Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną <1 μm × <1 μm × <3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie tomograficzne jest szeroko stosowanym narzędziem w medycynie, ponieważ pozwala na uzyskanie trójwymiarowych (3D) informacji strukturalnych o obiektach o różnych skalach wielkości. W skalach mikrometrycznej i milimetrowej coraz częściej wykorzystuje się metody mikroskopii optycznej ze względu na niejonizujący charakter światła widzialnego oraz dostępność bogatego zestawu źródeł oświetlenia (takich jak lasery i diody elektroluminescencyjne) oraz elementów detekcyjnych (takich jak matryce detektorów CCD i CMOS o dużym formacie). Do niedawno opracowanych metod optycznej mikroskopii tomograficznej można zaliczyć optyczną tomografię koherencyjną, optyczną tomografię dyfrakcyjną, optyczną tomografię projekcyjną oraz mikroskopię arkusza światła. 1-6 Platformy te umożliwiają obrazowanie przekrojowe komórek, mikroorganizmów i zwierząt modelowych, takich jak C. elegans, danio pręgowany oraz embriony mysie.
Istniejące trójwymiarowe obrazowniki optyczne zazwyczaj posiadają stosunkowo masywną i złożoną architekturę, co ogranicza dostępność tego sprzętu do zaawansowanych laboratoriów i utrudnia jego integrację z platformami typu lab-on-a-chip oraz chipami mikroprzepływowymi. Aby zapewnić alternatywny mikroskop tomograficzny, opracowaliśmy niedawno bezsoczewkową tomografię optyczną (LOT) jako wysokoprzepustową, kompaktową i opłacalną kosztowo metodę tomografii optycznej. 7 LOT rezygnuje z użycia soczewek i masywnych komponentów optycznych, polegając zamiast tego na wielokątowym oświetleniu i obliczeniach cyfrowych w celu uzyskania obrazowania mikroobiektów z rozdzielczością głębokości w dużej objętości obrazowania. LOT pozwala na obrazowanie preparatów biologicznych z rozdzielczością przestrzenną <1 μm x <1 μm x <3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, w dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie przydatne dla platform lab-on-a-chip.
Protokół
1. Konfiguracja obrazowania
LOT może być zbudowany w kompaktowej i lekkiej architekturze przenośnej 8 lub alternatywnie jako mikroskop optofluidyczny z możliwością obrazowania przekrojowego. 9 W niniejszym raporcie opiszemy jednak podstawowy układ obrazowania w implementacji laboratoryjnej do tomografii próbek statycznych.
- Moduł oświetlenia: W LOT można wykorzystać częściowo koherentne źródła światła, takie jak diody emitujące światło (LED). Dla zapewnienia elastyczności eksperymentalnej zastosowaliśmy monochromator z lampą ksenonową (Cornerstone T260, Newport Corp.). Monochromator został dostrojony tak, aby zapewnić sygnał wyjściowy o szerokości spektralnej ~1-10 nm wokół długości fali centralnej, np. 450-650 nm. Ten częściowo koherentny sygnał jest następnie sprzęgany z wielomodowym światłowodem (Thorlabs AFS105/125Y), aby dostarczyć częściowo koherentne światło do układu.
Światłowód jest zamontowany na zmotoryzowanym stole obrotowym (Thorlabs PRM-1Z8 sterowanym przez kontroler Thorlabs TDC001) w celu zmiany kąta oświetlenia. Zmotoryzowany stół wraz z przymocowanym źródłem światła jest zamontowany na dwuwymiarowym stole liniowym X-Y (Newport ILS50CC sterowanym przez kontrolery Newport MFA-PPD), który służył do uzyskania przesunięć źródła światła w płaszczyźnie przy danym kącie. - Detekcja: Bezoptyczna tomografia optyczna jest technologią skalowalną, dzięki czemu macierz detektora może być dobrana zgodnie z wymaganiami aplikacji bez znaczącej zmiany etapów akwizycji obrazów lub przetwarzania danych. W niniejszym raporcie zastosowaliśmy macierz czujników CMOS o rozdzielczości 5 Mega Pixels i rozmiarze piksela 2.2 μm (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Detektor służy do rejestracji obrazów holograficznych próbek o szerokim polu widzenia (np. 24 mm2), które były umieszczane bezpośrednio na górnej powierzchni obszaru aktywnego detektora. W przypadku implementacji układu tomografii dwuosiowej 7, detektor powinien być również zamontowany na poziomym (względem stołu optycznego) stole obrotowym (np. Thorlabs RP-01), aby obracać próbkę (wraz z detektorem) w płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej. 7
2. Przygotowanie próbek
Choć bezsoczewkowa tomografia optyczna pozwala na obrazowanie różnych obiektów, takich jak komórki i mikroorganizmy, zilustrujemy jej podstawowe zasady, wykonując mikroskopię trójwymiarową próbki C. elegans.
- Za pomocą skalpela lub szpatułki pobierz mały fragment agaru z szalki Petri zawierającej hodowlę C. elegans. Sześcian o boku kilku milimetrów będzie zawierał setki nicieni.
- Umieść mały kawałek agaru w probówce polipropylenowej zawierającej 1 ml wody dejonizowanej (DI).
- Delikatnie mieszaj na wortexie przez 0,5-1 min i odczekaj 10-15 min, aż nicienie wypełzną z fragmentu agaru do wody DI.
- Aby tymczasowo unieruchomić nicienie, dodaj 1 ml 5-10 mM roztworu lewamisolu (Sigma-Aldrich) i odczekaj 10 min.
- Pobierz pipetą 5-10 μl próbki z dna probówki i umieść ją pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Próbkę tę, zawierającą dużą liczbę tymczasowo unieruchomionych nicieni (np. 50-100 osobników), można umieścić na detektorze, aby rozpocząć akwizycję danych.
3. Pozyskiwanie danych
W niniejszym rozdziale podsumowujemy etapy akwizycji obrazów dla typowego eksperymentu LOT, który został zautomatyzowany przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu LabView.
- Ustaw kąt początkowy stolika obrotowego na -50 °, gdzie 0° odpowiada pozycji pionowej źródła światła.
- Ustaw pozycję początkową stolika X-Y na (0,0), co stanowi pozycję domyślną (HOME).
- Dostosuj czas ekspozycji detektora w celu optymalnego wykorzystania jego zakresu dynamicznego, tak aby obraz był jak najjaśniejszy, ale bez nasyconych pikseli.
- Bez zmiany kąta stołu obrotowego należy zarejestrować 9 obrazów. Dla każdego obrazu przesuń stół X-Y do nowej pozycji w siatce kwadratowej 3x3 w taki sposób, aby każdy obraz był przesunięty o około jedną czwartą piksela w stosunku do poprzedniego. Pozyskanie większej liczby obrazów pod każdym kątem, np. w 6μsiatka 6, co może poprawić rozdzielczość w zależności od rodzaju obiektu i stosunku sygnału do szumu (SNR). 10
- Ustaw pozycję początkową stolika X-Y na (0,0), co odpowiada pozycji domyślnej (HOME).
- Zwiększaj kąt stołu obrotowego w odstępach wynoszących 2°, aż do osiągnięcia +50°Po każdym przyroście, t. j. Przy każdym nowym kącie powtórz kroki 3–5. Przyrosty kątowe mogą być mniejsze lub większe, w zależności od optymalizacji czasu akwizycji względem rozdzielczości obrazowania.
- (Krok opcjonalny w przypadku zastosowania schematu tomografii dwuosiowej) Obrócić poziomy stół, na którym zamontowany jest detektor, o 90°Następnie powtórzyć kroki 1–6.
4. Analiza danych
Po wykonaniu kroków 1–6 opisanych w sekcji 3, pozyskiwany jest zestaw 459 obrazów, który zawiera 9 obrazów przesuniętych o ułamek piksela dla każdego z 51 różnych kątów oświetlenia. Najpierw każdy zestaw 9 obrazów jest przetwarzany cyfrowo przy użyciu algorytmów super-rozdzielczości pikselowej 10, aby uzyskać jeden hologram projekcyjny o wysokiej rozdzielczości (HR) na każdy kąt. Należy zauważyć, że super-rozdzielczość pikselowa odnosi się do pokonania ograniczeń wynikających z rozmiaru piksela, a nie z limitu dyfrakcyjnego, w zakresie rozdzielczości przestrzennej obrazów bezsoczewkowych. Hologramy o super-rozdzielczości pikselowej są następnie rekonstruowane cyfrowo 7-10 w celu uzyskania 51 obrazów projekcyjnych. Ten zestaw 51 obrazów projekcyjnych jest następnie poddawany retrospekcji (back-projection) za pomocą TomoJ, wtyczki do programu ImageJ (otwartego oprogramowania do analizy obrazów). 11 Operacja retrospekcji generuje trójwymiarowy obraz (tomogramy) próbki. Chociaż nie zostało to tutaj zaimplementowane, można by również wykorzystać schemat tomografii dwuosiowej, jak opisano w ref. 7. W tym schemacie drugi zestaw tomogramów uzyskuje się poprzez obrót źródła światła wzdłuż osi ortogonalnej względem pierwszej osi obrotu, co dostarcza więcej informacji przestrzennych o próbce i poprawia rozdzielczość osiową.
5. Reprezentatywne wyniki
Duże pole widzenia (FOV) bezsoczewkowej tomografii optycznej przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ próbka jest umieszczana bezpośrednio na górnej powierzchni matrycy detektora, obrazy holograficzne obiektów mogą być rejestrowane w polu FOV o powierzchni 24 mm2, które może zostać dodatkowo zwiększone dzięki nowym matrycom detektorów o większych obszarach aktywnych.
Choć rozmiar piksela matrycy detektora ogranicza rozdzielczość rejestrowanych obrazów holograficznych, techniki super-rozdzielczości pikselowej pozwalają zniwelować ten problem. Rycina 2 przedstawia hologramy o zwiększonej rozdzielczości pikselowej wraz z obrazami zrekonstruowanymi (t.j. obrazami projekcyjnymi), które oferują podmikrometrową rozdzielczość przestrzenną dla trzech różnych kątów oświetlenia.
Obrazy projekcyjne można połączyć, stosując techniki tomograficznej rekonstrukcji obrazu (np. filtrowaną projekcję wsteczną), aby obliczyć tomogramy (t.j. obrazy trójwymiarowe) preparatu. Rysunek 3 przedstawia trzy obrazy przekrojów w płaszczyźnie x-y przez przednią część nicienia, gdzie rurka gardzielowa jest widoczna tylko w przekroju przez z=8 μm, co jest spodziewane w przypadku tej w przybliżeniu cylindrycznej struktury o średnicy zewnętrznej ~5 μm. Ponadto obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie x-z (wstawka w górnym panelu Rysunku 3) wyraźnie pokazuje granice nicienia oraz znajdującą się wewnątrz rurkę gardzielową (wskazaną strzałkami), co potwierdza pomyślne obrazowanie trójwymiarowe gardzieli.
Rycina 1 przedstawia pełny obraz holograficzny pola widzenia (24 mm2) zarejestrowany przy użyciu zestawu do bezsoczewkowej tomografii optycznej (LOT) z oświetleniem pionowym. Dzięki dużej powierzchni obrazowania LOT, wiele nicieni można obrazować jednocześnie w jednym kroku akwizycji danych.
Rycina 2 przedstawia hologramy o super-rozdzielczości pikselowej (lewy panel) oraz cyfrowo zrekonstruowane obrazy projekcyjne (prawy panel) dla nicienia C. elegans (wycinek z szerokiego pola widzenia) przy trzech różnych kątach oświetlenia. Każdy obraz projekcyjny zawiera informacje dotyczące innego kąta widzenia, co umożliwia obliczenie struktury 3D poprzez operację filtrowanej projekcji wstecznej.
Rycina 3 przedstawia obliczone tomogramy nicienia C. elegans z Ryciny 2. (Górny rząd) pokazuje obraz przekroju całego nicienia przy z=3 μm. Wstawka przedstawia obraz przekroju poprzecznego przedniej części nicienia. Pasek skali na wstawce wynosi 50 μm. (Dolny rząd) przedstawia trzy obrazy przekrojów przez przednią część nicienia, demonstrując zdolność do sekcjonowania optycznego w bezsoczewkowej tomografii optycznej. Strzałki na całej rycinie wskazują ten sam punkt na rurce gardłowej nicienia. Do porównania wizualnego dołączono również obraz mikroskopowy (x40, 0.65-NA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ważne jest podkreślenie, że unikalna geometria bezsoczewkowej holograficznej mikroskopii na chipie jest kluczowym czynnikiem umożliwiającym uzyskanie superrozdzielczości pikselowej oraz obrazowania tomograficznego. Ponieważ rejestrowane obrazy nie są traktowane jako obrazy projekcyjne, jak w podejściach do niespójnego obrazowania kontaktowego 12, lecz jako hologramy projekcyjne, dyfrakcja światła przechodzącego aż do momentu uderzenia w detektor może zostać cyfrowo skorygowana poprzez rekonstrukcję ho...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Liniowe stoliki X-Y | Newport Corp. | MFA-PP | Miniaturowy stolik liniowy |
| Zmotoryzowany stolik obrotowy | Thorlabs | PRM1Z8 | Zmotoryzowany precyzyjny uchwyt obrotowy |
| Wielomodowe światłowody optyczne | Thorlabs | AFS105/125Y | Światłowód wielomodowy |
| Źródło światła | Newport Corp. | 6255 | Bezozonowa lampa ksenonowa |
| Monochromator | Newport Corp. | 74100 | Monochromator Cornerstone 260 1/4 m |
| Matryca sensorów CMOS | Aptina Inc. | MT9P031STC | Sensor CMOS 5 megapikseli |
| Próbka C. elegans | Carolina Biosupply | 173500 | Dziki typ C. elegans |
| Lewamizol | Sigma Aldrich | L9756-5G | Wodorochlorek tetramizolu |
Bibliografia
- Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. Quant. Elect. 5, 1205-1215 (1999).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging. Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).
- Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples. Meas. Sci. Technol. 19, 074009(2008).
- Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba. Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip. Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. Field-portable Lensfree Tomographic Microscope. Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).
- Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. Optofluidic tomography on a chip. App. Phys. Lett. 98, 161109(2011).
- Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution. Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).
- Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).
- Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip. Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
