Artykuł metodologiczny

Bezsoczewkowa mikroskopia tomograficzna na chipie wykorzystująca oświetlenie pod wieloma kątami i superrozdzielczość pikseli

DOI:

10.3791/4161

⸱

16 sierpnia 2012

 ,  , 
1Electrical Engineering Department, University of California, Los Angeles , 2Bioengineering Department, University of California, Los Angeles , 3California NanoSystems Institute, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia optyczna bez soczewek to trójwymiarowa technika mikroskopowa, która oferuje rozdzielczość przestrzenną <1 μm × <1 μm × <3 μm w wymiarach x, y i z, odpowiednio, na dużej objętości obrazowania 15-100 mm3, co może być szczególnie przydatne do integracji z platformami lab-on-a-chip.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie tomograficzne jest szeroko stosowanym narzędziem w medycynie, ponieważ może dostarczyć trójwymiarowych (3D) informacji strukturalnych dotyczących obiektów o różnych skalach wielkości. W skalach mikrometrycznych i milimetrowych mikroskopia optyczna znajduje coraz większe zastosowanie ze względu na niejonizujący charakter światła widzialnego oraz dostępność bogatego zestawu źródeł oświetlenia (takich jak lasery i diody elektroluminescencyjne) oraz elementów detekcyjnych (takich jak wielkoformatowe matryce detektorów CCD i CMOS). Do ostatnio opracowanych metod mikroskopii tomograficznej można zaliczyć optyczną tomografię koherentną, optyczną tomografię dyfrakcyjną, optyczną tomografię projekcyjną i mikroskopię świetlną. 1-6 Platformy te umożliwiają obrazowanie przekrojowe komórek, mikroorganizmów i zwierząt modelowych, takich jak C. elegans, danio pręgowany i zarodki myszy.

Istniejące optyczne kamery 3D zazwyczaj mają stosunkowo obszerne i skomplikowane architektury, co ogranicza dostępność tych urządzeń do zaawansowanych laboratoriów i utrudnia ich integrację z platformami lab-on-a-chip i układami mikroprzepływowymi. Aby zapewnić alternatywny mikroskop tomograficzny, opracowaliśmy niedawno bezsoczewkową tomografię optyczną (LOT) jako wysokowydajną, kompaktową i ekonomiczną metodę tomografii optycznej. 7 LOT rezygnuje z używania soczewek i nieporęcznych elementów optycznych, a zamiast tego polega na oświetleniu pod wieloma kątami i obliczeniach cyfrowych, aby uzyskać obrazowanie mikroobiektów z rozdzielczością głębi na dużej objętości obrazu. LOT może obrazować próbkę biologiczną w rozdzielczości przestrzennej <1 μm x <1 μm x <3 μm w wymiarach x, y i z, odpowiednio, na dużej objętości obrazowania 15-100mm3 i może być szczególnie przydatny w platformach lab-on-a-chip.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ustawienia obrazowania

LOT może być zmontowany w kompaktowej i lekkiej architekturze przenośnej 8, a alternatywnie jako mikroskop optofluidyczny z możliwością obrazowania przekrojowego. 9 W niniejszym raporcie opiszemy jednak podstawową konfigurację obrazowania dla wdrożenia laboratoryjnego w kierunku tomografii próbek statycznych.

  1. Moduł oświetlenia: W LOT-ie można wykorzystać częściowo koherentne źródła światła, takie jak diody elektroluminescencyjne (LED). Do eksperymentalnej elastyczności użyliśmy monochromatora z lampą ksenonową (Cornerstone T260, Newport Corp.). Monochromator został dostosowany tak, aby zapewnić wyjście o szerokości widmowej ~1-10 nm wokół środkowej długości fali np. 450-650 nm. Ten częściowo koherentny sygnał wyjściowy jest następnie sprzężony z światłowodem wielomodowym (Thorlabs AFS105/125Y) w celu dostarczenia częściowo spójnego światła do systemu.
    Światłowód jest zamontowany na zmotoryzowanym stopniu obrotowym (Thorlabs PRM-1Z8 napędzany przez sterownik Thorlabs TDC001) w celu zmiany kąta świecenia. Stopień zmotoryzowany, z dołączonym źródłem światła, jest zamontowany na dwuwymiarowym liniowym stoliku X-Y (Newport ILS50CC napędzany sterownikami Newport MFA-PPD), który służył do uzyskiwania przesunięć źródła światła w płaszczyźnie pod zadanym kątem.
  2. Wykrywanie: Tomografia optyczna bez soczewek jest skalowalną technologią, dzięki której układ detektorów można wybrać zgodnie z wymaganiami aplikacji bez znaczącej zmiany etapów akwizycji obrazu lub przetwarzania danych. W tym raporcie zastosowaliśmy matrycę matryc CMOS o rozdzielczości 5 megapikseli i rozmiarze piksela 2,2 μm (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Detektor służy do rejestracji szerokiego pola widzenia (np. 24mm2) obrazów holograficznych próbek, które zostały umieszczone bezpośrednio na górze obszaru aktywnego detektora. Jeśli ma być zaimplementowany dwuosiowy układ tomografii 7, detektor powinien być również zamontowany na poziomym (względem stołu optycznego) stopniu obrotu (np. Thorlabs RP-01) w celu obracania próbki (wraz z detektorem) w płaszczyźnie prostopadłej do osi wzrokowej. 7

2. Przygotowanie próbki

Chociaż tomografia optyczna bez soczewek może obrazować różne obiekty, takie jak komórki i mikroorganizmy, zilustrujemy podstawowe zasady, wykonując trójwymiarową mikroskopię próbki C. elegans.

  1. Za pomocą skalpela lub szpatułki weź mały kawałek agaru z szalki Petriego zawierającej kulturę C. elegans. Sześcienny kawałek o długości kilku milimetrów wzdłuż każdego wymiaru będzie zawierał setki nicieni.
  2. Umieść mały kawałek agaru w polipropylenowej fiolce zawierającej 1 ml wody dejonizowanej (DI).
  3. Delikatnie wiruj przez 0,5-1 minuty i odczekaj 10-15 minut, aż robaki wypełzną z kawałka agaru do wody DI.
  4. W celu czasowego unieruchomienia robaków należy dodać 1 ml 5-10 mM roztworu lewamizolu (Sigma-Aldrich) i odczekać 10 minut.
  5. Pobrać pipetę od 5 do 10 μl próbki z dna fiolki i umieścić między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Próbka ta, zawierająca dużą liczbę tymczasowo unieruchomionych robaków (np. 50-100 robaków), może zostać umieszczona na detektorze w celu rozpoczęcia akwizycji danych.

3. Akwizycja danych

Tutaj podsumowujemy kroki akwizycji obrazu dla typowego eksperymentu LOT, który został zautomatyzowany za pomocą specjalnie opracowanego interfejsu LabView.

  1. Dostosuj początkowy kąt obrotu stage do -50 °, gdzie 0° odpowiada pionowemu położeniu źródła światła.
  2. Ustaw początkową pozycję X-Y stage na (0,0), co jest pozycją HOME.
  3. Dostosuj czas naświetlania detektora, aby jak najlepiej wykorzystać jego zakres dynamiczny, tak aby obraz był jak najjaśniejszy bez nasyconych pikseli.
  4. Nie zmieniając kąta obrotu stolika, zrób 9 zdjęć. Dla każdego obrazu przesuń stolik X-Y w nowe miejsce w kwadratowej siatce 3x3, tak aby każdy obraz przesunął się o około jedną czwartą piksela w porównaniu z poprzednim. Uzyskanie większej liczby obrazów pod każdym kątem, np. w siatce 6 μ6, może poprawić rozdzielczość w zależności od rodzaju obiektu i stosunku sygnału do szumu (SNR). 10
  5. Ustaw początkową pozycję X-Y stage na (0,0), co jest pozycją HOME.
  6. Zwiększaj kąt obrotu stage o 2°, aż do osiągnięcia +50°. Po każdym zwiększeniu, tj. przy każdym nowym kącie, powtórz kroki 3-5. Przyrosty kątowe mogą być drobniejsze lub grubsze w zależności od optymalizacji czasu akwizycji w porównaniu z rozdzielczością obrazowania.
  7. (Opcjonalny krok, jeśli ma być wykorzystany schemat tomografii dwuosiowej) Obróć stolik poziomy, na którym zamontowany jest detektor, o 90°. Następnie powtórz kroki 1-6.

4. Analiza danych

Postępując zgodnie z krokami 1-6 w sekcji 3, uzyskuje się zestaw 459 obrazów, który zawiera 9 subpikselowych przesuniętych obrazów dla każdego z 51 różnych kątów oświetlenia. Po pierwsze, każdy zestaw 9 obrazów jest przetwarzany cyfrowo przy użyciu algorytmów superrozdzielczości pikseli 10, w celu uzyskania jednego hologramu projekcyjnego o wysokiej rozdzielczości (HR) dla każdego kąta. Należy zauważyć, że superrozdzielczość pikseli odnosi się do pokonywania ograniczenia rozmiaru piksela, a nie limitu dyfrakcji, w rozdzielczości przestrzennej obrazów bez obiektywu. Hologramy pikselowe o superrozdzielczości są następnie rekonstruowane cyfrowo w proporcjach 7-10 w celu uzyskania 51 obrazów projekcyjnych. Ten zestaw 51 obrazów projekcyjnych jest następnie rzutowany wstecznie za pomocą TomoJ, wtyczki do ImageJ (oprogramowania do analizy obrazów typu open source). 11 Ta operacja projekcji wstecznej powoduje uzyskanie trójwymiarowego obrazu (tomogramów) próbki. Chociaż nie jest to tutaj zaimplementowane, schemat tomografii dwuosiowej może być również wykorzystany zgodnie z opisem w ref. 7. W tym schemacie drugi zestaw tomogramów uzyskuje się poprzez obrócenie źródła światła wzdłuż osi prostopadłej w stosunku do pierwszej osi obrotu, co zapewnia więcej informacji przestrzennych dotyczących próbki i poprawia rozdzielczość osiową.

5. Reprezentatywne wyniki

Duże pole widzenia (FOV) tomografii optycznej bez soczewek jest pokazane na rysunku 1. Ponieważ próbka jest umieszczana bezpośrednio na górze matrycy detektora, holograficzne obrazy obiektów mogą być rejestrowane w polu widzenia 24 mm2, które można dodatkowo zwiększyć za pomocą pojawiających się matryc detektorów o większych obszarach aktywnych.

Chociaż rozmiar piksela matrycy detektora ogranicza rozdzielczość rejestrowanych obrazów holograficznych, techniki superrozdzielczości pikseli łagodzą ten problem. Rysunek 2 przedstawia hologramy o nadwysokiej rozdzielczości pikseli wraz ze zrekonstruowanymi obrazami (tj. obrazami projekcyjnymi), które oferują submikrometrową rozdzielczość przestrzenną dla trzech różnych kątów oświetlenia.

Obrazy projekcyjne mogą być łączone za pomocą technik rekonstrukcji obrazu tomograficznego (np. filtrowanej projekcji wstecznej) w celu obliczenia tomogram (tj. trójwymiarowych obrazów) próbki. Rysunek 3 pokazuje trzy obrazy przekroju w płaszczyźnie x-y przechodzącej przez przednią część robaka, gdzie rurka gardłowa jest widoczna tylko w przekroju przez z=8 μm, jak można się spodziewać po tej z grubsza cylindrycznej strukturze o średnicy zewnętrznej ~5 μm. Co więcej, obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie x-z (wstawka na górnym panelu rysunku 3) wyraźnie pokazuje granice robaka i rurki gardłowej wewnątrz (wskazanej strzałkami), demonstrując udane obrazowanie 3D gardła.

figure-protocol-1
Rysunek 1 przedstawia obraz holograficzny o pełnym polu widzenia (24mm2) zarejestrowany przy użyciu zestawu tomografii optycznej bez soczewek (LOT) do oświetlenia pionowego. Ze względu na duży obszar obrazowania LOT-u, wiele robaków może być obrazowanych jednocześnie w jednym kroku akwizycji danych.

figure-protocol-2
Rysunek 2 przedstawia hologramy o superrozdzielczości pikseli (lewy panel) oraz cyfrowo zrekonstruowane obrazy projekcyjne (prawy panel) robaka C. elegans (wykadrowanego z dużego pola widzenia) pod trzema różnymi kątami oświetlenia. Każdy obraz projekcyjny zawiera informacje dotyczące innego kąta patrzenia, co umożliwia obliczenie struktury 3D za pomocą przefiltrowanej operacji projekcji wstecznej.

figure-protocol-3
Rysunek 3 przedstawia tomogramy obliczeniowe dla robaka C. elegans z rysunku 2. (Górny rząd) pokazuje wycinek całego robaka w z=3 μm. Wstawka przedstawia obraz przekroju poprzecznego z przodu robaka. Podziałka skali wstawki wynosi 50 μm. (Dolny rząd) Pokazuje trzy obrazy przekrojowe przez przednią część robaka, demonstrując zdolność tomografii optycznej bez soczewek do cięcia. Strzałki na całej figurze wskazują ten sam punkt na cewce gardłowej robaka. Obraz mikroskopowy (x40, 0,65-NA) jest również dostępny do porównania wizualnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Należy podkreślić, że unikalna geometria mikroskopii holograficznej bez soczewek na chipie jest kluczowym czynnikiem umożliwiającym uzyskanie superrozdzielczości pikseli i obrazowania tomograficznego. Ponieważ zakłada się, że zarejestrowane obrazy nie są obrazami projekcyjnymi, jak w przypadku niekoherentnych podejść do obrazowania kontaktowego 12, ale hologramami projekcyjnymi, dyfrakcja przepuszczanego światła aż do momentu uderzenia w detektor może być cyfrowo skorygowana przez rekonstrukcję hologr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Liniowe stopnie X-Y NewportCorp.MFA-PPMiniaturowy stolik liniowy
Zmotoryzowany stopień obrotowyThorlabsPRM1Z8Zmotoryzowany precyzyjny montaż obrotowy
Światłowód wielomodowyThorlabsAFS105 / 125YWielomodowe źródło
światłaświatłowodowego Newport Corp.6255Monochromator lampy ksenonowej bez ozonu
Newport Corp.74100Cornerstone 260 1/4 m Monochromator CMOS
Aptina Inc.MT9P031STC5-megapikselowa matryca CMOS
C. elegans próbkaCarolina Biosupply173500Typ dziki C. elegans
LevamisoleSigma AldrichL9756-5GChlorowodorek tetramizolu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  3. Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
  4. Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
  5. Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009(2008).
  6. Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
  7. Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
  8. Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
  9. Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109(2011).
  10. Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
  11. Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).
  12. Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezosobnikowa tomografia optycznatomografia on chipholograficzna akwizycja obrazuprzesuni cie subpikselowerekonstrukcja cyfrowaobrazowanie tomograficznematryca czujnik w CMOSzmotoryzowany st obrotowy

Powiązane artykuły