperaturze -80 °C.
2. Przed użyciem rozmroź i nawodnij tkankę, zanurzając ją w DI-H₂O na 10 min.
3. Podziel tkankę na sekcje (2 x 1 cm) za pomocą ostrza nr 10 pod mikroskopem operacyjnym (x10). Utrzymuj sekcje w stanie wilgotnym, używając DI-H₂O.
4. Zbliż do siebie krawędzie cięcia (stykając końce). Usuń nadmiar wody z powierzchni za pomocą patyczków bawełnianych.
5. Za pomocą mikropincety umieść pasek kleju rose (10 x 6 mm) w poprzek nacięcia na warstwie surowiczej, zapewniając pełny kontakt z jelitem (Rysunek 2).
6. Adhezja tkankowa kleju rose jest aktywowana przez laser półprzewodnikowy z pompowaniem diodowym, sprzężony z wielomodowym światłowodem (średnica rdzenia 200 μm)⁴.
7. Ustaw moc lasera na 180 mW i naświetlaj klej przez ~6 min przy średnicy plamki wiązki ~5 mm, stosując parametry wymienione w Tabeli 1. Naświetlaj klej punktowo, dbając o to, aby każdy punkt był naświetlany przez ~5 sekund przed przesunięciem wiązki na sąsiedni punkt. Procedura ta gwarantuje, że wiązka lasera wielokrotnie przeskanuje całą powierzchnię kleju.
8. Aby ocenić wytrzymałość wiązania tkanki, zamocuj próbkę w skalibrowanym jednokolumnowym tensjometrze (Instron, MA, USA) za pomocą uchwytów mechanicznych. Przesuwaj uchwyty z prędkością 22 mm/min aż do rozdzielenia dwóch końców tkanki⁴.
9. Nałóż klej rose na tkankę zgodnie z opisem w kroku 3.5. Nie naświetlaj próbki i zmierz wytrzymałość wiązania tkanki zgodnie z opisem w kroku 3.8. Próbka ta służy jako kontrola.

4. Zastosowanie in vivo: Anastomoza nerwu piszczelowego

1. Uśpij szczura linii Wistar mieszanką izofluranu/O₂ (4% podczas indukcji, 2% w dalszej części)⁵. Podaj podskórnie Buprenex (0,03 mg/kg), aby zapewnić przeciwbólowcze działanie śródoperacyjne i złagodzić ewentualny ból lub dyskomfort.
2. Następującą procedurę chirurgiczną należy przeprowadzić pod mikroskopem operacyjnym (x10). Wykonaj skośne nacięcie skóry o długości około 3 cm w części grzbietowo-bocznej prawego uda i odsłoń nerw piszczelowy, stosując technikę rozsuwania mięśni pośladkowych².
3. Częściowo odpreparuj i przytnij osłonkę nerwu piszczelowego za pomocą prostych mikronozyciór i odsącz nadmiar wody za pomocą sterylnej gazy lub patyczków bawełnianych.
4. Przetnij nerw piszczelowy mikronozyciorami.
5. Umieść sterylny pasek chitozanowy (wymiary 5 x 4 mm) pod nerwem piszczelowym za pomocą mikro-pincety.
6. Zbliż końce przeciętego nerwu koniec do końca za pomocą mikro-pincety nad klejącym paskiem rose.
7. Pasek całkowicie przylega do nerwu, tworząc kołnierz, który może ułatwić obrót nerwu podczas naświetlania paska laserem.
8. Aktywuj klej rose za pomocą lasera zgodnie z opisem w krokach 3.6) i 3.7).
9. Odtnij nadmiar kleju rose z kołnierza operowanego nerwu.
10. Zamknij mięśnie i skórę za pomocą pięciu szwów 3-0⁵.
11. Należy zastosować standardowe procedury rekonwalescencji pooperacyjnej, w tym codzienną kontrolę pod kątem rozszczepienia rany lub tworzenia się ropy oraz podawanie leków przeciwbólowych w razie potrzeby.

5. Reprezentatywne wyniki

Otrzymane błony mają jasnoróżowy kolor, są cienkie i posiadają gładką powierzchnię (Rycina 1). Są one również elastyczne i mogą być zwijane w rurki o małej średnicy bez powodowania rozdarć ani innych widocznych uszkodzeń (Rycina 1B). Różowe spoiwo wykazuje dwa piki absorpcji przy 530 i 562 nm; w związku z tym zielony laser jest silnie absorbowany przez spoiwo, a odpowiadająca mu długość tłumienia przy 532 nm wynosi ~12 μm (Rycina 3). W przeciwieństwie do tego, błony z chitozanu bez RB słabo tłumią laser (1/A ~162 μm), co prawdopodobnie wynika z rozpraszania. Z wykresu widm wynika, że w błonach nie dochodzi do znaczącej agregacji RB.

Klej różowy wiąże się trwale z jelitem po naświetleniu laserem (Rysunek 2), osiągając typowe maksymalne obciążenie w momencie zerwania wynoszące 0,9 ± 0,4 N (n=30). Wytrzymałość adhezyjną oszacowano jako maksymalne obciążenie podzielone przez powierzchnię klejenia, co wyniosło 15 ± 6 kPa (n=30). Klej różowy nienaświetlony wiązał się z tkanką znacznie słabiej (2 ± 2 kPa, n=30, nieparzysty test t p<10⁶). Anastomoza nerwu piszczelowego in-vivo została pomyślnie wykonana po zastosowaniu i związaniu kleju różowego przy użyciu zielonego lasera. Tydzień po operacji nerw poddany zabiegowi zachował ciągłość, a wytrzymałość naprawy wynosiła 17 ± 9 kPa (n=10).

Rycina 1. A) Roztwór RB-chitosan jest odlewany na płaską płytkę z Perspexu (grubość płytki ~5 mm). Pod płytką umieszczono papier milimetrowy, aby ułatwić etap odlewania na sucho. Nierozpuszczalna w wodzie błona powstaje dwa tygodnie po odlewaniu. B) Klej różany jest elastyczny i może być zwinięty w mały cylinder.

Rycina 2. Klej różany jest związany z jelitem cielęcym po naświetlaniu laserem. Podczas wiązania tkanki stosuje się jednorodne naświetlanie kleju RB; jednak na tym zdjęciu pokazano wybrane punkty, aby zilustrować efekt fotowybielania laserem w kleju.

Rysunek 3. Widmo absorpcyjne (w jednostkach umownych) różowego kleju wykazuje dwa piki przy 530 i 562 nm. W związku z tym zielony laser (λ= 532 nm) jest silnie absorbowany przez klej podczas naświetlania laserem. Klej chitozanowy bez RB słabo absorbuje wiązkę lasera.

	n	Powierzchnia (mm2)	Moc (W)	Czas (s)	Fluencja (J/cm2)	I (W/cm2)	Maks. obciążenie/Powierzchnia (kPa)
Klej+Laser	30	60 ± 10	0.18 ± 0.03	365 ± 5	~110	~0.9	15 ± 1
Klej	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tabela 1. Legenda. n, liczba próbek; Area, powierzchnia kleju z róży (średnia ± błąd maksymalny); Power, moc lasera (średnia ± błąd maksymalny); Time, czas naświetlania (średnia ± błąd maksymalny); Fluence, średnia fluencja lasera; I, szacowane natężenie promieniowania; Max Load/Area, maksymalne obciążenie przy zerwaniu naprawionej tkanki podzielone przez powierzchnię kleju, (średnia ± SE).

Dyskusja

Wytwarzanie kleju różanego opiera się na prostym procesie odlewania na sucho, choć rozpuszczanie RB w niskim pH wymaga przedłużonego mieszania roztworu chitosanowego. Ważne jest, aby pozwolić roztworowi wyschnąć do momentu, gdy stanie się on nierozpuszczalną w wodzie błoną. Dzieje się to, gdy masowa zawartość wody w wysuszonej błonie wynosi ~10%⁶. Błony nierozpuszczalne otrzymuje się zazwyczaj 2 tygodnie po odlewaniu na sucho w standardowych warunkach temperatury i ciśnienia (~25 °C i ~1 atm). Mechanizm wiązan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bengała różowa	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitozan (średnia MW)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Kwas octowy lodowaty	Sigma-Aldrich	08050051	2% v/v w wodzie DI
Mieszadło magnetyczne	Heidolph	MR Hei-Mix S
Wirówka	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Spektrofotometr	Varian Inc., Agilent	Cary 4000 UV-Visible
Laser	CNI Laser	MGL-532
Mikrometr	Mitutoyo	Series 227
Mikroskop chirurgiczny	Carl Zeiss, Inc.	OPMI