Artykuł metodologiczny

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4172

⸱

9 sierpnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Materials Science and Engineering, University of Sheffield , 2Department of Biomedical Science, University of Sheffield , 3Department of Chemistry, University of Sheffield

W tym artykule

Podsumowanie

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości biomechanicznych.

Streszczenie

Elektroprzędzenie jest powszechnie stosowaną i wszechstronną metodą wytwarzania rusztowań (często biodegradowalnych) do trójwymiarowej inżynierii tkankowej.1, 2, 3 Wiele tkanek in vivo, takich jak skóra, pęcherz moczowy, dno miednicy, a nawet podniebienie twarde podczas wzrostu dzieci, ulega rozciąganiu dwuosiowemu w różnym stopniu. Wytwarzając rusztowania do tych celów, istnieje potrzeba opracowania struktur o odpowiednich właściwościach biomechanicznych (osiąganych z komórkami lub bez nich), które są sterylne i nadają się do użytku klinicznego. Celem niniejszej pracy nie jest ustalenie podstawowych parametrów elektroprzędzenia (ponieważ istnieje obszerna literatura na ten temat), lecz opisanie sposobu modyfikacji przędzionych rusztowań po ich wytworzeniu, aby dostosować je do potrzeb inżynierii tkankowej – w tym opracowano kwestie grubości, właściwości mechanicznych oraz sterylizacji (wymaganej do zastosowań klinicznych). Opisano również sposób hodowli komórek na rusztowaniach i poddawania ich odkształceniu dwuosiowemu w celu ich kondycjonowania do konkretnych zastosowań.

Elektroprzędzenie ma tendencję do wytwarzania cienkich arkuszy; w miarę jak kolektor elektroprzędzenia pokrywa się izolującymi włóknami, staje się on słabym przewodnikiem, co sprawia, że włókna przestają się na nim osadzać. Opisujemy zatem podejścia pozwalające na wytwarzanie grubszych struktur poprzez wyżarzanie termiczne lub w oparach, co zwiększa wytrzymałość rusztowań, lecz niekoniecznie ich elastyczność. Opisano również sekwencyjne przędzenie rusztowań z różnych polimerów w celu uzyskania złożonych struktur. Metodologie sterylizacji mogą niekorzystnie wpływać na wytrzymałość i elastyczność rusztowań. Porównujemy trzy metody pod kątem ich wpływu na właściwości biomechaniczne elektroprzędzionych rusztowań z kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA).

Opisano obrazowanie komórek na rusztowaniach oraz ocenę produkcji białek macierzy pozakomórkowej (ECM) przez komórki na tych rusztowaniach. Hodowla komórek na rusztowaniach in vitro może zwiększyć wytrzymałość i elastyczność rusztowania, jednak literatura z zakresu inżynierii tkankowej wskazuje, że komórki hodowane w warunkach statycznych często nie produkują odpowiedniej ECM. Dostępnych jest niewiele systemów komercyjnych umożliwiających hodowlę komórek na rusztowaniach w dynamicznych reżimach kondycjonowania – przykładem jest Bose Electroforce 3100, który może być wykorzystany do realizacji programu kondycjonowania komórek w rusztowaniach unieruchomionych za pomocą uchwytów mechanicznych w komorze wypełnionej pożywką.4 Opisano podejście do budowy budżetowego bioreaktora do hodowli komórek służącego do kontrolowanej deformacji w 2 wymiarach. Wykazano, że w tych warunkach można indukować komórki do produkcji elastyny. Na koniec opisano ocenę właściwości biomechanicznych przetworzonych rusztowań hodowanych z komórkami lub bez nich.

Protokół

1. Elektroprzędzenie włókien losowych i uporządkowanych

Elektroprzędzenie pozwala na tworzenie drobnych sieci włókienistych poprzez wykorzystanie potencjału elektrycznego do przyciągania roztworu polimeru w stronę uziemionego kolektora. Kolektory mogą mieć bardzo wiele kształtów i mogą być statyczne lub, co jest częstsze, obrotowe. Rozpuszczalnik odparowuje, zanim roztwór dotrze do kolektora, a strumień twardnieje, tworząc włókno.

Każdy polimer wymaga osobnego zestawu warunków w celu wytworzenia danego typu włókien. Na proces elektroprzędzenia wpływają: stężenie polimeru, rodzaj rozpuszczalnika, odległość między pompowanym roztworem a uziemionym kolektorem, różnica potencjałów między nimi, prędkość obrotowa kolektora, szybkość przepływu, temperatura oraz wilgotność. Istnieje wiele badań opisujących dobór parametrów elektroprzędzenia oraz ich wpływ na otrzymane rusztowania (np. średnicę włókien, morfologię i orientację).5, 6, 7, 8 W niniejszych eksperymentach rusztowania przędziono w warunkach dobranych w naszych poprzednich badaniach.2, 9

Poniższe metody są odpowiednie do wytwarzania rusztowań elektroprzężonych z PLGA, kwasu polimlekowego (PLA), poli ε-kaprolaktonu (PCL) oraz poli(hydroksymaślanu-ko-hydroksywalerianu) (PHBV) z wykorzystaniem kolektora obrotowego, jak pokazano na Rysunku 1. W całym procesie stosowany jest rozpuszczalnik dichlorometan (DCM). Opisana metoda pozwala na otrzymanie mikrowłóknistych rusztowań z PLGA, PLA i PCL oraz nanowłóknistego rusztowania z PHBV z koralikami o rozmiarach mikrometrycznych (morfologia „naszyjnika z pereł”).

  1. Pokryć obrotowy kolektor w kształcie mandrylu folią aluminiową, stroną polerowaną/błyszczącą skierowaną na zewnątrz. Nasz mandryl miał szerokość 20 cm i średnicę 10 cm.
  2. Przygotować roztwory polimerów; PLA, PCL i PHBV przygotowuje się jako roztwory 10% wag. w DCM. PLGA przygotowuje się jako roztwór 20% wag. w DCM.
  3. Umieścić 4 strzykawki o objętości 5 ml na pompie strzykawkowej. Strzykawki napełnia się tak, aby każda zawierała 5 ml polimeru, co daje łącznie 20 ml.
  4. Dla PLA, PCL i PHBV zastosować szybkość przepływu 40 μLmin-1 na strzykawkę.
  5. Dla PLGA zastosować szybkość przepływu 30 μLmin-1 na strzykawkę.
  6. Dla PLA, PCL i PLGA zastosować odległość roboczą 17 cm od końcówki igły do mandryla.
  7. Dla PHBV zastosować odległość roboczą 10 cm od końcówki igły do mandryla.
  8. Przyłożyć napięcie +17000 V (73030 P, Genvolt, Shropshire, UK) do igieł strzykawek i przeprowadzić elektroprzędzenie z odpowiedniej odległości na mandryl pokryty folią aluminiową.
  9. W celu uzyskania włókien chaotycznych obracać mandryl z prędkością 200 rpm.
  10. W celu uzyskania włókien uporządkowanych obracać mandryl z prędkością 1000 rpm.
  11. Rusztowania można przechowywać na folii aluminiowej w warunkach suchych. Zaleca się przechowywanie w szczelnym pojemniku w temperaturze 4 °C w obecności osuszacza. Z naszego doświadczenia wynika, że w tych warunkach rusztowania pozostają stabilne przez co najmniej 4 miesiące (prawdopodobnie znacznie dłużej) (nie znamy żadnych opublikowanych badań dotyczących długoterminowych warunków przechowywania rusztowań).

2. Produkcja złożonych rusztowań metodą przędzenia sekwencyjnego

Sekwencyjne przędzenie umożliwia łączenie właściwości różnych materiałów w celu stworzenia materiału, który posiada najlepsze cechy obu składników. PHBV tworzy płaski, gęsty i kruchy arkusz, podczas gdy przędzenie PLA lub PCL daje arkusze o niskiej gęstości i wysokiej elastyczności. Oba materiały wspomagają adhezję komórek. Następcze przędzenie tych materiałów prowadzi do powstania gęstej, nieprzepuszczalnej dla komórek i elastycznej membrany.

  1. Przygotować zestaw do elektroprzędzenia zgodnie z sekcją 1, stosując warunki przędzenia dla PHBV.
  2. Przeprowadzić elektroprzędzenie PHBV w opisany wyżej sposób.
  3. Bez zmiany folii aluminiowej, nanieść drugą warstwę polimeru, stosując parametry i standardowe warunki dla tego polimeru (np. odległość od bębna do igły 17 cm, 17000 V, 200 rpm dla PLA). Ten proces addytywny pozwala na zbudowanie dwuwarstwowego rusztowania, tworząc strukturę bionwarstwową.

3. Wytwarzanie rusztowań wielowarstwowych poprzez wyżarzanie kilku warstw razem

  1. Rusztowania można tworzyć w wielu warstwach poprzez wyżarzanie termiczne. W tym celu 4 arkusze PLGA układa się jeden na drugim, a następnie wyżarza w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.
  2. Rusztowania można również wyżarzać metodą wyżarzania w oparach. W tej metodzie 4 arkusze PLGA układa się jeden na drugim i zawiesza 2 cm nad objętością DCM (10 ml) na 1 godzinę. Proces ten przeprowadza się w szczelnym pojemniku w temperaturze pokojowej.

4. Aseptyczna produkcja i sterylizacja poprodukcyjna rusztowań elektroprzędzionych

  1. Aseptyczną produkcję rusztowań można przeprowadzić za pomocą elektroprzędzenia w środowisku aseptycznym w komorze z laminarnym przepływem powietrza wewnątrz pomieszczenia czystego. W tym celu można zastosować polimery sterylne klasy medycznej lub polimery wysterylizowane poprzez inkubację w DCM. Po rozpuszczeniu polimery są elektroprzędzione na sterylną folię owiniętą wokół wysterylizowanego trzpienia. Następnie z rusztowaniami postępuje się aseptycznie. Sterylność weryfikuje się poprzez inkubację próbek rusztowania w pożywkach wzrostowych bez antybiotyków przez odpowiedni czas.
  2. W przypadku dezynfekcji etanolem (metoda ta jest użyteczna eksperymentalnie, ale nie jest uznaną metodologią sterylizacji, którą można zastosować w klinice) rusztowania umieszcza się na krótko (15 min) w 70% v/v roztworze etanolu w wodzie destylowanej. W praktycznych celach eksperymentalnych jest to zazwyczaj wystarczające do dezynfekcji rusztowań, tak aby można było je następnie z sukcesem połączyć z hodowlami komórek.
  3. W celu sterylizacji kwasem nadoctowym rusztowania zanurza się w kwasie nadoctowym (0,1% v/v w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)) i inkubuje przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, zgodnie z opisem Selim et al.9
  4. W przypadku sterylizacji gamma rusztowania naświetla się dawką 3 kGy przy użyciu źródła cezu, zgodnie z opisem Selim et al.9

5. Badania biomechaniczne rusztowań

  1. Rusztowania wycina się w prostokąty o wymiarach 5 mm x 20 mm, mierzy ich grubość za pomocą mikrometru, a następnie umieszcza w urządzeniu Bose Electroforce 3100. Urządzenie to przykłada siłę od 0-22 N do przemieszczenia wynoszącego 6 mm i wykreśla zależność obciążenia od przemieszczenia w formie krzywej naprężenie/odkształcenie. Pozwala to na obliczenie modułu Younga oraz elastyczności.

6. Wizualizacja komórek na rusztowaniach i ocena produkcji ECM

Komórki można barwić witalnymi barwnikami fluorescencyjnymi, które pozwalają obserwować komórki na rusztowaniach podczas ich przylegania, migracji i proliferacji. Po zakończeniu hodowli obecność komórek na rusztowaniach można określić poprzez barwienie jąder komórkowych przy użyciu 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Produkcja ECM przez komórki na rusztowaniu może zostać oceniona poprzez barwienie komórek na szereg białek ECM, w tym elastynę, jak pokazano w niniejszym przykładzie. Wszystkie użyte rusztowania miały zmierzoną grubość co najmniej 0.2 mm i przed wysianiem zostały wycięte w kwadraty o wymiarach 1.5 cm x 1.5 cm.

W badaniach tych konsekwentnie wykorzystywane są ludzkie fibroblasty skóry właściwej ze względu na ich rolę w rekonstrukcji tkanek miękkich, która stanowi główny obszar zainteresowań badawczych naszego laboratorium.

Komórki pozyskuje się z próbek skóry pobranych od pacjentek poddawanych planowym zabiegom redukcji piersi lub abdominoplastyki (wyrażono zgodę na wykorzystanie ich tkanek do celów badawczych). Tkanki są zbierane i wykorzystywane anonimowo zgodnie z licencją Banku Tkanek Badawczych (Research Tissue Bank Licence 12179). Tkanki przemywa się PBS zawierającym streptomycynę (0.1 mg/ml), penicylinę (100 IU/ml) oraz amfoterycynę B (0.5 μg/ml). Próbki tkanek inkubuje się w 0.1% w/v trypsynie i 0.1% glukozie w PBS (12-18 godzin, 4 °C). Skórę właściwą oddziela się, drobno sieka i inkubuje z 10 ml kolagenazy (0.5% w/v w DMEM i 10% FCS, 37 °C przez 18 godzin). Wirowanie otrzymanej zawiesiny komórkowej (400 g przez 10 min) pozwala uzyskać osad komórek, które można hodować i pasażować w DMEM uzupełnionym o płodową surowicę cielęcą (FCS, 10% v/v), streptomycynę (0.1 mg/ml), penicylinę (100 IU/ml) oraz amfoterycynę B (0.5 μg/ml). W eksperymentach wykorzystuje się wyłącznie fibroblasty z pasaży 4-9.

  1. Ludzkie fibroblasty skóry, po osiągnięciu konfluencji w kolbie T75 (EasyFlask, Nunc, Nowy Jork, USA), są pasażowane poprzez dodanie trypsyny/EDTA (5 ml, 5 mg/ml trypsyny, 2 mg/ml EDTA w soli fizjologicznej) i inkubację przez 5 minut w 37 °C. Zawiesinę wiruje się przez 10 minut (150 g). Komórki resuspenduje się w 5 ml DMEM (uzupełnionego o FCS (10% v/v), streptomycynę (0.1 mg/ml), penicylinę (100 IU/ml) i amfoterycynę B (0.5 μg/ml)), a następnie zlicza się je za pomocą komory countingowej i dostosowuje stężenie do wysiewu. Komórki są zazwyczaj wysiewane w zagęszczeniu 50 000 komórek na dołek.
  2. W razie potrzeby, przed wysianiem komórek na rusztowanie, można je wstępnie oznakować za pomocą barwników CellTracker red lub green. Komórki przemywa się 3 x 5 ml PBS. Dodaje się roztwór 10 mM CellTracker w odpowiednim dla komórek medium bez surowicy (10 ml) i inkubuje komórki przez 45 minut w 37 °C. Po inkubacji komórki przemywa się 3 x 5 ml PBS, a następnie wysiewa na rusztowania. Następnie powierzchnię rusztowań można obrazować za pomocą mikroskopu Axon ImageExpress (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) przy 570 nm λex - 620 nm λem (CellTracker red) oraz 480 nm λex - 533 nm λem (CellTracker green). Aby zbadać penetrację komórek w głąb rusztowań, można zastosować wielofotonowy mikroskop konfokalny. Pozwala on na penetrację do około 200 mikronów w większość rusztowań, z komórkami lub bez.
  3. Próbki po hodowli utrwala się w 1 ml 3,7% formaldehydu w PBS w 37 °C przez 20 minut, a następnie przemywa 3 x 1 ml PBS.
  4. Do każdej próbki dodaje się 200 μL przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko elastynie (5% v/v w PBS, króliki przeciwko ludzkiej alfa-elastynie, AbDserotec, Kidlington, UK) i inkubuje w 37 °C przez 30 minut.
  5. Próbki przemywa się 3 x 1 ml PBS, a następnie inkubuje w roztworze przeciwciał wtórnych (0,5% v/v koza przeciwko króliczym IgG (FC):FITC) w PBS zawierającym DAPI (1 μg/ml) przez 30 minut.
  6. Następnie próbki przemywa się 3 x 1 ml PBS.
  7. Próbki barwione DAPI i przeciwciałem wtórnym obrazuje się następnie na fluorescencyjnym mikroskopie Axon ImageExpress: 365 nm λex - 460 nm λem dla DAPI oraz 480 nm λex - 533 nm λem dla przeciwciała wtórnego. DAPI barwi jądra komórkowe, co pozwala na bardzo łatwą ocenę rozkładu komórek w obrębie włókien.

7. Poddawanie komórek na rusztowaniach dwuosiowemu warunkowaniu dynamicznemu

Aby zbadać wpływ warunkowania dynamicznego na produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) przez fibroblasty, opracowaliśmy prosty bioreaktor służący jako dowód koncepcji do analizy tego zjawiska.

  1. Zmontować balon oraz aparat do regulacji przepływu i przygotować system w taki sposób, aby po pokryciu mógł zostać łatwo umieszczony w sterylnym naczyniu odpowiednim do hodowli komórkowej.
  2. Zautoklawować aparat wraz z balonem (122 °C, 220 mBar przez 1 godzinę). Można potwierdzić, że balony przeżywają autoklawowanie bez negatywnego wpływu na ich funkcję, poprzez wielokrotne pompowanie i spuszczanie z nich powietrza.
  3. W pomieszczeniu czystym rozpakować aparat w komorze z laminarnym przepływem powietrza w pozycji umożliwiającej elektroprzędzenie.
  4. Napompować balon do wymaganej powierzchni (pamiętając, że balon musi nadal mieścić się w naczyniu hodowlanym) za pomocą soli fizjologicznej PBS i podłączyć PBS do uziemienia elektrycznego w punkcie aparatu, który nie musi być sterylny (odgałęzienie rury na zaworze trójdrożnym).
  5. Przeprowadzić elektroprzędzenie wymaganego polimeru na balon przy zastosowaniu standardowych warunków przędzenia i odległości roboczej 10 cm. Pozostawić rusztowanie do wyschnięcia na 1 godzinę. „Mokre” włókna są wystarczająco „lepkie”, aby przylgnąć do powierzchni balonu bez późniejszego odrywania się.
  6. Umieścić balon w sterylnym naczyniu i przetransportować go do komory z laminarnym przepływem powietrza odpowiedniej do hodowli komórkowej.
  7. Wyjąć balon z naczynia i położyć go na sterylnym podłożu (szalce Petriego), a następnie wielokrotnie (co 20 sekund) nanosić pipetą zawiesinę komórek (1 x 106 komórek w 5 ml DMEM) na pokryty balon przez 20 minut, aby dążyć do równomiernego rozłożenia komórek na powierzchni.
  8. Umieścić balon w naczyniu hodowlanym i dodać podgrzaną wcześniej pożywkę odpowiednią dla danego typu komórek.
  9. Podłączyć aparat do pompowania do pompy strzykawkowej (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, US) i pompować/spuszczać powietrze z balonu zgodnie z potrzebami, aby uzyskać rozciąganie dwuosiowe. Aby osiągnąć bardziej złożony reżim rozciągania, można zastosować pompę strzykawkową sterowaną komputerowo.

8. Reprezentatywne wyniki

Poniższe rysunki przedstawiają reprezentatywne wyniki, których można się spodziewać przy zastosowaniu powyższych metod.

Elektroprzędzenie może być wykorzystane do tworzenia rusztowań o strukturach losowych i uporządkowanych (Rysunek 1); proces ten jest powtarzalny, a otrzymane włókna są jednorodne. Można elektroprząść wiele rodzajów polimerów, których charakterystyka może się znacznie różnić, co pokazano na Rysunku 2 dla PHBV, PLA lub PCL. Elektroprzędzenie pozwala na otrzymywanie lekkich, puszystych rusztowań lub gęstych membran nieprzepuszczalnych dla komórek (patrz Rysunek 3). Wszystkie przedstawione tutaj rusztowania wspomagały adhezję i proliferację komórek. Wcześniejsze prace wykazały, że komórki mogą migrować przez te rusztowania na głębokość co najmniej 500-600 μm.9 Dla PLA średnica włókna wynosi 3 μm; dla PHBV jest to 0.3μm z koralikami o rozmiarach od 5-20 μm; dla PCL wynosi ona 3 μm, a dla PLGA 11 μm. Inne badania z wykorzystaniem innych układów rozpuszczalników wskazują, że PHBV można elektroprząść w formie włókien bez grudek lub koralików polimerowych.10,11

Jeśli wymagane są grubsze rusztowania, można zastosować wyżarzanie parowe i termiczne w celu połączenia warstw rusztowań (patrz Rysunek 4). Warstwy te nie ulegają delaminacji, a zlokalizowanie miejsca styku między nimi może być bardzo trudne.

Wykazujemy, że możliwe jest stworzenie membran dwuwarstwowych, w których komórki A i B mogą być hodowane na oddzielnych membranach bez wzajemnego mieszania się, co przedstawiono na Rysunku 5. W niniejszym doświadczeniu demonstrujemy to, wykorzystując ludzkie fibroblasty skóry właściwej zabarwione dwoma różnymi fluorescencyjnymi barwnikami do śledzenia komórek. Taka membrana dwuwarstwowa byłaby użyteczna podczas hodowli komórek w celu wytworzenia twardej tkanki, takiej jak kość lub chrząstka, po jednej stronie, oddzielonej od komórek przeznaczonych do formowania tkanki miękkiej (zazwyczaj szybciej rosnącej) po drugiej stronie, na przykład w przypadku naprawy rozszczepu podniebienia lub rekonstrukcyjnej chirurgii periodontologicznej.12, 13

W odniesieniu do wpływu sterylizacji na rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia, donosiliśmy wcześniej, że metoda sterylizacji wpływa na rusztowanie oraz późniejszą hodowlę komórkową.9 Zostało to zilustrowane na Rysunku 6, który przedstawia wpływ kwasu nadoctowego, naświetlania gamma oraz etanolu na średnicę włókien, wytrzymałość na rozciąganie oraz moduł Younga rusztowania z PLGA.

Naświetlanie gamma nie wywiera znaczącego wpływu na średnicę włókien, podczas gdy kwas nadoctowy i etanol zmniejszają średnicę włókien o około 50%. W odniesieniu do wytrzymałości na rozciąganie każda z metod sterylizacji zmieniła wytrzymałość na rozciąganie oraz elastyczność rusztowań. Hodowla komórek na tych rusztowaniach dodatkowo zmniejszyła wytrzymałość na rozciąganie, ale zwiększyła elastyczność.

Na koniec przedstawiono metodę badania wpływu dynamicznego rozciągania dwuosiowego na komórki hodowane na rusztowaniach elektroprzędzonych. To podejście typu proof-of-concept wykazuje, że komórki pozostają żywotne podczas dynamicznego rozciągania, a ponadto produkują zwiększone ilości elastyny w tych warunkach. Kontrastuje to wyraźnie z brakiem elastyny w przypadku tych samych komórek na tym samym rusztowaniu utrzymywanych w warunkach statycznych (patrz Rysunek 7).

Schemat elektroprzędzenia z obrazami SEM ilustrującymi przypadkowe, jednowymiarowe (1D), dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D) układy włókien.
Rycina 1. Przedstawia schemat urządzenia do elektroprzędzenia oraz proces przędzenia włókien przypadkowych i równoległych, a następnie nakładania warstw włókien jedna na drugą. Włókna prostopadłe można wytworzyć poprzez elektroprzędzenie zestawu uporządkowanych włókien na folię aluminiową, obrócenie folii o 90°, a następnie niezwłoczne elektroprzędzenie drugiego zestawu uporządkowanych włókien na wierzchu poprzednich.

Obrazy SEM morfologii nanowłókien, powiększenie 200x i 10k×, analiza strukturalna.
Rysunek 2. Przedstawia morfologię losowych mat otrzymanych metodą elektroprzędzenia z (A) PLA (pasek skali 100 μm), (B) PHBV (pasek skali 100 μm), (C) PCL (pasek skali 100 μm) oraz (D) PLGA (pasek skali 200 μm). Należy zauważyć, że PLA, PCL i PLGA tworzą jednorodne rusztowania mikrowłókniste. PHBV jest przędziony w formie „sznura pereł” z nanowłóknami łączącymi koraliki o rozmiarach 5-20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Obrazy SEM polimerowych nanowłókien i kulek; analiza mikroskopowa; morfologia powierzchni.
Rysunek 3. Produkcja rusztowania wielowarstwowego. Tutaj rusztowania są początkowo przędzone z użyciem PHBV, a następnie wykorzystuje się strzykawki wypełnione PLA lub PCL. Są one przędzone na wierzchu rusztowania z PHBV. Rysunek przedstawia wygląd tych rusztowań wielowarstwowych, (A) pojedyncza warstwa PHBV, (B) przekrój poprzeczny dwuwarstwy PHBV-PLA, pokazujący gęstą nanowłóknistą warstwę PHBV o strukturze „sznura pereł” (po lewej) oraz bardziej otwartą mikrowłóknistą warstwę PLA (po prawej) oraz (C) pojedyncza warstwa PLA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Obrazy SEM rusztowań nanowłóknistych; analiza strukturalna, stopnie powiększenia, zastosowanie biomedyczne.
Rycina 4. Grubsze rusztowania można wytworzyć poprzez wyżarzanie termiczne oraz wyżarzanie w oparach. (A) i (B) przedstawiają przekrój przez rusztowanie z PLA wyżarzane w oparach, w którym początkowe rusztowania włókniste o grubości około 150 μm zostały ułożone razem, a opary dichlorometanu posłużyły do stworzenia znacznie grubszych rusztowań o grubości do 500 μm. Na (C) i (D) widać, że rusztowanie składa się z warstw znacznie grubszych włókien przeplatanych warstwami włókien cieńszych, co uzyskano poprzez wspólne wyżarzanie termiczne warstw włókien cienkich i grubych. Podejście to można wykorzystać do produkcji rusztowań o złożonych właściwościach mechanicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące lokalizację i ekspresję białek w próbkach tkanek.
Rysunek 5. Wygląd komórek na rusztowaniu dwuwarstwowym. We wszystkich przypadkach przedstawione komórki to ludzkie fibroblasty skóry. (A) Fibroblasty na elektroprzędzonym PLA, gdzie komórki zostały utrwalone i zabarwione DAPI. (B) Komórki zabarwione DAPI na PHBV. Na (C) fibroblasty zostały uprzednio zabarwione barwnikiem witalnym CellTracker green; widoczny jest ich wygląd na stronie PLA warstwy dwuwarstwowej. (D) Przekrój przez strukturę dwuwarstwową z fibroblastami zabarwionymi na czerwono na dolnej powierzchni PHBV oraz fibroblastami zabarwionymi na zielono na górnej powierzchni PLA. (E) Fibroblasty uprzednio zabarwione CellTracker red hodowane na powierzchni PHBV. Zastosowanie witalnych barwników fluorescencyjnych zapewnia wygodną metodologię badania rozkładu komórek na rusztowaniu podczas ich wzrostu. Barwników tych można rutynowo używać przez co najmniej 7 dni. Jednakże stężenie barwnika ulega rozcieńczeniu w miarę podziałów komórkowych. Paski skali odpowiadają 0.1 mm.

Układ do badań mechanicznych, wykres naprężenie-odkształcenie, wykres słupkowy średnicy włókien, analiza właściwości materiałowych.
Rycina 6. Właściwości biomechaniczne rusztowania elektroprzędzionego uzyskano za pomocą tensjometru Bose Electroforce (A). (B) Krzywe naprężenie/odkształcenie rusztowań PLGA sterylizowanych promieniowaniem gamma, alkoholem, kwasem ponadtlenkowym lub otrzymanych aseptycznie. Z takiego wykresu można odczytać trzy parametry: maksymalne naprężenie rozrywające (UTS), któremu włókno może zostać poddane przed pęknięciem, maksymalne odkształcenie rozciągające oraz moduł Younga. Ten ostatni wskazuje na elastyczność rusztowania. (C) Wpływ każdej metody sterylizacji na średnicę włókien PLGA w μm. Każda metoda sterylizacji obniżyła UTS. Zarówno kwas ponadtlenkowy, jak i promieniowanie gamma zmniejszają moduł Younga, co sprawia, że rusztowanie jest bardziej elastyczne; alkohol sprawia, że rusztowanie staje się szczególnie kruche. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Procesy inżynierii tkankowej przedstawiające wysiew komórek, konfigurację bioreaktora oraz wyniki barwień histologicznych.
Rysunek 7. Na tym rysunku przedstawiono wykorzystanie zwykłego balonu do stworzenia bioreaktora dwuosiowego, w którym rusztowania (oraz rosnące w nich komórki) mogą być poddawane rozciąganiu dwuosiowemu przez określony czas. (A) Spuszczony balon, na który naniesiono elektroprzędzone włókna PHBV. Na tym etapie balon jest częściowo pokryty włóknami. (B) Balon całkowicie pokryty włóknami PHBV i PLA. (C) Zawiesina komórkowa jest wielokrotnie pipetowana na balon. (D) Balon umieszczony w butelce ze sterylnym medium, gdzie balon jest połączony z pompą strzykawkową, a PBS (używany jako elektrolit przewodzący) służy do delikatnego pompowania i wypuszczania powietrza z balonu zgodnie z zaprogramowanym harmonogramem. (E) Komórki na rusztowaniach są usuwane z balonu po zakończeniu eksperymentu; analiza żywotności komórek przedstawiona jest w punkcie (F), gdzie żywe komórki nabierają ciemnoniebieskiego koloru dzięki zastosowaniu wskaźnika metabolicznego 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. (G) Przedstawia, że komórki (niebieskie) hodowane na tym balonie i poddawane rozciąganiu dwuosiowemu wytwarzają włókna elastyny (zielone, barwione za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko elastynie), podczas gdy te same komórki na identycznym rusztowaniu (H) hodowane w warunkach statycznych wykazują pomijalną produkcję elastyny. Paski skali odpowiadają 0.025 mm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Elektroprzędzenie jest bardzo popularną techniką wytwarzania rusztowań w inżynierii tkankowej.14, 15, 16 Choć wytwarzanie podstawowych rusztowań elektroprzędzionych do celów eksperymentalnych jest stosunkowo proste, technika ta jest jednocześnie złożona i wieloaspektowa, z wieloma zmiennymi.6 Istnieje wiele badań opisujących, w jaki sposób parametry elektroprzędzenia determinują strukturę wytworzonego rusztowania. W niniejszym badaniu skupiono się na znaczących wyzwaniach po etapie produkcji, polega...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy BBSRC za sfinansowanie studiów doktoranckich pana Frazer Bye.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kopolimer kwasu mlekowego i glikolowego (PLGA)Sigma Aldrich
Kwas polimlekowy (PLA)Sigma Aldrich81273Lepkość właściwa ~2.0dl/g
Poly ε-kaprolaktonSigma Aldrich
Kopolimer poli(hydroksymaślanu-co-hydroksywalerianu) 12:1Goodfellow578-446-59PHB88/PHV12
DichlorometanSigma Aldrich lub Fisher270997 lub D/1850/17>99.8% zawiera 50-150ppm stabilizatora amylenowego
50 wielokolorowych balonówWilkinson’s Hardware Stores Ltd.0105790
Kozie przeciwkrólicze przeciwciała IgG (FC):FITCAbDserotecSTAR121F
Królicze przeciwciała przeciwludzkie przeciwko alfa-elastynieAbDserotec4060-1060
Nakrętka z gwintem GL45 PP 2-portowa, opak. 2 szt.SLS1129750
Ddihydrochlorek 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI)Sigma Aldrich32670
CellTracker green CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker red CMTXInvitrogenC34552

Bibliografia

  1. Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
  2. Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
  3. Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
  4. Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
  5. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
  6. Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
  7. Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
  8. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
  9. Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
  10. Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
  11. Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
  12. Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
  13. Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
  14. Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
  15. Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
  16. Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rusztowania elektroprz dzonesterylizacja rusztowaodkszta cenie dwuosiowew a ciwo ci mechanicznehodowla kom rkowamacierz zewn trzkom rkowawy arzanie w fazie parprz dzenie sekwencyjnemikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły