Artykuł metodologiczny

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawczej przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla zmian molekularnych sygnalizatorów

DOI:

10.3791/4168

⸱

6 sierpnia 2012

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh Cancer Institute, 3Department of Experimental Therapy, The Netherlands Cancer Institute, 4Department of Human Genetics, University of Pittsburgh School of Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA i endonukleazy AP w lizatach jądrowych komórek. Test daje wskaźniki aktywności naprawy DNA podatne na analizę kinetyczną i można go dostosować do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w tkankach i lizatach nowotworowych lub z oczyszczonymi białkami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA i endonukleazy AP w lizatach jądrowych komórek za pomocą molekularnych znaczników naprawy przez wycinanie zasady (BER). Substrat (latarnia morska) składa się z deoksyoligonukleotydu zawierającego pojedynczą zmianę zasadową z ugrupowaniem 6-karboksyfluoresceiny (6-FAM) sprzężonym z końcem 5' i ugrupowaniem Dabcylu sprzężonym z końcem 3' oligonukleotydu. Latarnia molekularna BER ma długość 43 zasad, a sekwencja ma na celu promowanie tworzenia struktury pętli macierzystej z 13 nukleotydami w pętli i 15 parami zasad w łodyżu1,2. Po złożeniu w tej konfiguracji ugrupowanie 6-FAM jest gaszone przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny za pomocą Förster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. Zmianę umieszcza się w taki sposób, że po usunięciu zmiany podstawowej i przecięciu nici pozostałe 5 oligonukleotydów zasad zawierających ugrupowanie 6-FAM jest uwalniane z łodygi. Uwolnienie i odłączenie od wygaszacza (Dabcyl) powoduje wzrost fluorescencji, który jest proporcjonalny do poziomu naprawy DNA. Dzięki wielokrotnym odczytom wartości fluorescencji możliwa jest ocena aktywności BER w czasie rzeczywistym. Zastosowanie standardowych ilościowych przyrządów do PCR w czasie rzeczywistym pozwala na jednoczesną analizę wielu próbek. Konstrukcja tych latarni molekularnych BER, z pojedynczą zmianą zasadową, jest podatna na analizy kinetyczne, kwantyfikację BER i walidację inhibitora oraz jest przystosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w tkankach i lizatach komórek nowotworowych lub z oczyszczonymi białkami. Analiza aktywności BER w lizatach nowotworowych lub aspiratach tkankowych przy użyciu tych znaczników molekularnych może mieć zastosowanie do pomiarów funkcjonalnych biomarkerów. Co więcej, analiza aktywności BER z oczyszczonymi białkami przy użyciu tego testu ilościowego zapewnia szybką, wysokoprzepustową metodę odkrywania i walidacji inhibitorów BER.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt latarni molekularnej

1.1 Projektowanie i zamawianie swojego molekularnego beacona

Projekt twojej latarni molekularnej musi uwzględniać następujące elementy:

  1. Mamy dobre wyniki z oligonukleotydami 43-merowego DNA. Zawartość GC powinna wynosić >32%. Wyklucz podstawę G na końcu 5'.
  2. Poproś o koniugację 6-FAM (6-karboksyfluoresceiny) na końcu 5' i Dabcyl jako modyfikację 3'.
  3. Pozycja zmiany powinna znajdować się na podstawie #6 od końca 5'.
  4. Długość trzpienia lub dupleksu spinki do włosów powinna wynosić co najmniej 15 pz.
  5. Zalecana długość pętli to 13 podstaw.
  6. Ogólna struktura latarni jest pokazana na rysunku 1.
  7. Po ustaleniu sekwencji i typu zmiany oligonukleotyd można zamówić w większości firm produkujących oligonukleotydy. Zamawiamy nasze oligonukleotydy w IDT i prosimy, aby oligonukleotydy zostały oczyszczone metodą HPLC i dostarczone w postaci proszku lub w postaci suszonej.

1.2 Wyżarzanie latarni molekularnej

  1. Rozpuścić liofilizowane oligonukleotydy DNA w buforze do rozcieńczania oligonukleotydów (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM EDTA), aby uzyskać stężony roztwór podstawowy latarni molekularnej o stężeniu 40 μM.
  2. Przygotować roztwór roboczy Molecular Beacon 200nM z roztworu podstawowego 40 μM Molecular Beacon przy użyciu buforu reakcyjnego BER (patrz poniżej). Dodaj roztwór roboczy Molecular Beacon 200 nM do sterylnej czarnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Inkubować probówkę zawierającą roztwór roboczy Molecular Beacon o długości 200 nM w dużej zlewce z wrzącą wodą przez 3 minuty.
  4. Po 3 minutach wyjmij zlewkę ze źródła ciepła i inkubuj latarnie molekularne w wodzie przez noc, aby ułatwić wyżarzanie. Używaj materiałów termoizolacyjnych zarówno nad, jak i pod zlewką, aby spowolnić proces chłodzenia.
  5. Umieść sygnalizatory w sterylnych, czarnych probówkach o pojemności 1,5 ml, po 100 μl na każdą probówkę.
  6. Przechowywać w temperaturze -30 °C.

1.3 Ocena jakości twojego molekularnego sygnalizatora

  1. Przeprowadzić analizę krzywej topnienia, aby potwierdzić, że latarnie molekularne BER nie fluoryzują, dopóki nie zostaną podgrzane, aby określić optymalną temperaturę topnienia i potwierdzić, że każda latarnia będzie fluoryzować po podgrzaniu.
  2. Dla każdej radiolatarni dodać wskazaną objętość roztworu roboczego latarni molekularnej o stężeniu 200 nM i buforu reakcyjnego BER, jak wskazano w Tabeli 1, do 6 dołków 96-dołkowej płytki Fast Optical (Applied Biosystems, Cat# 4346906).
  3. Użyj przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym, takiego jak system StepOnePlus (Applied Biosystems) lub podobnego, aby monitorować wzbudzenie barwnika FAM podczas analizy krzywej topnienia.
  4. Zaprogramuj swój instrument do PCR w czasie rzeczywistym (system StepOnePlus) tak, aby monitorował wzbudzenie barwnika FAM w funkcji wzrostu temperatury w małych przyrostach w celu analizy krzywej topnienia. System StepOnePlus jest zaprogramowany do pomiaru fluorescencji i narastania FAM w zakresie od 25 °C do 95 °C w odstępach 0,5 °C. Typową krzywą topnienia pokazano na rysunku 2.
  5. W temperaturach poniżej 50 °C powinna być widoczna niewielka fluorescencja tła lub jej brak. Sprawdzić, czy fluorescencja tła jest równomierna i gwałtowna, co wskazuje na czystość i wysoką jakość sygnalizatorów. Wartości Tm w okolicach 60 °C do 80 °C są korzystne i powinny być równe dla wszystkich rozcieńczeń.
  6. Na podstawie tej analizy określić Tmax, temperaturę przy maksymalnych wartościach fluorescencji [Fl(max)]. Proporcjonalność wartości fluorescencji przy Tm lub Tmax do sygnału wejściowego radiolatarni (stężenia) powinna być liniowa. Wartość fluorescencji przy Tmax, Fl(max) powinna co najmniej 5-krotnie przekraczać wartości tła w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie lizatu jądrowego

2.1 Podstawa Wycięcie Naprawa Buforreakcyjny 5 Przygotowanie

  1. Dodać wszystkie składniki wymienione w tabeli 2 i doprowadzić objętość buforu do 900 ml za pomocą ddH2 O.
  2. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą wodorotlenku potasu 8,0 N (Sigma, Cat#17-8).
  3. Doprowadzić objętość buforu do 1000 ml za pomocą ddH2O.
  4. Przefiltruj bufor za pomocą filtra 0,22 μM, filtra Nalgene 1 L (kat# 167-0020).
  5. Dodać ditiotreitol (DTT) bezpośrednio przed użyciem buforu reakcyjnego BER.

2.2 Hodowla komórkowa i izolacja komórek

  1. Sugeruje się hodowlę komórek do 90-100% zlewania się. Wyizolować komórki z 4-6 szalek (150 mm), aby uzyskać wystarczający lizat jądrowy do pełnego zestawu analiz (łącznie około 5 x 10 7 komórek).
  2. Zaleca się przygotowanie 3 niezależnych kultur dla 3 niezależnych osadów komórkowych w celu uzyskania kontrprób biologicznych dla każdej analizy.
  3. Lizaty jądrowe są łatwo przygotowywane przy użyciu procedury izolacji NucBuster (EMD Bioscience Calbiochem Cat#71183-3), chociaż każdy protokół izolacji jądrowej byłby odpowiedni (patrz poniżej, sekcja 2.3.).

2.3 Przygotowanie lizatu jądrowego

  1. Przed rozpoczęciem liofilizowany koktajl inhibitorów proteazy (Calbiochem, Cat#539131, Set 1) jest najpierw ponownie zawieszany w 100 μl sterylnej wody, aby przygotować 100-krotny bulion. Zużyć natychmiast lub zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. Oblicz 1 μl 100x zapasu na każde 107 wyekstrahowanych komórek, w zależności od potrzeb.
  2. Wszystkie etapy procedury ekstrakcji powinny być wykonywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zapewnić stabilność białka.
  3. Oznacz 15 ml probówek Falcon i umieść na lodzie.
  4. Usuń pożywkę wzrostową z komórek i przemyj dwukrotnie 7,5 ml zimnego PBS.
  5. Dodaj 5 ml zimnego PBS do każdego naczynia i zeskrob komórki z płytki za pomocą podnośnika do komórek. Przenieść komórki do schłodzonej probówki Falcon o pojemności 15 ml.
  6. Wirować na niskich obrotach (500 g w temperaturze 4 °C) przez 5 minut. Usunąć supernatant i oszacować objętość upakowanych komórek przez porównanie. (W jednej probówce o pojemności 1,5 ml można przetworzyć do 250 μl upakowanych komórek)
  7. Wirować przez kolejną 1 minutę przy 500 g i usunąć pozostały PBS za pomocą pipety. Zawiesić osad komórkowy w odczynniku do ekstrakcji NucBuster 1 w zależności od wielkości upakowanej objętości komórek: 150 μl odczynnika ekstrakcyjnego NucBuster 1 na 50 μl objętości upakowanej komórki. (Alternatywnie, granulki komórkowe można szybko zamrozić na suchym lodzie lub ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do dalszego działania).
  8. Po ponownym zaparowaniu przenieść lizat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
  9. Wiruj 15 sekund z dużą prędkością, inkubuj na lodzie przez 5 minut i ponownie wiruj 15 sekund z dużą prędkością.
  10. Wirować przy 13 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Supernatant zawiera frakcję cytoplazmatyczną. Wyjąć i przechowywać w temperaturze -80 °C lub wyrzucić.
  12. Ponownie zawiesić osad w mieszaninie 1 μl ponownie zawieszonego 100x koktajlu inhibitorów proteazy, 1 μl 100 mM DTT i 75 μl odczynnika do ekstrakcji NucBuster 2 na 50 μl objętości upakowanych komórek.
  13. Wiruj 15 sekund z dużą prędkością, inkubuj na lodzie przez 5 minut i ponownie wiruj 15 sekund z dużą prędkością.
  14. Wirować przy 13 000 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant zawiera białka jądrowe. Zbierz supernatant i przejdź do następnego kroku.

2.4 Dializa, kwantyfikacja białek i porcjowanie

  1. Wszystkie etapy procedury dializy powinny być wykonywane przy użyciu wstępnie schłodzonych roztworów, materiałów i sprzętu w celu zapewnienia jakości ekstraktu.
  2. Przygotować bufor do dializy (wymagany 1 l na próbkę) zgodnie z tabelą 3. Ważne: Bufor powinien być zimny (4 °C). Sugerujemy przygotowanie się co najmniej dzień wcześniej. Filtrowany bufor dializacyjny może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony, jeśli NIE dodano naziemnej telewizji cyfrowej.
  3. Zlewki do wstępnego schładzania (2 zlewki o pojemności 1 l na próbkę), bufor do dializy, komory dializacyjne, probówki do mikrowirówek, strzykawki i igły.
  4. Tuż przed użyciem - dodać 1 ml 1 M DTT na litr buforu do dializy.
  5. Lizat przygotowany w kroku 2.3 należy dializować w 0,5 l wstępnie schłodzonego buforu dializacyjnego przez 90 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając, używając kasety do dializy PIERCE Slide-A-Lyzer (kasety dializacyjne 0,5-3 ml z odcięciem 7 000 MW).
  6. Przenieść kasetę dializacyjną do drugiej zlewki zawierającej 0,5 l wstępnie schłodzonego buforu do dializy i dializować lizat przez 90 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
  7. Pobrać dializowany roztwór białka jądrowego z kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki (Fisher, kat# 309659). Użyć innej uszczelki niż poprzednio, aby wstrzyknąć białko do kasety dializatora. Należy pamiętać, że ekstrakt mógł skrystalizować z powodu wysokich stężeń białka. Staraj się dołączyć mętnie wyglądające kryształy podczas usuwania dializowanego roztworu białka jądrowego.
  8. Porcjować próbkę do mikroprobówek wirówkowych, każda o pojemności 20 μl. Szybko zamrozić na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
  9. Określić stężenie dializowanego białka przy użyciu standardowych protokołów. Przykłady oczekiwanych stężeń lizatu jądrowego przedstawiono w tabeli 4.
  10. Na koniec lizaty powinny być oceniane pod kątem kontroli jakości. Ocena lizatów będzie się różnić w zależności od eksperymentu. Jak opisano wcześniej, rutynowo analizujemy lizaty pod kątem ekspresji kilku białek BER za pośrednictwem immunoblot1,2.
  11. Etap dializy służy do wytworzenia jednolitego roztworu reakcyjnego na liniach komórkowych w celu ułatwienia porównania. Pominięcie etapu dializy może mieć wpływ na szybkość enzymatyczną i analizę kinetyczną, ponieważ roztwory soli i warunki reakcji nie są już identyczne w różnych liniach komórkowych i preparatach ze względu na różne wymagane rozcieńczenia. Zaobserwowaliśmy jednak, że stosowanie lizatów większych niż 5 μg/μl i dodanie wystarczającej ilości buforu reakcyjnego pozwala na pominięcie etapu dializy (dane nie pokazane). W przypadku badań inhibitorów, które nie wymagają porównywania różnych lizatów komórkowych, dializa może nie być konieczna. Zalecamy jednak dializy zgodnie ze wskazaniami.

3. Test molekularnej latarni morskiej

3.1 Wymagania sprzętowe

  1. Ilościowy przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym, taki jak StepOnePlus qRT-PCR lub porównywalny, lub 96-dołkowy fluorometr płytkowy zdolny do wykrywania i pomiaru fluorescencji FAM w czasie rzeczywistym. Uwaga: Ta procedura ma zastosowanie do każdej maszyny, która jest w stanie odczytywać wartości fluorescencji latarni i rejestrować je w czasie rzeczywistym. Urządzenie powinno jednak umożliwiać użytkownikowi dostęp do surowych wartości fluorescencji w celu analizy danych.
  2. Wirówka kompatybilna z używanymi probówkami lub płytkami optycznymi qRT-PCR.
  3. Microsoft Excel do analizy zebranych danych.

3.2 i odczynniki

  1. Probówki lub płytki optyczne qRT-PCR z odpowiednimi osłonami.
  2. Bufor reakcyjny BER (patrz powyżej i tabela 2).
  3. Dializowane ekstrakty białek jądrowych, przygotowane w krokach 2.3 i 2.4, rozcieńczone do 2 μg/μl białka buforem reakcyjnym BER zawierającym DTT.
  4. Latarnie molekularne rozcieńczone do 200 μM buforem reakcyjnym BER w celu wytworzenia roztworu roboczego sygnalizatorów molekularnych (patrz wyżej).

3.3 Konfiguracja testu (Tabela 5)

  1. Maszyna qRT-PCR nie jest zwykle używana jako fluorymetr, dlatego należy zmienić metodę pracy.
    1. Zaprogramuj pierwszy stopień i ustaw temperaturę reakcji na 37 °C z czasem cyklu (punkty czasowe dla pomiarów) wynoszącym 20 sekund przy minimum 180 cyklach (lub więcej, w zależności od projektu testu naprawy). Upewnij się, że zbierasz dane podczas cykli. W związku z tym urządzenie będzie zbierać dane co 20 sekund, łącznie przez 1 godzinę.
    2. Utwórz drugi stopień, który podnosi temperaturę do Tmax konkretnej latarni, temperatury z maksymalną fluorescencją, jak określono w kroku 1.3 (Ocena jakości latarni molekularnej). Czas cyklu powinien ponownie wynosić 20 sekund, co daje łącznie 15 cykli. Będzie on zbierał dane co 20 sekund przez 5 minut przy maksymalnej możliwej fluorescencji radiolatarni. Wartości fluorescencji mierzone podczas cykli przy Tmax stosuje się do normalizacji wartości fluorescencji w każdym dołku (krok 4.2a). Jeśli używasz kilku różnych beaconów, upewnij się, że uwzględniłeś kroki, które zapewniają podobne powtarzalne wartości Tmax tych beaconów.
    3. Ustawić objętość reakcyjną na 25 μl.
  2. Skonfiguruj projekt płytki na maszynie qRT-PCR za pomocą oprogramowania Applied Biosystems. Interesują nas tylko surowe wartości fluorescencji, dlatego wybieramy "Krzywą standardową" - typ eksperymentu.
  3. Uzupełnij układ płyty. Przykład przedstawiono w tabeli 5. NIE dodawaj niczego do studzienek wybranych jako krzywa standardowa.

3.4 Uruchom test

  1. Ważne: Używaj wstępnie schłodzonych materiałów i roztworów. Zachowaj spokój do momentu uruchomienia i wykrycia.
  2. Dodać odpowiednią ilość naziemnej telewizji cyfrowej (DTT) do bufora reakcyjnego BER, który ma być użyty.
  3. Rozcieńczyć roztwór białka do stężenia 2 μg/μl za pomocą buforu reakcyjnego BER (z DTT).
  4. Do wstępnych eksperymentów sugerujemy użycie 10 μg dializowanego lizatu jądrowego na studzienkę (5 μl / dołek) i 1 pmol substratu, latarni molekularnej o końcowym stężeniu 40 nM (5 μl / dołek). Niezmiennie uzyskujemy wysokiej jakości i powtarzalne wyniki przy użyciu 10 μg lizatu komórkowego, chociaż możliwe jest, że różne lizaty komórkowe lub substraty beacon mogą dyktować wyższe lub niższe stężenia białka.
    1. Składnikami testu w każdym dołku są 15 μl buforu reakcyjnego BER, 5 μl radiolatarni i 5 μl lizatu jądrowego. Uruchom każdą kombinację beacon/lizat w trzech egzemplarzach.
    2. Dla każdej radiolatarni wymaganych jest kilka kontroli ujemnych, w tym próbek bez radiolatarni, takich jak 25 μl samego buforu reakcyjnego BER i 20 μl buforu reakcyjnego BER z 5 μl lizatu i 20 μl buforu reakcyjnego BER z 5 μl radiolatarni bez lizatu.
    3. Dla każdego lizatu jądrowego wymaganych jest kilka próbek kontrolnych. Należą do nich kontrola ujemna [15 μl buforu reakcyjnego BER, sygnalizator kontrolny 5 μl (brak uszkodzenia) i 5 μl lizatu próbki]. Sugerujemy również włączenie eksperymentalnych kontroli pozytywnych, takich jak włączenie radiolatarni zawierających THF, które naśladują miejsce zasadowe zawierające oligonukleotydy i są łatwo nacinane [15 μl buforu reakcyjnego BER, 5 μl radiolatarni THF i 5 μl lizatu próbki]. Oczywiście, dokładna kontrola pozytywna będzie zależała od ogólnego projektu eksperymentu.
  5. Na przykład należy postępować zgodnie z poniższą tabelą 5, aby zapoznać się z układem płyt.
  6. Pigazować do tub lub płytek optycznych na lodzie lub chłodzonym stojaku, aby zminimalizować inicjację reakcji przed wykryciem sygnału.
  7. Najpierw odpipetować bufor reakcyjny BER do wszystkich studzienek.
  8. Następnie pipety sygnalizacyjne zgodnie z układem płytek do odpowiednich studzienek i zawsze pipety lizaty jako ostatnie do studzienek, aby zminimalizować inicjację reakcji przed wykryciem sygnału.
  9. Dokładnie uszczelnij probówki lub płytkę, wymieszaj i odwiruj za pomocą wirówki, aby zebrać roztwory na dnie probówek lub płytki
  10. Włóż płytkę do maszyny qRT-PCR i rozpocznij test.
  11. Po zakończeniu wyeksportuj surowe dane, najlepiej w formacie Excel. W przypadku systemu StepOnePlus potrzebne są tylko dane wieloskładnikowe. Zawiera on wszystkie wartości fluorescencji przy wielokrotnych odczytach, posortowane według koloru barwnika i dobrze.  

4. Analiza molekularnego testu sygnalizatora

Użyliśmy oprogramowania Microsoft Excel do przeprowadzenia tych analiz i obliczeń. Zalecamy stworzenie szablonów i makr, które pozwolą na łatwą i szybką analizę oraz wyświetlanie wykresów na podstawie danych pochodzących ze standardowych formatów 96-dołkowych.

4.1 Usuwanie tła

  1. Korzystając z surowych wartości fluorescencji z danych wieloskładnikowych, najpierw uporządkuj dane według studzienki/próbki. W przypadku systemu StepOnePlus można to osiągnąć poprzez eksport danych "między kolumnami", w wyniku czego powstaje plik Excel z wierszami wyświetlającymi poszczególne wielokrotne odczyty w różnych cyklach dla różnych dołków w kolumnach.
  2. Dla każdej pojedynczej radiolatarni molekularnej należy odjąć wartości fluorescencji tła wykryte w kontrolach ujemnych (20 μl buforu reakcyjnego BER i 5 μl radiolatarni) od wartości fluorescencji w każdym cyklu we wszystkich studzienkach przy użyciu tej radiolatarni molekularnej. Powoduje to usunięcie zmian fluorescencji tła niezwiązanych z lizatem, z przyszłej analizy.

4.2 Normalizacja Fl(Tmax)

Aby rozwiązać problem zmienności w pipetowaniu i wykrywaniu fluorescencji w różnych studzienkach, normalizujemy dane do maksymalnych wartości fluorescencji (które korelują z sygnałem wejściowym beacon).

  1. Obliczyć średnie wartości fluorescencji cykli przy Tmax dla pojedynczej studzienki: Fl(Tmax) (krok 3.3aii).
  2. Oblicz współczynniki Fl(cykl x)/Fl (Tmax) i pomnóż przez 100. Przy prawdopodobnym założeniu, że Fl(Tmax) odpowiada maksymalnej możliwej wartości fluorescencji po pełnym nacięciu, te znormalizowane dane reprezentują % wolnego FAM (= % naciętej latarni BER).
  3. Połączyć trzy próbki, uśredniając dane (% wolnego FAM) z 3 dołków dla każdego cyklu (do cyklu 180) i obliczyć błędy w każdym z nich.
  4. Obliczaj czasy, mnożąc 20 sekund przez każdy cykl.
  5. Ponieważ różnica między studniami w wykrywaniu fluorescencji może być znacząca, zalecamy dodanie barwnika fluorescencyjnego, takiego jak ROX, do sygnalizatora molekularnego, który służy jako standard do ponownej regulacji wartości fluorescencji poszczególnych studzienek. W takim przypadku barwnik ROX byłby używany jako wewnętrzny wzorzec (pasywne odniesienie) w każdym dołku. Widma wzbudzenia i emisji ROX (wzbudzenie - 588 nm, emisja 608 nm) różnią się od widma barwnika 6-FAM zastosowanego w teście (wzbudzenie - 495 nm, emisja - 520 nm). Barwnik ROX umożliwiłby etap normalizacji podobny do konwencjonalnych procedur RT-PCR, który umożliwia normalizację różnic między studniami, które mogą wystąpić z powodu artefaktów. Mogą one wynikać z błędów w pipetowaniu lub mogą wynikać z różnic w skuteczności wykrywania fluorescencji między studzienkami.

4.3 Fabuła

  1. Wykreśl znormalizowane dane fluorescencji (% wolnego FAM) w funkcji czasu (w sekundach) na wykresie punktowym z odpowiednimi błędami.
  2. Zalecamy analizę kinetyki naprawy w co najmniej trzech różnych preparatach lizatu jądrowego reprezentujących kontrpróby biologiczne. Aby ocenić wariancję, należy wyświetlić błędy międzyeksperymentalne obliczone na podstawie średnich z każdego pojedynczego eksperymentu.
  3. Reprezentatywna analiza dwóch lizatów komórek nowotworowych: LN428, linii komórkowej glejaka z niewykrywalnymi poziomami glikozylazy DNA metylopuryny (MPG) i LN428/MPG, tej samej linii komórkowej zaprojektowanej w celu zwiększenia ekspresji MPG; obie linie komórkowe mają równoważne poziomy endonukleazy AP 1 (APE1)1,2. Każdy z nich badano pod kątem aktywności APE1 i aktywności MPG za pomocą sygnalizatora molekularnego BER THF (ryc. 3) i sygnalizatora molekularnego BER Hx (ryc. 4), gdzie THF = tetrahydrofuran (substrat dla APE1) i Hx = hipoksantyna (substrat dla MPG). Uwaga: Na rysunku 3 (substrat THF) wyniki lizatów LN428/MPG wykazują niższą maksymalną fluorescencję bezwzględną w porównaniu z lizatami LN428. Jest to wynik niższej wartości wejściowej sygnału ostrzegawczego, określonej za pomocą wartości Tmax (patrz 3.3a). Gdy ta niższa wartość została użyta do znormalizowania wyników, powoduje to dużą zmianę na wykresie. To dobrze ilustruje znaczenie normalizacji danych. Wykreślenie samych bezwzględnych wartości fluorescencji sugerowałoby, że wskaźniki naprawy między komórkami LN428 i LN428 / MPG są różne. Jednakże, gdy dane są znormalizowane w celu uwzględnienia zmienności między odwiertami, okazuje się, że różnica w szybkości naprawy, w której pośredniczy APE1, jest minimalna.

5. Reprezentatywne wyniki

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA i endonukleazy AP w lizatach jądrowych komórek za pomocą molekularnych znaczników naprawy przez wycinanie zasady (BER) (Rysunek 1). Po wyżarzaniu sugerujemy przeprowadzenie analizy krzywej topnienia (Tabela 1) jako oceny jakości sygnalizatora molekularnego (Rysunek 2). Następnie można przygotować lizaty jądrowe, wykorzystując składniki buforowe wymienione w tabeli 2. Dializować lizat w 0,5 l wstępnie schłodzonego buforu do dializy przez 90 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając przy użyciu kasety do dializy PIERCE Slide-A-Lyzer z buforem dializacyjnym wymienionym w tabeli 3. Pobrać dializowany roztwór białka jądrowego z kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki. Użyć innej uszczelki niż poprzednio, aby wstrzyknąć białko do kasety dializatora. Określić stężenie dializowanego białka przy użyciu standardowych protokołów. Przykłady oczekiwanych stężeń lizatu jądrowego przedstawiono w tabeli 4. Przeprowadzić reakcję, jak wskazano powyżej (krok 3.4), używając układu płytek, jak pokazano w tabeli 5. Reprezentatywna analiza dwóch lizatów komórek nowotworowych: LN428, linii komórkowej glejaka z niewykrywalnymi poziomami glikozylazy DNA puryny metylowej (MPG) i LN428 / MPG, tej samej linii komórkowej zaprojektowanej w celu podwyższonej ekspresji MPG; obie linie komórkowe mają równoważne poziomy endonukleazy AP 1 (APE1)1,2. Każdy z nich badano pod kątem aktywności APE1 i aktywności MPG za pomocą sygnalizatora molekularnego BER THF (ryc. 3) i sygnalizatora molekularnego BER Hx (ryc. 4), gdzie THF = tetrahydrofuran (substrat dla APE1) i Hx = hipoksantyna (substrat dla MPG). Wreszcie, używając sygnalizatora molekularnego BER dU / A, który informuje o aktywności glikozylazy uracylowej, pokazujemy, że wyjście sygnału lub siła sygnału jest maksymalna przy 10 μg białka i spada do niewykrywalnego poziomu przy 0,62 μg białka (ryc. 5).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Ogólna struktura latarni molekularnej BER. Pokazano sekwencję i ogólną konstrukcję sygnalizatorów molekularnych BER zastosowanych w niniejszym dokumencie jako cząsteczki jednoniciowej, po wyżarzaniu i ponownie po stopieniu. Pogrubiona i pochylona kursywą część sekwencji to rdzeń (15 podstaw), a podkreślona część sekwencji to pętla (13 podstaw). FAM = 5' barwnik fluorescencyjny 6-karboksyfluoresceina [na końcu 5'; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, Współczynnik ekstynkcji (260 nm): 20,960; Współczynnik ekstynkcji (przy maksymalnej absorbancji): 75 000] i Dabcyl = środek hartujący 3' Dabcyl [na końcu 3'; Abmax = 453 nm; Zakres hartowania = 425-520 nm]. X = zmiana (różni się w zależności od pytania badawczego) i Y = podstawa naprzeciwko zmiany (różni się w zależności od pytania badawczego).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Krzywa topnienia. Reprezentatywną krzywą topnienia pokazano dla BER Molecular Beacon Control (A) i BER Molecular Beacons zawierających ugrupowanie tetrahydrofuranu (THF) (B) lub ugrupowanie hipoksantyny (Hx) (C). Stężenia oligonukleotydów wahały się od 0 nM (ciemnoniebieski), 8 nM (czerwony), 16 nM (zielony), 32 nM (fioletowy), 64 nM niebieski do 128 nM (pomarańczowy). Jak opisano w kroku 1.3, wyżarzone oligonukleotydy podgrzano od 25 °C do 95 °C w odstępach 0,5 °C, a system StepOnePlus jest zaprogramowany do pomiaru fluorescencji FAM w każdym odstępie 0,5 °C.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Reprezentatywne dane za pomocą sygnalizatora molekularnego BER THF. Aktywność endonukleazy AP specyficzną dla hydrolizy azasadowego analogu tetrahydrofuranu (THF) mierzono w lizatach jądrowych z kontrolnej linii komórkowej (LN428) i linii komórkowej z nadekspresją MPG (LN428 / MPG). Każdy lizat analizowano przy użyciu BER Molecular Beacon Control (LN428, zielony; LN428/MPG, fioletowy) lub BER THF Molecular Beacon (LN428, niebieski; LN428/MPG, czerwony). Wyniki są podawane jako (A) średnie jednostki odpowiedzi fluorescencji i (B) te same dane znormalizowane do danych wejściowych beacon, jak opisano w sekcji 4 powyżej (THF = tetrahydrofuran).

figure-protocol-4
Rysunek 4. Reprezentatywne dane wykorzystujące aktywność glikozylazy BER Hx Molecular Beacon DNA specyficzną dla usuwania substratu MPG hipoksantyny (Hx) mierzono w lizatach jądrowych z kontrolnej linii komórkowej (LN428) i linii komórkowej z nadekspresją MPG (LN428 / MPG). Każdy lizat analizowano przy użyciu BER Molecular Beacon Control (LN428, zielony; LN428/MPG, fioletowy) lub BER Hx Molecular Beacon (LN428, niebieski; LN428/MPG, czerwony). Wyniki są przedstawiane jako (A) średnie jednostki odpowiedzi fluorescencyjnej i (B) te same dane znormalizowane, jak opisano w sekcji 4 powyżej (Hx = hipoksantyna).

figure-protocol-5
Rysunek 5. Reprezentatywne dane z wykorzystaniem sygnalizatora molekularnego BER dU/A na różnych poziomach białka. Aktywność glikozylazy DNA (UNG) specyficzną dla usuwania uracylu (dU/A) mierzono w lizatach jądrowych z komórek T98G. Lizat T98G analizowano przy użyciu BER Molecular Beacon Control lub BER dU/A Molecular Beacon, przy poziomach białka 10, 5, 2,5, 1,25 lub 0,62 μg, jak pokazano na rysunku. Wyniki są danymi znormalizowanymi, jak opisano w sekcji 4 powyżej.

Stężenie latarni morskiej (nM) 0 8 16 Rozdział 32 Rozdział 64 Rozdział 128 Dodano roztwór roboczy Molecular Beacon (200nM) (μL) 0 1 cyfra arabska 4 8 16 Bufor reakcyjny BER (bez naziemnej telewizji cyfrowej) (μL) 25 24 23 21 17 9

Tabela 1. Układ eksperymentu z krzywą topnienia.

Łącznie 1 L Wymagana objętość roztworu podstawowego Zgodność z roztworem podstawowym Końcowa kondysja. HEPES-KOH 25 ml 1M pH 7,8 25 mM Kcl 75 ml 2 mln 150 mM Edta 1 ml 0,5 m pH8,0 0,5 mM glicerol 10 ml N/a 1 proc. DTT (dodaj przed użyciem) 0,5 ml 1 mln 0,5 mM H2O 888,5 ml N/a N/a

Tabela 2. Bufor reakcyjny BER.

Łącznie 1 L Wymagana objętość roztworu podstawowego Zgodność z roztworem podstawowym Końcowa kondysja. HEPES-KOH 50 ml 1M pH 7,5 50 mM Kcl 50 ml 2 mln 100 mM Edta 1 ml 0,5 m pH8,0 0,5 mM glicerol 200 ml N/a 20% DTT (dodaj przed użyciem) 1 ml 1 mln 1 mM H2O 698 ml N/a N/a

Tabela 3. Bufor do dializy.

Linia komórkowa Stężenie białka (μg/μL) LN428 powiedział: Klasa 5,34 LN428/MPG Z godziny 4,79

Tabela 4. Wyniki oznaczania białka.

Kontrola ujemna 25 μl bufor BER (Kontrola w tle) 20μL bufor BER
5μL Con Beacon
BRAK lizatu (Próba w trzech egzemplarzach)
15μL bufor BER
5μL Con Beacon
5μL LN428 Lizat (Próba w trzech egzemplarzach)
15μL bufor BER
5μL Con Beacon
5μL LN428/MPG Lizatu Kontrola ujemna 25 μl bufor BER (Kontrola w tle) 20μL bufor BER
Latarnia morska 5μL THF
BRAK lizatu (Próba w trzech egzemplarzach) 15 μl buforu BER
Latarnia morska 5μL THF
5μL LN428 Lizat (Próba w trzech egzemplarzach) 15 μl buforu BER
Latarnia morska 5μL THF
5μL LN428/MPG Lizatu Kontrola negatywna
20μL bufor BER
5 μl lizatu (Kontrola w tle) 20μL bufor BER
5μL Hx Latarnia morska
BRAK lizatu (Próba w trzech egzemplarzach)
15μL bufor BER
5μL Hx Latarnia morska
5μL LN428 Lizat (Próba w trzech egzemplarzach) 15 μl buforu BER
5μL Hx Latarnia morska
5μL LN428/MPG Lizatu Kontrola negatywna
20μL bufor BER
5 μl lizatu      

Tabela 5. Konfiguracja testu latarni molekularnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje ponad 600 cytatów, w których użyto terminu "latarnia molekularna" do wykrywania i ilościowego określania wielu cząsteczek i aktywności enzymatycznych, w tym między innymi aktywności helikazy6, aktywności polimerazy DNA7,8, aktywności ligazy DNA9, aktywności telomerazy10, aktywności fotoliazy DNA11 i hybryd DNA/RNA12. Oprócz zastosowania sygnalizatorów molekularnych do pomiaru aktywności naprawy DNA wymienionych powyżej, my i inni wykazaliśmy użyt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RWS jest konsultantem naukowym firmy Trevigen, Inc. Pozostali autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Pittsburgh i National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] do RWS. Wsparcie dla UPCI Lentiviral Facility zostało udzielone RWS przez Cancer Center Support Grant z National Institutes of Health [P30 CA047904]. Wsparcia udzielił również Wydział Farmakologii i Biologii Chemicznej Uniwersytetu w Pittsburghu. Wsparcia udzieliło również ESTRO dla CV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek potasuFisherP217-500Klasa molekularna
EDTAFisherBP120-500
GlicerolFisherBP229-1Klasa molekularna
DTTFisherBP172-5
HEPES- RoztwórInvitrogen15630
HEPES-SólSigmaH4034-500G
Wodorotlenek potasuSigma17-8
0,22μ FiltrM Nalgene167-0020
Produkty do dializy Slide-A-LyzerPierce66373MW 7000
StrzykawkaFisher309659
IgłaFisher305196
1,5 ml Probówki do mikrowirówekFisher05-408-129Czarne
15 ml probówki FalconFisher352097
Zestaw do ekstrakcji białek NucBusterCalbiochem71183
PBSInvitrogen14190
Latarnie molekularneIDT
BioRad Test białkowy koncentrat odczynnika barwnikowegoBioRadCat# 500-0006

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
  2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
  3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
  4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
  5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
  6. Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
  7. Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
  8. Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
  9. Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
  10. Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
  11. Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
  12. Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
  13. Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
  14. Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
  15. Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Base Excision RepairMolecular Beacon AssayDNA Glycosylase ActivityAP Endonuclease ActivityReal time Fluorescence MeasurementQuantitative PCR AnalysisNuclear Lysate PreparationLesion specific DetectionFRET based QuantificationDNA Repair Kinetics

Powiązane artykuły