Artykuł metodologiczny

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

13.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4166

⸱

15 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  , 
1Infectious Disease Research Center, CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Streszczenie

Plasmodium falciparum, czynnik etiologiczny najgroźniejszej postaci malarii, oraz ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) należą do najważniejszych problemów zdrowotnych na świecie, przyczyniając się łącznie do 4 milionów zgonów rocznie1. Ze względu na szerokie występowanie obu tych patogenów w regionach rozwijających się, szczególnie w Afryce Subsaharyjskiej, koinfekcje malarią i HIV-1 są powszechne, jednak wzajemne oddziaływanie tych dwóch chorób jest słabo poznane. Raporty epidemiologiczne sugerują, że zakażenie malarią przejściowo nasila replikację HIV-1 i zwiększa wiremię HIV-1 u osób z koinfekcją2,3. Ponieważ poziom wiremii pozostaje wysoki przez kilka tygodni po leczeniu przeciwmalarycznym, zjawisko to może mieć wpływ na progresję choroby oraz jej transmisję.

Komórkowe mechanizmy immunologiczne leżące u podstaw tych obserwacji były dotychczas słabo zbadane. Nieliczne badania in vitro analizujące wpływ malarii na HIV-1 wykazały, że ekspozycja na rozpuszczalne antygeny malaryczne może zwiększać infekcję i reaktywację HIV-1 w komórkach odpornościowych. Jednakże w badaniach tych wykorzystano całkowite ekstrakty komórkowe pasożytów P. falciparum w stadium schizontów oraz mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC), co utrudnia określenie, który komponent (lub komponenty) malarii odpowiadał za zaobserwowane efekty i jakie były docelowe komórki gospodarza4,5. Niedawne prace wykazały, że ekspozycja niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów na pigment malaryczny hemozoinę zwiększała ich zdolność do przekazywania HIV-1 komórkom T CD4+6,7, ale jednocześnie zmniejszała infekcję makrofagów przez HIV-18. Aby wyjaśnić ten złożony proces, niezbędna jest systematyczna analiza oddziaływań między pasożytem malarii a HIV-1 w różnych istotnych populacjach pierwotnych komórek ludzkich.

Opisano kilka technik badawczych służących do analizy wpływu HIV-1 na fagocytozę mikroorganizmów oraz wpływu takich patogenów na replikację HIV-1. Przedstawiamy tutaj metodę badania wpływu erytrocytów zakażonych P. falciparum na replikację HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Wpływ ekspozycji na pasożyta na zdarzenia transkrypcyjne i translacyjne HIV-1 monitoruje się przy użyciu pseudotypowanych wirusów jednocyklowych, w których gen reporterowy lucyferazy zastąpił gen Env, natomiast wpływ na ilość wirusa uwalnianego przez zakażone makrofagi określa się poprzez pomiar białka kapsydu p24 HIV-1 za pomocą testu ELISA w supernatantach komórkowych.

Protokół

Uwaga: Eksperymenty z HIV-1 oraz Plasmodium falciparum muszą być przeprowadzane w laboratoriach o odpowiednim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL2 dla pasożytów oraz BSL3 dla HIV-1 i koinfekcji), a przy użyciu potencjalnie zainfekowanej krwi ludzkiej należy zachować szczególne środki ostrożności.

1. Oczyszczanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) (na podstawie 8 i 9)

  1. Rozpocząć od świeżej krwi ludzkiej od zdrowych dawców (500 ml) traktowanej przeciwkrzepliwymi (heparyną, cytrynianem, kwasem cytrynianowo-dekstrozowym lub cytrynianowo-fosforanowo-dekstrozowym). Podczas oczyszczania i izolacji PBMC oraz w pozostałej części protokołu należy stosować odczynniki wolne od endotoksyn.
  2. Zdezynfekować worek z krwią, w tym rurkę, 70% etanolem, odciąć rurkę i ostrożnie przenieść krew do kolby T150.
  3. Przygotować 16 probówek stożkowych o pojemności 50 ml, wlewając do każdej 15 ml Medium do Separacji Limfocytów (Ficoll) (należy upewnić się, że Ficoll osiągnął temperaturę pokojową). Ostrożnie nanieść na wierzch 30 ml świeżej krwi.
  4. Wirować przy 400 x g przez 30 min w temperaturze 20 °C z wyłączonym hamowaniem.
  5. Podczas wirowania przygotować 8 probówek stożkowych o pojemności 50 ml z 25 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) w temperaturze pokojowej w każdej probówce.
  6. Ostrożnie przenieść mętny pierścień komórkowy na granicy faz (zawierający PBMC) do probówki 50 ml z HBSS (łączyć po 2 pierścienie komórkowe na probówkę). Uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą HBSS.
  7. Wirować przy 150 x g przez 15 min w temperaturze 20 °C z włączonym hamowaniem.
  8. Podczas wirowania mętnego pierścienia komórkowego zebrać żółtą górną warstwę z etapu z Ficoll, łącząc plazmę do wypełnienia probówki stożkowej 50 ml. Inaktywować dopełniacz w plazmie poprzez ogrzewanie probówki 50 ml w temperaturze 56 °C przez 30 min, a następnie wirować przez 10 min przy 1,800 x g. Zachować nadsącz (zawiera rozcieńczoną plazmę autologiczną, która może być stosowana jako suplement pożywki w późniejszych etapach).
  9. Ostrożnie usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy z kroku 1.7 w 25 ml HBSS, łącząc po 2 osady na jedną probówkę 50 ml. Wirować przy 300 x g przez 8 min w temperaturze 20 °C.
  10. Ostrożnie usunąć nadsącz i resuspendować osady w 10 ml HBSS, łącząc je w jednej probówce 50 ml.
  11. Pobrać alikwot, wykonać test wykluczania błękitu trypanu w celu oceny śmiertelności, a następnie policzyć PBMC.
  12. Uzupełnić objętość do 50 ml za pomocą HBSS i wirować przez 10 min przy 300 x g. Usunąć nadsącz i resuspendować komórki w RPMI 1640 w stężeniu 5x106 komórek/ml (z 500 ml krwi powinno się otrzymać około 400-500 x 106 PBMC).

2. Różnicowanie makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) (Na podstawie 8 i 9)

  1. Zasiać około 1,25 x 108 PBMC w naczyniach o średnicy 15 cm z użyciem RPMI 1640 (25 ml/naczynie).
  2. Pozostawić komórki do adhezji na 1-2 h w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  3. Przenieść nieprzylegające komórki do nowej kolby i dwukrotnie przemyć płytkę 15 ml bezendotoksynowego PBS (5 min, 300 x g). Przylegające komórki to wyizolowane monocyty.
  4. Aby umożliwić świeżo wyizolowanym monocytom różnicowanie się w MDM, dodać 20 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 5% autologicznej plazmy (z kroku 1.8). Dodać ludzki rekombinowany czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów (M-CSF, 25 ng/ml) oraz roztwór penicyliny i streptomycyny (PS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować przez 2 dni, wymienić pożywkę i inkubować dodatkowe 2-3 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  5. Usunąć starą pożywkę i raz przemyć bezendotoksynowym PBS, dodając go delikatnie i natychmiast odsysając. Aby odkleić w pełni zróżnicowane MDM, potraktować komórki ~7 ml Accutase (Accutase to dostępna komercyjnie mieszanina proteaz i enzymów o aktywności kolagenolitycznej, która umożliwia odklejenie komórek od plastikowego naczynia) przez 15-20 min w 37 °C w atmosferze 5% CO2, delikatnie kołysząc naczyniem w połowie czasu.
  6. Dodać 3-5 ml autologicznej plazmy (z kroku 1.8) do każdej płytki (aby pomóc chronić komórki podczas zeskrobivania).
  7. Delikatnie zeskrobać komórki, upewniając się, że pożywka przez cały czas pokrywa komórki, a następnie przenieść/połączyć je w probówce 50 ml.
  8. Przepłukać płytki bezendotoksynowym PBS, aby odzyskać jak największą liczbę komórek.
  9. Wirować przez 5 min przy 200 x g, odrzucić nadsącz.
  10. Resuspendować osad w 5 ml pożywki do hodowli MDM (RPMI 1640 uzupełnionej o 10% inaktywowanej dopełniaczem płodowej surowicy bydlęcej (iFBS), PS, 25 mM HEPES) i policzyć komórki (wydajność MDM zazwyczaj wynosi 2-8% całkowitej liczby PBMC). Uwaga: na tym etapie można pobrać alikwot MDM w celu oceny czystości populacji komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej; zazwyczaj 99% otrzymanych MDM wykazuje ekspresję CD14.
  11. Zasiać 1x105 MDM w 600 μl pożywki do hodowli MDM na studzienkę w płytkach 24-dołkowych.
  12. Inkubować przez noc w 37 °C w atmosferze 5% CO2 przed infekcjami.

3. Produkcja i oznaczanie ilości zapasów wirusa HIV-1

  1. Przygotować zapasy wirusów, stosując transfekcję fosforanem wapnia w komórkach HEK293T zgodnie z protokołem Fortin et al. 10.
  2. W celu uzyskania wirusów jednocyklowych zawierających gen reporterowy kodujący lucyferazę, przeprowadzić kotransfekcję komórek HEK293T za pomocą 20 μg NL4.3Luc+Env-R+ i 10 μg pHCMV-G lub 15 μg NL4.3Luc+Env-R+ i 15 μg pJRFLenv. W celu wygenerowania kontrolnych wirusów z deficytem glikoprotein należy użyć 30 μg NL4.3Luc+Env-R+. W przypadku wirusa w pełni replikacyjnego należy użyć 30 μg NL4.3Balenv. Wektory pHCMV-G i pJRFLenv kodują odpowiednio glikoproteiny otoczki wirusa zapalenia jam ustnych i narządów płciowych (VSV-G) oraz tropnicznego do CXCR5 HIV-1 (innego niż NL4.3Balenv). Dodatkowe informacje na temat plazmidów można znaleźć w 8. Plazmidy można pozyskać poprzez program NIH AIDS Research and Reference Program (NIAID, NIH).
  3. Ilościowo oznaczyć wszystkie zapasy wirusów za pomocą testu ELISA dla białka kapsydu p24 HIV-111 i przed użyciem zweryfikować ich potencjał infekcyjny. Zakaźność naszych zapasów wirusów oceniamy przy użyciu komórek wskaźnikowych TZM-bl12.

4. Hodowla pasożytów Plasmodium falciparum (na podstawie 13)

4.1 Ogólna hodowla i utrzymanie pasożytów

  1. Hodować pasożyty P. falciparum 3D7 w stadium aseksualnym w erytrocytach ludzkich (grupa krwi O+) przy hematokrycie 4% w medium RPMI 1640 (buforowanym 25 mM HEPES i 25 mM NaHCO3) uzupełnionym o 0,5% (w/v) Albumax II, 25 μg/ml gentamycyny oraz 370μM hypoksantyny w temperaturze 37 °C w mieszaninie gazowej 1% tlenu/5% dwutlenku węgla w azocie.
  2. Parasytemię można monitorować, wykonując cienki rozmaz hodowli i barwiąc go 15% roztworem Giemsy.
  3. Zawsze należy utrzymywać naczynie z kulturą nieinfected erytrocytów (uRBC) w tych samych warunkach co pasożyty, aby służyło ono jako kontrola.
    Aby uzyskać pasożyty w późniejszym stadium (trofozoity/wczesne schizonty), należy zsynchronizować pasożyty w następujący sposób:

4.2 Synchronizacja pasożytów

  1. Rano zebrać hodowlę pasożytów, odwirować przez 5 min przy 300 x g i odlać nadsącz.
  2. Resuspender osad w 5 objętościach uciśniętych komórek w 5% (w/v) D-Sorbitolu i inkubować przez 5 min w 37 °C.
  3. Odwirować przez 5 min przy 300 x g, odlać nadsącz, resuspender osad w 30 ml pożywki hodowlanej i ponownie umieścić w inkubatorze.
  4. Po około 8 godzinach powtórzyć kroki 4.2.1 do 4.2.3, aby uzyskać ściśle zsynchronizowane pasożyty. Pasożyty w późnych stadiach (trofozoity/wczesne schizonty) można zebrać następnego ranka w celu przeprowadzenia eksperymentu. Przed puryfikacją wykonać barwienie metodą Giemsy, aby potwierdzić stadium cyklu życiowego.

4.3 Oczyszczanie erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum (iRBC)

  1. Zesterylizować separator VarioMacs (stojak i magnes) 70% etanolem i umieścić go pod dygestorium biologicznym.
  2. Zamocować trójdrożny kurek do dolnej części kolumny CS.
  3. Odciąć końcówkę plastikowej osłony igły za pomocą specjalnego przecinaka Miltenyi i zamocować igłę do dolnej części kurka.
  4. Ostrożnie zablokować kolumnę w magnesie.
  5. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z kolumny, powoli wstrzykując 10 ml pożywki hodowlanej MDM za pomocą strzykawki dołączonej do zestawu, przykręconej do lewej strony kurka.
  6. Przepłukać kolumnę ~20 ml pożywki hodowlanej MDM.
  7. Zebrać RBC z płytki hodowlanej, przemyć raz 10 ml pożywki MDM (300 x g, 5 min) i zawiesić osad RBC w 12 ml pożywki hodowlanej MDM. Powoli dodać do kolumny i pozwolić zawiesinie przepłynąć (tylko zainfekowane erytrocyty zawierające pasożyty w stadium trofozoitu lub schizonta zostaną zatrzymane przez pole magnetyczne ze względu na obecność kryształów hemozoiny).
  8. Przemyć raz 20 ml pożywki i zatrzymać przepływ cieczy, gdy osiągnie ona białą tarczkę na górze kolumny.
  9. Wyjąć kolumnę z magnesu i eluować iRBC do czystej, sterylnej probówki za pomocą 12 ml pożywki hodowlanej MDM.
  10. Przygotować rozmaz z alikwoty odzyskanych iRBC i przeprowadzić barwienie Giemsą, aby potwierdzić stadium cyklu życiowego.
  11. Policzyć odzyskane iRBC za pomocą hemocytometru (izolowane RBC są w 100% iRBC).
  12. Odwirować komórki (300 x g, 5 min), odlać nadsącz i potraktować komórki 500 μl świeżego ludzkiego serum AB+ (etap opsonizacji14).
  13. Inkubować przez 30 min w 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  14. Przemyć raz 10 ml pożywki hodowlanej MDM (300 x g, 5 min) i zawiesić iRBC do pożądanego stężenia. Zazwyczaj naczynie hodowlane 15 cm z 10% parasitemią daje w przybliżeniu ~0.5-1x108 ściśle zsynchronizowanych iRBC.

5. Ekspozycja MDM na Plasmodium falciparum

  1. Aby poddać MDM działaniu uRBC lub iRBC, komórki należy resuspender w pożywce hodowlanej MDM w celu uzyskania stosunku uRBC/iRBC:MDM wynoszącego 75:1. Do wcześniej przygotowanych płytek 24-dołkowych zawierających MDM dodać do każdego dołka odpowiednią objętość zawiesiny RBC. Wszystkie doświadczenia należy przeprowadzić w trzech powtórzeniach.
  2. Kultury współhodowlane inkubować przez 4 hr w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  3. Komórki przemyć 3 razy 600 μl bezendotoksynowego PBS, dodając PBS ostrożnie i natychmiast go odsysając.
  4. Aby zlizować pozostałe RBC, przemyć dołki, dodając 200 μl lodowatej sterylnej wody na 20 sec, a następnie odessać płyn.
  5. Dodać 600 μl pożywki hodowlanej MDM i inkubować przez 24 hr w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.

6. Zakażanie MDM w pełni replikacyjnym szczepem HIV-1

  1. Aby ocenić wpływ P. falciparum na replikację HIV-1 w MDM, dodać zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1A do odpowiednich studzienek 10 ng p24 (w 300 μl medium MDM) wirusów NL4.3Balenv; do studzienek kontrolnych dodać wyłącznie medium MDM.
  2. Inkubować przez 2 hr w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  3. Przemyć komórki trzykrotnie PBS pozbawionym endotoksyn, dodając PBS delikatnie i natychmiast go odsysając. Dodać 600 μl świeżego medium MDM na każdą studzienkę.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  5. W 3, 6, 9 i 12 dobie po rozpoczęciu infekcji wirusowej pobrać 200 μl każdego nadsączu, dodając następnie 200 μl świeżego medium MDM. Pobrane nadsącze przechowywać w temperaturze -20 °C w celu ilościowego oznaczenia głównego białka kapsydu p24 HIV-1 metodą ELISA zgodnie z procedurą Fortin et al.10.

7. Zakażanie MDM wirusem jednocyklicznym kodującym lucyferazę

  1. Aby określić wpływ pasożyta na ekspresję genów HIV-1 w MDM, dodać zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1B 10 ng p24 (w 300 μl pożywki MDM) wirusów NL4.3Luc+Env-R+(VSV-G), NL4.3Luc+Env-R+(JRFLenv) lub NL4.3Luc+Env-R+ do odpowiednich studni.
  2. Inkubować przez 2 hr w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  3. Przemyć komórki 600 μl wolnego od endotoksyn PBS 3 razy, dodając PBS delikatnie i odsysając go natychmiast. Dodać 600 μl świeżej pożywki MDM na studnię.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.
  5. Usunąć pożywkę 72 hr po infekcji i dodać 200 μl buforu lizującego 1X (dołączonego do zestawu do analizy lucyferazy). Pozostawić komórki do lizy w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Rozmrozić płytkę i przenieść 40 μl lizatu na 96-dołkową płytkę do luminometru; dodać 100 μl substratu lucyferazy (dołączonego do zestawu do analizy lucyferazy) i zmierzyć aktywność lucyferazy (lucyferazy świetlika) w luminometrze zgodnie z instrukcją producenta.

8. Reprezentatywne wyniki

Wykorzystując nasz model koinfekcji, wykazujemy, że ekspozycja MDM na P. falciparum zmniejsza ich podatność na zakażenie HIV-1. Rzeczywiście, w MDM poddanych wstępnemu traktowaniu pasożytami obserwuje się znaczący spadek (p<0.05; dwuczynnikowa ANOVA, dzień 12) uwalniania cząsteczek wirusa, mierzony poziomem białka kapsydu p24 HIV-1 w supernatancie (Rycina 2A). Obserwacja ta została potwierdzona w komórkach zainfekowanych wirusami kodującymi gen reporterowy lucyferazy. Zakażenie MDM takimi wirusami zawierającymi egzogenną glikoproteinę VSV-G lub HIV-1 prowadzi do znacząco (p<0.05, test t Studenta) niższej produkcji lucyferazy w komórkach eksponowanych na P. falciparum (Rycina 2B). Warto zauważyć, że wirusy pseudotypowane VSV-G wykazywały znacznie większą aktywność lucyferazy niż ich odpowiedniki JRFLenv; wynika to z większej wydajności infekcji cząsteczek pseudotypowanych VSV-G15. Biorąc pod uwagę, że ekspozycja MDM na pasożyty wpływa na oba typy wirusów, sugeruje to, że oddziałuje ona na pewien etap ekspresji genów wirusowych (Rycina 2B). Należy również wspomnieć, że żywotność komórek nie została zaburzona przez ekspozycję MDM na iRBC (dane nie pokazano), co wskazuje, że obserwowana inhibicja jest specyficzna i nie wynika ze śmierci komórek.

Schemat eksperymentu komórkowego z grupami mock, uRBC, iRBC, Bal, Δenv, JRFL, vsv-g, badający testy wirusowe.
Rysunek 1. A) Schemat płytki dla infekcji MDM w pełni replikacyjnym wirusem. Mock: komórki niezainfekowane. uRBC: komórki eksponowane na niezinfekowane erytrocyty. iRBC: komórki eksponowane na erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. Bal: komórki zainfekowane NL4.3Balenv. Bal/uRBC: komórki eksponowane na uRBC i zainfekowane NL4.3Balenv. Bal/iRBC: komórki eksponowane na iRBC i zainfekowane NL4.3Balenv. B) Schemat płytki dla infekcji MDM jednocyklowym wirusem kodującym lucyferazę. Mock: komórki niezainfekowane. uRBC: komórki eksponowane na niezinfekowane erytrocyty. iRBC: komórki eksponowane na erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum. Δenv: komórki zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+. JRFL: komórki zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+(JRFLenv). vsv-g: komórki zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+(vsv-g). Δenv/uRBC: komórki eksponowane na uRBC i zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+. Δenv/iRBC: komórki eksponowane na iRBC i zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+. JRFL/uRBC: komórki eksponowane na uRBC i zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+(JRFLenv). JRFL/iRBC: komórki eksponowane na iRBC i zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+(JRFLenv). vsv-g/uRBC: komórki eksponowane na uRBC i zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+(vsv-g). vsv-g/iRBC: komórki eksponowane na iRBC i zainfekowane NL4.3Luc+Env-R+(vsv-g).

Wykres ekspresji białka HIV i aktywności lucyferazy; oś y: p24/ng/ml i RLU, oś x: dni/test.
Rycina 2. A) Wpływ Plasmodium falciparum na produkcję wirusa HIV-1 w MDM. MDM eksponowano na uRBC lub iRBC w stosunku 75:1 (uRBC/iRBC:MDM) przez 4 hr, a następnie dokładnie przemyto. Komórki zainfekowano 10ng p24 NL4.3Balenv przez 2 hr. Produkcję wirusa monitorowano za pomocą testu ELISA dla HIV-1 p24 w nadianadaninie wolnej od komórek w różnych punktach czasowych po początkowej infekcji wirusowej. Przedstawiono reprezentatywny eksperyment. B) Wpływ Plasmodium falciparum na transkrypcję wirusa HIV-1 w MDM. MDM zainfekowano uRBC lub iRBC w stosunku 75:1 (uRBC/iRBC:MDM). Następnie komórki zainfekowano 10ng p24 wirusa jednocyklowego (NL4.3Luc+Env-R+, NL4.3Luc+Env-R+(JRFLenv) lub NL4.3Luc+Env-R+(vsv-g)). Ekspresję lucyferazy oceniano w lizatach komórkowych 72 hr po początkowej infekcji wirusowej. Przedstawiono reprezentatywny eksperyment.

Dyskusja

Przedstawiliśmy tutaj dwa różne podejścia do analizy wpływu pasożyta malarii na cykl wirusa HIV-1, i.e. poprzez analizę ekspresji genów wirusowych lub produkcji i replikacji wirusów potomnych w makrofagach pochodzących z monocytów. Podobne podejścia stosowano w przypadku innych koinfekcji HIV-1 i pasożytami16. Niemniej jednak, te nowe dane stanowią krok naprzód w badaniu koinfekcji malaria-HIV-1. Rzeczywiście, Diou et al.8 badali wpływ hemozoiny, a nie żywych pasożytów, na replikację HIV-1; zgodnie z naszymi wynikami, zaobserwowali oni, że sama hemozoina była wystarczająca, aby zahamować produkcję wirusów przez MDM, a nie MDMs.

Stosując opisany układ eksperymentalny, zaobserwowaliśmy, że P. falciparum wywiera wyraźny niekorzystny wpływ na cykl replikacyjny HIV-1 w makrofagach: w makrofagach uprzednio eksponowanych na pasożyty stwierdzono istotne zahamowanie produkcji wirusa (Rysunek 2A), a specyficzny wpływ pasożyta na transkrypcję wirusa przedstawiono na Rysunku 2B. Nie możemy jednak wykluczyć dodatkowych efektów działania pasożyta na wnikanie lub fuzję wirusa (dekapsydację) bądź na mechanizmy pointegracyjne, takie jak synteza białek oraz montaż i pączkowanie cząsteczek wirusowych. Ponadto możliwe jest, że inny wpływ na replikację HIV-1 zostałby uzyskany, gdyby pasożyty dodano w tym samym czasie lub po zakażeniu MDM wirusem.

Nasz model koinfekcji in vitro stanowi potężne narzędzie do prowadzenia szczegółowych badań nad interakcjami HIV-1/P. falciparum w komórce gospodarza. Na przykład połączenie tego układu eksperymentalnego z innymi technikami, takimi jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym, która może celować w konkretne etapy odwrotnej transkrypcji wirusa oraz integracji genomu wirusa z genomem komórki gospodarza i je kwantyfikować, jest w pełni wykonalne i powinno dostarczyć dalszych informacji na temat mechanizmów zaangażowanych w koinfekcje. Ponadto do tego podstawowego protokołu można zastosować specyficzne testy w celu oceny wczesnych etapów cyklu wirusowego (fuzji wirusa, dekapsydacji, kwantyfikacji wejścia), aby dalej analizować wpływ na replikację wirusa. Modyfikacje te pokazują, jak elastyczny jest ten protokół w zakresie kwantyfikacji i detekcji HIV-1: w rzeczywistości nawet standardowe testy kwantyfikacji odwrotnej transkryptazy HIV-1 z użyciem nukleotydów znakowanych trytem mogłyby prawdopodobnie zastąpić test ELISA dla HIV-1 p24. Oprócz MDM spodziewamy się, że nasz system będzie możliwy do dostosowania do innych typów komórek istotnych dla interakcji HIV-1-malaria, takich jak monocyty i komórki dendrytyczne. Fakt, że MDM są komórkami adherentnymi, ułatwia ich manipulację, umożliwiając łatwe wypłukanie iRBC, które nie zostały pochłonięte lub pozostają w kontakcie z MDM, bez eliminowania makrofagów. Taka zaleta nie ma zastosowania do komórek dendrytycznych i monocytów, które są hodowane w zawiesinie, co komplikuje oddzielenie uRBC i wolnych iRBC od tych komórek; obecnie pracujemy nad rozwiązaniem tego problemu. Nasz system mógłby być również użyteczny do badania bardziej złożonych interakcji, takich jak wpływ komórek pochodzących z monocytów eksponowanych na Plasmodium na cykl wirusowy HIV-1 w innych komórkach odpornościowych, np. w limfocytach T CD4-dodatnich w eksperymentach z kokulturą. Wreszcie, nasz protokół mógłby być odpowiedni do eksperymentów badających wpływ iRBC P. falciparum na reaktywację HIV-1 w PBMC u osób zakażonych HIV-1.

Oświadczenie etyczne

Ludzkie PBMC pozyskano z krwi zdrowych dawców, zgodnie z wytycznymi Komitetu Bioetyki Centre Hospitalier de l'Université Laval Research Center. Od wszystkich dawców krwi uzyskano pisemną zgodę.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research w ramach grantu Catalyst Co-infections and Co-morbidities. Erytrocyty ludzkie zostały udostępnione przez bank krwi Centre Hospitalier de l'Université Laval.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640Multicell350-000-CL
PBS wolny od endotoksynSigmaD8662
FBSWisent080-150Inaktywowany ciepłem w °C przez 30 min
AccutaseeBiosciences00-4555-56
Albumax IIGibco11021-037Rozpuszczony w RPMI 1640, wysterylizowany przez filtrację
Medium do separacji limfocytówMulticell305-010-CL
Białe płytki do luminometruPromegaZ3291
Kolumny separacyjne CS MacsMiltenyi Biotech130-041-305
Separator VarioMacsMiltenyi Biotech130-090-282
Roztwór penicyliny/streptomycynyWisent450-201-EL
D-sorbitolSigma-AldrichS1876
Skrobacz do komórek (25 cm)Sarstedt83.1830
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowejBD Falcon353047
Szkiełko do hodowli 150 x 20 mmSarstedt83.1803.003
M-CSFGenscriptZ02001
HEPESSigma-AldrichH4034
Ludzkie surowica AB+Valley BiomedicalHP1022
HBSSWisent311-505-CL
GentamycynaSigma-AldrichG1397
HypoksantynaSigma-AldrichH9636
NaHCO3Sigma-AldrichS5761
System do oznaczania lucyferazyPromegaE1500
Ludzkie erytrocytyOtrzymane po oczyszczeniu z banku krwi CHUL.

Bibliografia

  1. WHO. World Malaria Report. , (2005).
  2. Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365, 233-240 (2005).
  3. Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa. Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).
  4. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).
  5. Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults. Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).
  6. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication. J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).
  7. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype. Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).
  8. Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection. Virology. 395, 56-66 (2009).
  9. Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of human macrophages. Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).
  10. Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
  11. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  12. Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193, 673-675 (1976).
  14. Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood. 80, 801-808 (1992).
  15. Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).
  16. Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network. Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Makrofagi pochodzenia monocytarnegotest replikacji HIV-1detekcja p24 metodą ELISAsystem reporterowy lucyferazyekspozycja na zakażone erytrocytymetoda izolacji VEACpobieranie nadsączu wirusowegoilościowe oznaczanie lucyferazy
Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.