Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4168

⸱

6 sierpnia 2012

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Experimental Therapy, The Netherlands Cancer Institute, 4Department of Human Genetics, University of Pittsburgh School of Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Streszczenie

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych z wykorzystaniem molekularnych beaconi do badania naprawy przez wycięcie zasady (BER). Substrat (beacon) składa się z deoksyoligonukleotydu zawierającego pojedynczą uszkodzoną zasadę, z cząsteczką 6-karboksyfluoresceiny (6-FAM) przyłączoną do końca 5' oraz cząsteczką Dabcyl przyłączoną do końca 3' oligonukleotydu. Molekularny beacon BER ma długość 43 zasad, a jego sekwencja została zaprojektowana tak, aby sprzyjać tworzeniu struktury pętli z łodyżką, z 13 nukleotydami w pętli i 15 parami zasad w łodyżce1,2. Po sfałdowaniu w tej konfiguracji cząsteczka 6-FAM jest wygaszana przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii fluorescencji Förstera (FRET)3,4. Uszkodzenie jest umiejscowione w taki sposób, że po usunięciu uszkodzonej zasady i przecięciu nici, pozostały 5-zasadowy oligonukleotyd zawierający cząsteczkę 6-FAM zostaje uwolniony z łodyżki. Uwolnienie i oddzielenie od wygaszacza (Dabcyl) prowadzi do wzrostu fluorescencji proporcjonalnego do poziomu naprawy DNA. Dzięki wielokrotnym pomiarom wartości fluorescencji możliwa jest ocena aktywności BER w czasie rzeczywistym. Wykorzystanie standardowych instrumentów do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym pozwala na jednoczesną analizę licznych próbek. Konstrukcja tych molekularnych beaconi BER z pojedynczym uszkodzeniem zasady nadaje się do analiz kinetycznych, kwantyfikacji BER oraz walidacji inhibitorów, a także może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i komórek nowotworowych lub przy użyciu oczyszczonych białek. Analiza aktywności BER w lizatach nowotworowych lub aspiratach tkankowych z użyciem tych molekularnych beaconi może znaleźć zastosowanie w pomiarach funkcjonalnych biomarkerów. Ponadto analiza aktywności BER z oczyszczonymi białkami przy użyciu tego testu ilościowego zapewnia szybką, wysokoprzepustową metodę odkrywania i walidacji inhibitorów BER.

Protokół

1. Projektowanie molekularnych sond beacon

1.1 Projektowanie i zamawianie molekularnej sondy typu beacon

Projektowanie sondy typu molecular beacon musi uwzględniać następujące kwestie:

  1. Dobre wyniki uzyskujemy przy zastosowaniu 43-merowych oligonukleotydów DNA. Zawartość GC powinna wynosić >32%. Należy wykluczyć obecność zasady G na końcu 5'.
  2. Należy zamówić sprzężenie z 6-FAM (6-karboksyfluoresceiną) na końcu 5' oraz modyfikację Dabcyl na końcu 3'.
  3. Pozycja uszkodzenia powinna przypadać na zasadę nr 6, licząc od końca 5'.
  4. Długość łodygi lub dupleksu spinki powinna wynosić minimum 15 bp.
  5. Zalecana długość pętli to 13 zasad.
  6. Ogólna struktura sondy beacon jest przedstawiona na Ryc. 1.
  7. Po ustaleniu sekwencji i rodzaju uszkodzenia oligonukleotyd można zamówić w większości firm syntetyzujących oligonukleotydy. Zamawiamy nasze oligonukleotydy w firmie IDT, wymagając ich oczyszczania metodą HPLC oraz dostarczenia w formie proszku lub w stanie wysuszonym.

1.2 Hybrydyzacja latarni molekularnej

  1. Liofilizowane oligonukleotydy DNA rozpuścić w buforze do rozcieńczania Oligo (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.1 mM EDTA), aby otrzymać stężony roztwór zapasowy Molecular Beacon o stężeniu 40 μM.
  2. Z roztworu zapasowego Molecular Beacon o stężeniu 40 μM przygotować roztwór roboczy Molecular Beacon o stężeniu 200 nM, używając buforu reakcyjnego BER (patrz poniżej). Roztwór roboczy Molecular Beacon 200 nM przenieść do sterylnej, czarnej probówki o pojemności 1.5 mL.
  3. Probówkę zawierającą roztwór roboczy Molecular Beacon 200 nM inkubować w dużym zlewce z wrzącą wodą przez 3 minuty.
  4. Po 3 minutach zdjąć zlewkę z źródła ciepła i inkubować Molecular Beacons w wodzie przez noc w celu promowania anelowania. Aby spowolnić proces chłodzenia, zastosować materiały termoizolacyjne nad i pod zlewką.
  5. Beacons rozdzielić do sterylnych, czarnych probówek o pojemności 1.5 mL w ilości 100 μL do każdej probówki.
  6. Przechowywać w temperaturze -30 °C.

1.3 Ocena jakości Twojej sondy typu molecular beacon

  1. Przeprowadź analizę krzywej topnienia, aby potwierdzić, że molekularne sondy (beacons) BER nie fluorescują do momentu podgrzania, wyznaczyć optymalną temperaturę topnienia oraz potwierdzić, że każda sonda będzie fluorescować po podgrzaniu.
  2. Dla każdej sondy dodaj wskazaną objętość 200 nM roztworu roboczego molekularnych sond oraz buforu do reakcji BER, zgodnie z Tabelą 1, do 6 dołków płytki Fast Optical 96-dołkowej (Applied Biosystems, Kat# 4346906).
  3. Użyj instrumentu do PCR w czasie rzeczywistym, takiego jak system StepOnePlus (Applied Biosystems) lub podobnego, aby monitorować wzbudzenie barwnika FAM podczas analizy krzywej topnienia.
  4. Zaprogramuj instrument do PCR w czasie rzeczywistym (system StepOnePlus), aby monitorować wzbudzenie barwnika FAM w funkcji rosnącej temperatury w małych przyrostach podczas analizy krzywej topnienia. System StepOnePlus jest zaprogramowany do pomiaru fluorescencji FAM i zmiany temperatury od 25 °C do 95 °C w odstępach 0.5 °C. Typową krzywą topnienia przedstawiono na Rysunku 2.
  5. W temperaturach poniżej 50 °C widoczna powinna być niewielka lub żadna fluorescencja tła. Sprawdź, czy występuje jednolity i gwałtowny wzrost fluorescencji, co świadczy o czystości i wysokiej jakości sond. Wartości Tm w zakresie od 60 °C do 80 °C są pożądane i powinny być takie same dla wszystkich rozcieńczeń.
  6. Na podstawie tej analizy wyznacz Tmax, czyli temperaturę przy maksymalnych wartościach fluorescencji [Fl(max)]. Proporcjonalność wartości fluorescencji przy Tm lub Tmax do ilości dodanej sondy (stężenia) powinna być liniowa. Wartość fluorescencji przy Tmax, Fl(max), powinna przekraczać wartości tła przy 37 °C co najmniej 5-krotnie.

2. Przygotowanie lizatu jądrowego

2.1 Przygotowanie buforu do reakcji naprawy przez wycinanie zasad (Base Excision Repair)5

  1. Dodać wszystkie składniki wymienione w Tabeli 2 i uzupełnić objętość buforu do 900 mL wodą ddH2O.
  2. Dostosować pH do wartości 7,8, używając wodorotlenku potasu 8,0 N (Sigma, Cat#17-8).
  3. Uzupełnić objętość buforu do 1000 mL wodą ddH2O.
  4. Przefiltrować bufor przez filtr 0,22 μM, filtr Nalgene 1 L (cat# 167-0020).
  5. Dodać ditiotreitol (DTT) bezpośrednio przed użyciem buforu do reakcji BER.

2.2 Hodowla komórek i izolacja komórek

  1. Zaleca się hodowlę komórek do uzyskania 90-100% konfluencji. Izoluj komórki z 4-6 naczyń (150 mm), aby uzyskać wystarczającą ilość lizatu jądrowego do pełnego zestawu analiz (łącznie około 5 x 107 komórek).
  2. Zaleca się przygotowanie 3 niezależnych hodowli w celu uzyskania 3 niezależnych osadów komórkowych, co pozwoli na otrzymanie powtórzeń biologicznych dla każdej analizy.
  3. Lizaty jądrowe można łatwo przygotować, stosując procedurę izolacji NucBuster (EMD Bioscience Calbiochem Cat#71183-3), choć odpowiedni będzie każdy protokół izolacji jąder (patrz poniżej, sekcja 2.3.).

2.3 Przygotowanie lizatu jądrowego

  1. Przed rozpoczęciem liofilizowany Protease Inhibitor Cocktail (Calbiochem, Cat#539131, Set 1) należy rozpuścić w 100 μl sterylnej wody w celu przygotowania roztworu stokowego 100x. Należy go użyć natychmiast lub zamrozić w aalikwotach w temperaturze -20 °C do długoterminowego przechowywania. W zależności od potrzeb należy odmierzyć 1 μl roztworu stokowego 100x na każde 107 ekstrahowanych komórek.
  2. Wszystkie etapy procedury ekstrakcji należy przeprowadzać w lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapewnić stabilność białek.
  3. Należy opisać probówki Falcon 15 mL i umieścić je w lodzie.
  4. Należy usunąć pożywkę wzrostową z komórek i przemyć je dwukrotnie 7,5 mL zimnego PBS.
  5. Do każdej szalki należy dodać 5 mL zimnego PBS i zebrać komórki z płytki za pomocą zgarniacza do komórek (cell lifter). Komórki należy przenieść do schłodzonej probówki Falcon 15 mL.
  6. Wirować z niską prędkością (500x g, 4 °C) przez 5 minut. Usunąć nadsącz i oszacować objętość osadu komórkowego poprzez porównanie. (W jednej probówce 1,5 mL można przetworzyć do 250 μl objętości osadu komórkowego).
  7. Wirować przez kolejną 1 minutę przy 500x g i usunąć pozostały PBS za pomocą pipety. Osad komórkowy należy resuspendować w NucBuster Extraction Reagent 1 zgodnie z wielkością objętości osadu komórkowego: 150 μl NucBuster Extraction Reagent 1 na 50 μl objętości osadu komórkowego. (Alternatywnie, osad komórkowy można szybko zamrozić na suchym lodzie lub w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego procedowania).
  8. Po resuspensji lizat należy przenieść do uprzednio schłodzonej probówki 1,5 mL.
  9. Worteksować przez 15 s z wysoką prędkością, inkubować w lodzie przez 5 minut, a następnie ponownie worteksować przez 15 s z wysoką prędkością.
  10. Wirować przy 13 000x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Nadsącz zawiera frakcję cytoplazmatyczną. Należy go zebrać i przechowywać w temperaturze -80 °C lub zutylizować.
  12. Osad należy resuspendować w mieszaninie 1 μl resuspendowanego 100x Protease Inhibitor Cocktail, 1 μl 100 mM DTT oraz 75 μl NucBuster Extraction reagent 2 na 50 μl objętości osadu komórkowego.
  13. Worteksować przez 15 s z wysoką prędkością, inkubować w lodzie przez 5 minut, a następnie ponownie worteksować przez 15 s z wysoką prędkością.
  14. Wirować przy 13 000x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Nadsącz zawiera białka jądrowe. Należy zebrać nadsącz i przejść do następnego etapu.

2.4 Dializa, oznaczanie ilości białka i rozlewanie na alykwoaty

  1. Wszystkie etapy procedury dializy należy przeprowadzać z użyciem schłodzonych wcześniej roztworów, materiałów i sprzętu, aby zapewnić wysoką jakość ekstraktu.
  2. Przygotować bufor do dializy (wymagane 1 L na próbkę) zgodnie ze szczegółami w Tabeli 3. Ważne: Bufor powinien być zimny (4 °C). Sugerujemy przygotowanie go co najmniej dzień wcześniej. Przefiltrowany bufor do dializy można przechowywać w 4 °C w nieskończoność, pod warunkiem, że NIE dodano do niego DTT.
  3. Schłodzić wcześniej zlewki (2 zlewki o pojemności 1 L na próbkę), bufor do dializy, komory dializacyjne, probówki do mikrocentryfugi, strzykawki i igły.
  4. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 mL 1 M DTT na litr buforu do dializy.
  5. Przeprowadzić dializę lizatu przygotowanego w kroku 2.3 w 0,5 L schłodzonego wcześniej buforu do dializy przez 90 minut w 4 °C przy łagodnym mieszaniu, używając kasety dializacyjnej PIERCE Slide-A-Lyzer (kasety dializacyjne 0,5-3 mL z odcięciem MW 7 000).
  6. Przenieść kasetę dializacyjną do drugiej zlewki zawierającej 0,5 L schłodzonego wcześniej buforu do dializy i dializować lizat przez 90 minut w 4 °C przy łagodnym mieszaniu.
  7. Pobrać zdializowany roztwór białek jądrowych z kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki (Fisher, kat# 309659). Użyć innej uszczelki niż użyta wcześniej, aby wstrzyknąć białko do kasety dializacyjnej. Należy zauważyć, że ekstrakt mógł się skrystalizować z powodu wysokich stężeń białek. Podczas pobierania zdializowanego roztworu białek jądrowych należy starać się uwzględnić widoczne mętne kryształy.
  8. Rozdzielić próbkę do probówek do mikrocentryfugi w ilościach po 20 μl każda. Szybko zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w -80°C do czasu użycia.
  9. Oznaczyć stężenie zdializowanego białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Przykłady oczekiwanych stężeń lizatów jądrowych przedstawiono w Tabeli 4.
  10. Na koniec lizaty należy poddać ocenie w ramach kontroli jakości. Sposób oceny lizatów będzie zależał od eksperymentu. Jak opisano wcześniej, rutynowo analizujemy lizaty pod kątem ekspresji kilku białek BER za pomocą immunoblottingu1,2.
  11. Etap dializy służy do uzyskania jednorodnego roztworu reakcyjnego dla wszystkich linii komórkowych, aby ułatwić porównanie. Pominięcie etapu dializy może wpłynąć na szybkość enzymatyczną i analizę kinetyczną, ponieważ roztwory soli i warunki reakcji nie będą już identyczne w różnych liniach komórkowych i preparatach ze względu na wymagane różne rozcieńczenia. Zaobserwowaliśmy jednak, że stosowanie lizatów o stężeniu powyżej 5 μg/μl i dodanie odpowiedniej ilości buforu reakcyjnego pozwala na pominięcie etapu dializy (dane nie pokazano). W badaniach nad inhibitorami, które nie wymagają porównania między różnymi lizatami komórkowymi, dializa może nie być konieczna. Zalecamy jednak przeprowadzenie dializy zgodnie z instrukcją.

3. Test z użyciem molekularnych sond beacon

3.1 Wymagania dotyczące sprzętu

  1. Urządzenie do ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym, takie jak StepOnePlus qRT-PCR lub porównywalne, lub fluorometr do płytek 96-dołkowych zdolny do wykrywania i pomiaru fluorescencji FAM w czasie rzeczywistym. Uwaga: procedura ta ma zastosowanie do każdego urządzenia zdolnego do odczytu wartości fluorescencji sond typu beacon i ich rejestrowania w czasie rzeczywistym. Urządzenie powinno jednak umożliwiać użytkownikowi dostęp do surowych wartości fluorescencji w celu analizy danych.
  2. Wirówka kompatybilna z używanymi optycznymi probówkami lub płytkami do qRT-PCR.
  3. Program Microsoft Excel do analizy zebranych danych.

3.2 Bufory i odczynniki

  1. Probówki lub płytki do optycznej qRT-PCR z odpowiednimi pokrywami.
  2. Bufor do reakcji BER (patrz powyżej i Tabela 2).
  3. Dializowane ekstrakty białek jądrowych, przygotowane zgodnie z krokami 2.3 i 2.4 i rozcieńczone buforem do reakcji BER zawierającym DTT do stężenia 2 μg/μL białka.
  4. Molekularne sondy typu Molecular Beacons rozcieńczone buforem do reakcji BER do stężenia 200 μM w celu przygotowania roztworu roboczego Molecular Beacons (patrz powyżej).

3.3 Przygotowanie testu (Tabela 5)

  1. Urządzenie do qRT-PCR nie jest zazwyczaj wykorzystywane jako fluorymetr, dlatego należy zmienić metodę pomiaru.
    1. Zaprogramuj pierwszy etap i ustaw temperaturę reakcji na 37 °C z czasem cyklu (punktami pomiarowymi) wynoszącym 20 s i minimum 180 cyklami (lub więcej, w zależności od projektu testu naprawy). Upewnij się, że dane są zbierane podczas cykli. W ten sposób urządzenie będzie gromadzić dane co 20 s przez łącznie 1 h.
    2. Utwórz drugi etap, w którym temperatura wzrośnie do Tmax konkretnego beaconu, czyli temperatury maksymalnej fluorescencji, wyznaczonej w kroku 1.3 (Ocena jakości beaconu molekularnego). Czas cyklu powinien ponownie wynosić 20 s przy łącznej liczbie 15 cykli. Pozwoli to na zbieranie danych co 20 sekund przez 5 minut przy maksymalnej możliwej fluorescencji beaconu. Wartości fluorescencji zmierzone podczas cykli w Tmax służą do normalizacji wartości fluorescencji w każdym dołku (krok 4.2a). W przypadku użycia kilku różnych beaconów należy upewnić się, że uwzględniono kroki zapewniające podobne wartości powtórzeń dla Tmax tych beaconów.
    3. Ustaw objętość reakcji na 25 μL.
  2. Skonfiguruj projekt płytki w urządzeniu do qRT-PCR, korzystając z oprogramowania Applied Biosystems. Interesują nas wyłącznie surowe wartości fluorescencji, dlatego wybierz typ eksperymentu „Standard Curve”.
  3. Uzupełnij układ płytki. Przykład przedstawiono w Tabeli 5. NIE dodawaj nic do dołków wybranych jako krzywa standardowa.

3.4 Przeprowadzenie analizy

  1. Ważne: Należy używać schłodzonych materiałów i roztworów. Przechowywać w niskiej temperaturze do momentu przeprowadzenia reakcji i detekcji.
  2. Do stosowanego buforu reakcyjnego BER dodać odpowiednią ilość DTT.
  3. Rozcieńczyć roztwór białka do stężenia 2 μg/μL za pomocą buforu reakcyjnego BER (z DTT).
  4. W przypadku wstępnych eksperymentów sugerujemy użycie 10 μg dializowanego lizatu jądrowego na dołek (5 μL/dołek) oraz 1 pmole substratu – beacona molekularnego w końcowym stężeniu 40 nM (5 μL/dołek). Konsekwentnie uzyskiwaliśmy wysokiej jakości i powtarzalne wyniki przy zastosowaniu 10 μg lizatu komórkowego, choć możliwe jest, że różne lizaty komórkowe lub substraty beacona będą wymagały wyższych lub niższych stężeń białka.
    1. Komponenty testu w każdym dołku to 15 μL buforu reakcyjnego BER, 5 μL beacona i 5 μL lizatu jądrowego. Każdą kombinację beacon/lizat należy wykonać w trzech powtórzeniach.
    2. Dla każdego beacona wymagane są kilka kontroli negatywnych, w tym próbki bez beacona, takie jak 25 μL samego buforu reakcyjnego BER, a także 20 μL buforu reakcyjnego BER z 5 μL lizatu oraz 20 μL buforu reakcyjnego BER z 5 μL beacona bez lizatu.
    3. Dla każdego lizatu jądrowego wymagane jest kilka próbek kontrolnych. Obejmują one kontrolę negatywną [15 μL buforu reakcyjnego BER, 5 μL kontrolnego beacona (bez uszkodzenia) i 5 μL lizatu próbki]. Sugerujemy również włączenie eksperymentalnych kontroli pozytywnych, takich jak beacony zawierające THF, które naśladują oligosy zawierające miejsca abazyczne i są łatwo nacinane [15 μL buforu reakcyjnego BER, 5 μL beacona THF i 5 μL lizatu próbki]. Oczywiście precyzyjny dobór kontroli pozytywnej będzie zależał od ogólnego projektu eksperymentalnego.
  5. Przykładowy układ płytki przedstawiono w poniższej Tabeli 5.
  6. Pipetować do probówek optycznych lub płytek, trzymając je na lodzie lub na chłodzącym statywie, aby zminimalizować rozpoczęcie reakcji przed detekcją sygnału.
  7. Najpierw pipetować bufor reakcyjny BER do wszystkich dołków.
  8. Następnie pipetować beacony do odpowiednich dołków zgodnie z układem płytki, a na samym końcu pipetować lizaty, aby zminimalizować rozpoczęcie reakcji przed detekcją sygnału.
  9. Szczelnie zamknąć probówki lub płytkę, wymieszać i wirować w wirówce, aby zebrać roztwory na dnie probówek lub płytki.
  10. Włożyć płytkę do urządzenia qRT-PCR i rozpocząć analizę.
  11. Po zakończeniu wyeksportować surowe dane, najlepiej w formacie Excel. W przypadku systemu StepOnePlus wymagane są jedynie dane wieloskładnikowe (multi-component data). Zawierają one wszystkie wartości fluorescencji przy wielokrotnych odczytach, posortowane według koloru barwnika i dołka.  

4. Analiza testu z użyciem molekularnych sond typu beacon

Do przeprowadzenia tych analiz i obliczeń wykorzystaliśmy oprogramowanie Microsoft Excel. Zalecamy stworzenie szablonów i makr, które umożliwią łatwą i szybką analizę oraz prezentację wykresów na podstawie danych pochodzących ze standardowych formatów 96-dołkowych.

4.1 Usuwanie tła

  1. Wykorzystując surowe wartości fluorescencji z danych wieloskładnikowych, należy najpierw uporządkować dane według dołków/próbek. W systemie StepOnePlus można to osiągnąć poprzez eksport danych „w poprzek kolumn” (across columns), co skutkuje utworzeniem pliku Excel, w którym wiersze reprezentują poszczególne odczyty w różnych cyklach, a kolumny odpowiadają różnym dołkom.
  2. Dla każdej pojedynczej sondy molekularnej (molecular beacon) należy odjąć wartości fluorescencji tła wykryte w kontrolach negatywnych (20 μL buforu do reakcji BER i 5 μL sondy) od wartości fluorescencji w każdym cyklu we wszystkich dołkach, w których zastosowano tę sondę. Pozwala to usunąć z dalszych analiz zmiany fluorescencji tła niezwiązane z lizatem.

4.2 Normalizacja Fl(Tmax)

Aby wyeliminować zmienność wynikającą z pipetowania i detekcji fluorescencji w różnych studzienkach, normalizujemy dane do maksymalnych wartości fluorescencji (które korelują z ilością wprowadzonego beaconu).

  1. Oblicz średnie wartości fluorescencji cykli w Tmax dla poszczególnych dołków: Fl(Tmax) (krok 3.3aii).
  2. Oblicz stosunki Fl(cykl x)/Fl (Tmax) i pomnóż przez 100. Przy założeniu, że Fl(Tmax) odpowiada maksymalnej możliwej wartości fluorescencji przy pełnym przecięciu, znormalizowane dane te reprezentują % wolnego FAM (= % przeciętego przez BER beacona).
  3. Połącz próbki wykonywane w trzech powtórzeniach poprzez wyciągnięcie średniej z danych (% wolnego FAM) dla 3 dołków dla każdego cyklu (do cyklu 180) i oblicz błąd dla każdego z nich.
  4. Oblicz czas, mnożąc każdy cykl przez 20 sec.
  5. Ponieważ wariancja detekcji fluorescencji między dołkami może być znacząca, zalecamy dodanie barwnika fluorescencyjnego, takiego jak ROX, do roztoku beacona molekularnego służącego jako standard, w celu ponownej kalibracji wartości fluorescencji poszczególnych dołków. W tym przypadku barwnik ROX zostałby użyty jako standard wewnętrzny (referencja pasywna) w każdym dołku. Widma pobudzenia i emisji ROX (pobudzenie - 588 nm, emisja 608 nm) różnią się od widm barwnika 6-FAM zastosowanego w teście (pobudzenie - 495 nm, emisja - 520 nm). Barwnik ROX umożliwiłby etap normalizacji podobny do konwencjonalnych procedur RT-PCR, co pozwala na zniesienie różnic między dołkami, które mogą wystąpić w wyniku artefaktów. Mogą one wynikać z błędów pipetowania lub z różnic w wydajności detekcji fluorescencji między dołkami.

4.3 Wykres

  1. Nanieś znormalizowane dane fluorescencji (% wolnego FAM) w funkcji czasu (w sek) na wykres punktowy z odpowiednimi słupkami błędów.
  2. Zalecamy analizę kinetyki naprawy w co najmniej trzech różnych preparatach lizatów jądrowych reprezentujących powtórzenia biologiczne. W celu oceny wariancji należy przedstawić błędy międzyeksperymentalne obliczone ze średnich z każdego poszczególnego eksperymentu.
  3. Reprezentatywna analiza dwóch lizatów komórek nowotworowych: LN428, linii komórkowej glejaka z niewykrywalnym poziomem metylopurynowej glikozylazy DNA (MPG) oraz LN428/MPG, tej samej linii komórkowej zmodyfikowanej w celu zwiększenia ekspresji MPG; obie linie komórkowe mają równoważne poziomy endonukleazy AP 1 (APE1)1,2. W obu badano aktywność APE1 i aktywność MPG przy użyciu molekularnej sondy BER THF (Rycina 3) oraz molekularnej sondy BER Hx (Rycina 4), gdzie THF = tetrahydrofuran (substrat dla APE1), a Hx = hypoksantyna (substrat dla MPG). Uwaga: na Rycini 3 (substrat THF) wyniki z lizatów LN428/MPG wykazują niższą maksymalną fluorescencję absolutną w porównaniu z lizatami LN428. Jest to wynik niższej wartości wejściowej sondy określonej na podstawie wartości Tmax (patrz 3.3a). Zastosowanie tej niższej wartości do normalizacji wyników powoduje znaczną zmianę na wykresie. Dobrze ilustruje to znaczenie normalizacji danych. Przedstawienie samych wartości fluorescencji absolutnej sugerowałoby, że szybkości naprawy w komórkach LN428 i LN428/MPG są różne. Jednak po znormalizowaniu danych w celu uwzględnienia zmienności między dołkami okazuje się, że różnica w szybkości naprawy pośredniczonej przez APE1 jest minimalna.

5. Reprezentatywne wyniki

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA i endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych z wykorzystaniem molekularnych beakonów do naprawy przez wycinanie zasad (BER) (Figure 1). Po wyżarzaniu sugerujemy przeprowadzenie analizy krzywej topnienia (Table 1) w celu oceny jakości beakonu molekularnego (Figure 2). Następnie można przygotować lizaty jądrowe, korzystając ze składników buforu wymienionych w Table 2. Lizat należy dializować w 0,5 L schłodzonego buforu do dializy przez 90 minut w temperaturze 4 °C przy delikatnym mieszaniu, używając kasety do dializy PIERCE Slide-A-Lyzer przeciwko buforowi do dializy wymienionemu w Table 3. Dializowany roztwór białek jądrowych należy pobrać z kasety do dializy za pomocą strzykawki. Należy użyć innej uszczelki niż poprzednio, aby wstrzyknąć białko do kasety do dializy. Stężenie zdializowanego białka należy określić zgodnie ze standardowymi protokołami. Przykłady oczekiwanych stężeń lizatu jądrowego przedstawiono w Table 4. Reakcję należy przeprowadzić zgodnie z opisem powyżej (krok 3.4), stosując układ płytki pokazany w Table 5. Przedstawiono reprezentatywną analizę dwóch lizatów komórek nowotworowych: LN428, linii komórkowej glejaka z niewykrywalnymi poziomami metylopurynowej glikozylazy DNA (MPG) oraz LN428/MPG, tej samej linii komórkowej zmodyfikowanej w celu zwiększenia ekspresji MPG; obie linie komórkowe mają równoważne poziomy endonukleazy AP 1 (APE1)1,2. W obu badano aktywność APE1 i MPG za pomocą beakonu molekularnego BER THF (Figure 3) oraz beakonu molekularnego BER Hx (Figure 4), gdzie THF = tetrahydrofuran (substrat dla APE1), a Hx = hypoksantyna (substrat dla MPG). Na koniec, używając beakonu molekularnego BER dU/A informującego o aktywności uracyloglikozylazy, wykazujemy, że wyjście sygnału lub siła sygnału jest maksymalna przy 10 µg białka i spada do poziomu niewykrywalnego przy 0,62 µg białka (Figure 5).

Schemat hybrydyzacji DNA z oznakowanymi sekwencjami; przedstawia procesy annealingu i topnienia.
Rysunek 1. Ogólna struktura molekularnej sondy BER Molecular Beacon. Przedstawiono sekwencję i ogólny projekt wykorzystanych w niniejszej pracy sond BER Molecular Beacon w formie cząsteczki jednoniciowej, po annealingu oraz ponownie po topnieniu. Część sekwencji zaznaczona pogrubioną kursywą to łodyga (15 zasad), a część podkreślona to pętla (13 zasad). FAM = fluorofor 6-karboksyfluoresceina na końcu 5' [koniec 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, współczynnik ekstynkcji (260 nm): 20 960; współczynnik ekstynkcji (przy maksymalnym absorbancji): 75 000], a Dabcyl = czynnik gaszący Dabcyl na końcu 3' [koniec 3'; Abmax = 453 nm; zakres gaszenia = 425-520 nm]. X = uszkodzenie (zależne od pytania badawczego), a Y = zasada przeciwległa do uszkodzenia (zależna od pytania badawczego).

Krzywe amplifikacji PCR, wykresy fluorescencji w funkcji temperatury, analiza temperatury topnienia DNA.
Rycina 2. Krzywa topnienia. Przedstawiono reprezentatywną krzywą topnienia dla kontroli Molecular Beacon BER (A), a także dla Molecular Beaconów BER zawierających fragment tetrahydrofuranu (THF) (B) lub fragment hypoksantyny (Hx) (C). Stężenia oligonukleotydów wynosiły odpowiednio: 0 nM (ciemnoniebieski), 8 nM (czerwony), 16 nM (zielony), 32 nM (fioletowy), 64 nM (niebieski) oraz 128 nM (pomarańczowy). Zgodnie z opisem w kroku 1.3, zdenaturowane oligonukleotydy podgrzewano od 25 °C do 95 °C w odstępach 0.5 °C, a system StepOnePlus zaprogramowano tak, aby mierzył fluorescencję FAM w każdym interwale 0.5 °C.

Wykresy intensywności fluorescencji dla LN428 i LN428/MPG w czasie; porównanie danych kinetycznych.
Rysunek 3. Reprezentatywne dane z wykorzystaniem molekularnej sondy (Molecular Beacon) BER THF. Aktywność endonukleazy AP specyficzna dla hydrolizy analogu miejsca abazycznego, tetrahydrofuranu (THF), zmierzono w lizatach jąder komórkowych z linii kontrolnej (LN428) oraz linii z nadekspresją MPG (LN428/MPG). Każdy lizat analizowano przy użyciu kontrolnej molekularnej sondy BER (LN428, zielony; LN428/MPG, fioletowy) lub molekularnej sondy BER THF (LN428, niebieski; LN428/MPG, czerwony). Wyniki przedstawiono jako (A) średnie jednostki odpowiedzi fluorescencyjnej oraz (B) te same dane znormalizowane względem ilości wprowadzonej sondy, zgodnie z opisem w sekcji 4 powyżej (THF = tetrahydrofuran).

Wykres kinetyki fluorescencji; dane dla LN428/MPG i LN428; znormalizowana intensywność w czasie 120 min; wynik eksperymentu.
Rycina 4. Reprezentatywne dane z użyciem molekularnej sondy BER Hx Aktywność DNA glikozylazy specyficzna dla usuwania substratu MPG, hypoksantyny (Hx), została zmierzona w lizatach jąder komórkowych z linii kontrolnej (LN428) oraz linii z nadekspresją MPG (LN428/MPG). Każdy lizat analizowano przy użyciu kontrolnej molekularnej sondy BER (LN428, zielony; LN428/MPG, fioletowy) lub molekularnej sondy BER Hx (LN428, niebieski; LN428/MPG, czerwony). Wyniki przedstawiono jako (A) średnie jednostki odpowiedzi fluorescencyjnej oraz (B) te same dane znormalizowane zgodnie z opisem w sekcji 4 powyżej (Hx = hypoksantyna).

Wykres fluorescencji w funkcji czasu, analiza stężenia białka, znormalizowane dane, wyniki eksperymentalne.
Rycina 5. Reprezentatywne dane z wykorzystaniem sondy molekularnej BER dU/A przy różnych poziomach białka. Aktywność DNA glikozylazy (UNG) specyficzna dla usuwania uracylu (dU/A) zmierzono w lizatach jąder komórkowych linii T98G. Lizat T98G analizowano przy użyciu kontrolnej sondy molekularnej BER lub sondy molekularnej BER dU/A, przy poziomach białka 10, 5, 2,5, 1,25 lub 0,62 μg, zgodnie z oznaczeniami na rycinie. Wyniki przedstawiają dane znormalizowane, zgodnie z opisem w sekcji 4 powyżej.

Stężenie sondy Beacon (nM)08163264128
Dodany roztwór roboczy sondy Molecular Beacon (200nM) (μL)0124816
Bufor do reakcji BER (bez DTT) (μL)25242321179

Tabela 1. Układ eksperymentu krzywej topnienia.

Łącznie 1 LWymagana objętość roztworu stokowegoStężenie roztworu stokowegoStężenie końcowe
HEPES-KOH25 mL1M pH7.825 mM
KCl75 mL2 M150 mM
EDTA1 mL0.5M pH8.00.5 mM
Glicerol10 mLN/A1%
DTT (dodać przed użyciem)0.5 mL1 M0.5 mM
H2O888.5 mLN/AN/A

Tabela 2. Bufor do reakcji BER.

1 L całkowita objętośćWymagana objętość roztworu stokowegoStężenie roztworu stokowegoStężenie końcowe
HEPES-KOH50 mL1M pH7.550 mM
KCl50 mL2 M100 mM
EDTA1 mL0.5M pH8.00.5 mM
Glicerol200 mLn/d20%
DTT (dodać przed użyciem)1 mL1 M1 mM
H2O698 mLn/dn/d

Tabela 3. Bufor do dializy.

Linia komórkowaStężenie białka (μg/μL)
LN4285.34
LN428/MPG4.79

Tabela 4. Wyniki oznaczania białka.

Kontrola negatywna 25μL BER Buffer(Kontrola tła) 20μL BER Buffer
5μL Con Beacon
BEZ lizatu		(Test w trzech powtórzeniach)
15μL BER Buffer
5μL Con Beacon
5μL lizatu LN428		(Test w trzech powtórzeniach)
15μL BER Buffer
5μL Con Beacon
5μL lizatu LN428/MPG
Kontrola negatywna 25μL BER Buffer(Kontrola tła) 20μL BER Buffer
5μL THF Beacon
BEZ lizatu		(Test w trzech powtórzeniach) 15μL BER Buffer
5μL THF Beacon
5μL lizatu LN428		(Test w trzech powtórzeniach) 15μL BER Buffer
5μL THF Beacon
5μL lizatu LN428/MPG
Kontrola negatywna
20μL BER Buffer
5μL lizatu		(Kontrola tła) 20μL BER Buffer
5μL Hx Beacon
BEZ lizatu		(Test w trzech powtórzeniach)
15μL BER Buffer
5μL Hx Beacon
5μL lizatu LN428		(Test w trzech powtórzeniach) 15μL BER Buffer
5μL Hx Beacon
5μL lizatu LN428/MPG
Kontrola negatywna
20μL BER Buffer
5μL lizatu		   

Tabela 5. Konfiguracja testu z użyciem sond molekularnych (Molecular Beacon).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieje ponad 600 cytowań wykorzystujących termin „molecular beacon” (świetlna sonda molekularna) do wykrywania i ilościowego oznaczania licznych cząsteczek oraz aktywności enzymatycznych, w tym aktywności helikazy6, aktywności polimerazy DNA7,8, aktywności ligazy DNA9, aktywności telomerazy10, aktywności fotoliazy DNA11 oraz hybryd DNA/RNA12, spośród wielu innych. Oprócz zastosowania sond molecular beacon do pomiaru wymienionych wyżej aktywności naprawy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

RWS jest konsultantem naukowym w firmie Trevigen, Inc. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana grantami z Pittsburgh Foundation oraz National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] przyznanymi dla RWS. Wsparcie dla UPCI Lentiviral Facility zostało zapewnione RWS przez Cancer Center Support Grant z National Institutes of Health [P30 CA047904]. Wsparcie zostało również zapewnione przez University of Pittsburgh Department of Pharmacology & Chemical Biology dla DS. Wsparcie zostało ponadto zapewnione przez ESTRO dla CV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek potasuFisherP217-500Stopień czystości molecular grade
EDTAFisherBP120-500
GlicerolFisherBP229-1Stopień czystości molecular grade
DTTFisherBP172-5
Roztwór HEPESInvitrogen15630
Sól HEPESSigmaH4034-500G
Wodorotlenek potasuSigma17-8
Filtr 0.22μMNalgene167-0020
Produkty do dializy Slide-A-LyzerPierce66373MW 7000
StrzykawkaFisher309659
IgłaFisher305196
Probówki do mikrocentryfugi 1.5 mLFisher05-408-129Czarne
Probówki Falcon 15 mLFisher352097
Zestaw do ekstrakcji białek NucBusterCalbiochem71183
PBSInvitrogen14190
Sondy Molecular BeaconsIDT
Koncentrat odczynnika barwiącego do analizy białek BioRadBioRadCat# 500-0006

Bibliografia

  1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
  2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
  3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
  4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
  5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
  6. Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
  7. Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
  8. Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
  9. Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
  10. Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
  11. Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
  12. Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
  13. Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
  14. Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
  15. Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza z użyciem molekularnych sond beaconaktywność glikozylazy DNAaktywność endonukleazy APpomiar fluorescencji w czasie rzeczywistymilościowa analiza PCRprzygotowanie lizatu jądrowegodetekcja specyficzna dla uszkodzeńkwantyfikacja oparta na FRETkinetyka naprawy DNA
Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.