Obróbka poprodukcyjna włókien elektroprzędzonych dla inżynierii tkankowej

1. Elektroprzędzenie losowych i wyrównanych włókien

Elektroprzędzenie tworzy drobne sieci włókniste, wykorzystując potencjał elektryczny do przyciągania roztworu polimeru w kierunku uziemionego kolektora. Kolektory mogą mieć bardzo wiele kształtów i mogą być statyczne lub, częściej, obrotowe. Rozpuszczalnik odparowuje, zanim roztwór dotrze do kolektora, a strumień zestala się w włókno.

Każdy polimer wymaga własnego zestawu warunków do wytworzenia danego rodzaju włókna. Stężenie polimeru, rozpuszczalnika, odległość między pompowanym roztworem a uziemionym kolektorem, różnica potencjałów między nimi, prędkość obracającego się kolektora, natężenie przepływu, temperatura i wilgotność będą miały wpływ na elektroprzędzenie. Istnieje wiele badań opisujących dobór parametrów elektroprzędzenia i ich wpływ na wytwarzane rusztowania (np. średnica włókien, morfologia i orientacja). ^{5, 6, 7, 8} W tych eksperymentach rusztowania zostały wprawione w wirowanie w oparciu o warunki wybrane w naszych poprzednich badaniach. ^{2, 9}

Następujące metody są odpowiednie do produkcji rusztowań elektroprzędzonych z PLGA, kwasu polimlekowego (PLA), poli ε-kaprolaktonu (PCL) i polihydroksymaślanu-ko-hydroksywalerianu (PHBV) przy użyciu obrotowego kolektora, jak pokazano na rysunku 1. W całym rozpuszczalniku stosuje się dichlorometan (DCM). Opracowana w tym celu metoda pozwala na uzyskanie mikrowłóknistego rusztowania PLGA, PLA i PCL oraz nanowłóknistego PHBV z mikrokulkami (morfologia "naszyjnika z pereł").

1. Pokryj obrotowy kolektor trzpienia folią aluminiową, polerowaną/błyszczącą stroną skierowaną na zewnątrz. Nasz trzpień miał 20 cm szerokości i 10 cm średnicy.
2. Przygotować roztwory polimerów; PLA, PCL i PHBV są sporządzane jako 10% wagowy roztwór w DCM. PLGA składa się z 20% wagowych roztworów w DCM.
3. Umieścić 4 strzykawki o pojemności 5 ml na pompie strzykawkowej. Każda strzykawka zawiera 5 ml polimeru, co daje w sumie 20 ml.
4. W przypadku PLA, PCL i PHBV należy stosować natężenie przepływu 40 ^μLmin-1 na strzykawkę.
5. W przypadku PLGA należy użyć natężenia przepływu 30 ^μLmin-1 na strzykawkę.
6. W przypadku PLA, PCL i PLGA należy zachować odległość roboczą 17 cm od końcówki igły do trzpienia.
7. W przypadku PHBV należy zachować odległość roboczą 10 cm od końcówki igły do trzpienia.
8. Naładować igły strzykawki do +17000 V (73030 P, Genvolt, Shropshire, Wielka Brytania) i elektrowirować z odpowiedniej odległości na trzpieniu pokrytym folią aluminiową.
9. W przypadku włókien losowych obróć trzpień z prędkością 200 obr./min.
10. W przypadku wyrównanych włókien obróć trzpień z prędkością 1000 obr./min.
11. Rusztowania mogą być składowane na folii aluminiowej w suchych warunkach. Zalecane przechowywanie odbywa się w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze 4 °C w obecności środka osuszającego. Z naszego doświadczenia wynika, że rusztowania pozostają stabilne przez co najmniej 4 miesiące (być może znacznie dłużej) w tych warunkach (nie są nam znane żadne opublikowane badania dotyczące warunków długotrwałego przechowywania rusztowań).

2. Produkcja skomplikowanych rusztowań metodą sekwencyjnego przędzenia

Sekwencyjne przędzenie dostarcza metody łączenia właściwości różnych materiałów w celu stworzenia materiału, który ma najlepsze z obu właściwości. PHBV wytwarza płaską, gęstą, kruchą blachę, podczas gdy przędzenie PLA lub PCL wytwarza elastyczne arkusze o niskiej gęstości. Oba materiały wspierają mocowanie komórek. Sekwencyjne przędzenie tych materiałów powoduje powstanie gęstej, nieprzepuszczalnej dla komórek, membrany, która jest elastyczna.

1. Ustaw platformę do elektroprzędzenia zgodnie z sekcją 1, z warunkami przędzenia PHBV.
2. Electrospin PHBV jak wyżej.
3. Nie zmieniając folii aluminiowej, należy elektrowirować drugi polimer na wierzchu, korzystając z parametrów i normalnych warunków dla tego polimeru (np. 17 cm bęben do igły, 17000 V, 200 obr./min dla PLA). Ten proces addytywny tworzy podwójną warstwę rusztowania, tworząc dwuwarstwę.

3. Produkcja rusztowań wielowarstwowych poprzez wyżarzanie kilku warstw razem

1. Rusztowania mogą być wielowarstwowe dzięki zastosowaniu wyżarzania cieplnego. W tym celu 4 arkusze PLGA umieszcza się jeden na drugim, a następnie podgrzewa w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.
2. Rusztowania mogą być również wyżarzane przez wyżarzanie w osłonie wody. Tutaj 4 arkusze PLGA są umieszczane jeden na drugim i zawieszane 2 cm nad kałużą DCM (10 ml) na 1 godzinę. Odbywa się to w szczelnie zamkniętym pojemniku w temperaturze pokojowej.

4. Aseptyczne wytwarzanie i postprodukcja Sterylizacja rusztowań elektroprzędzonych

1. Produkcję rusztowań aseptycznych można osiągnąć poprzez elektrowirowanie w aseptycznym środowisku okapu z przepływem laminarnym w pomieszczeniu czystym. W tym celu można użyć sterylnych polimerów klasy medycznej lub polimerów wysterylizowanych przez inkubację w DCM. Po rozpuszczeniu polimery są przędzone elektrolitycznie na sterylnej folii owiniętej wokół wysterylizowanego trzpienia. Rusztowania są następnie przenoszone w sposób aseptyczny. Sterylność weryfikuje się poprzez inkubację próbek rusztowania w pożywkach wzrostowych wolnych od antybiotyków przez odpowiedni okres.
2. W celu dezynfekcji etanolem (jest to przydatne doświadczalnie, ale nie jest to uznana metoda sterylizacji, którą można by zabrać do kliniki) rusztowania umieszcza się na krótko (15 min) w 70% v/v roztworze etanolu w wodzie destylowanej. Do praktycznych celów eksperymentalnych jest to zwykle wystarczające do dezynfekcji rusztowań, aby można je było następnie z powodzeniem połączyć z hodowanymi komórkami.
3. W przypadku sterylizacji kwasem nadoctowym rusztowania zanurza się w kwasie nadoctowym (0,1% v/v w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS)) i inkubuje przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, jak opisano w Selim i wsp.⁹
4. W celu sterylizacji promieniami gamma rusztowania napromieniowuje się dawką 3 kGy przy użyciu źródła cezu, jak opisano w Selim i wsp.⁹

5. Badania biomechaniczne rusztowań

1. Rusztowania są cięte na prostokąty o wymiarach 5 mm x 20 mm, mierzone pod kątem grubości za pomocą mikrometru i umieszczane w urządzeniu Bose Electroforce 3100. Ta maszyna przykłada siłę 0-22 N do przemieszczenia 6 mm i wykreśla obciążenie w funkcji przemieszczenia jako krzywą naprężenia/odkształcenia. Pozwala to na obliczenie modułu Younga i sprężystości.

6. Wizualizacja komórek na rusztowaniach i ocena produkcji ECM

Komórki mogą być barwione ważnymi barwnikami fluorescencyjnymi, które pozwalają zobaczyć komórki na rusztowaniach, jak się przyczepiają, migrują i rozmnażają. Po hodowli obecność komórek na rusztowaniach można określić przez barwienie jąder komórkowych dichlorowodorkiem 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI). Wytwarzanie ECM przez komórki na rusztowaniu można ocenić poprzez barwienie komórek pod kątem szeregu białek ECM, w tym elastyny, jak pokazano w tym przykładzie. Wszystkie użyte rusztowania zostały zmierzone pod kątem grubości co najmniej 0,2 mm i pocięte na kwadraty o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm przed siewem.

W tych badaniach ludzkie fibroblasty skórne są wykorzystywane ze względu na rolę, jaką odgrywają w rekonstrukcji tkanek miękkich, co jest głównym przedmiotem zainteresowania badawczego naszego laboratorium.

Komórki są pobierane z próbek skóry od pacjentów poddawanych planowym operacjom zmniejszenia piersi lub abdominoplastyce (wyrażono zgodę na wykorzystanie ich tkanek do celów badawczych). Tkanki są pobierane i wykorzystywane anonimowo na podstawie licencji Badawczego Banku Tkanek 12179. Tkanki przemywa się PBS zawierającym streptomycynę (0,1 mg/ml) i penicylinę (100 j.m./ml) oraz amfoterycynę B (0,5 μg/ml). Próbki tkanek inkubuje się w 0,1% w/v trypsyny i 0,1% glukozy w PBS (12-18 godzin, 4 °C). Skóra właściwa jest złuszczona, drobno rozdrobniona i inkubowana z 10 ml kolagenazy (0,5% w/v w DMEM i 10% FCS, 37 °C przez 18 godzin). Odwirowanie powstałej zawiesiny komórkowej (400 g przez 10 minut) wytwarza osad komórek, które można hodować i subhodować w DMEM, uzupełnionym płodową surowicą cielęcą (FCS, 10% v/v), streptomycyną (0,1 mg / ml), penicyliną (100 IU / ml) i amfoterycyną B (0,5 μg / ml). W eksperymentach wykorzystuje się tylko fibroblasty pasażu 4-9.

1. Ludzkie fibroblasty skórne, po zlewaniu się w T75 (EasyFlask, Nunc, Nowy Jork, USA) są wysiewane przez dodanie trypsyny/EDTA (5 ml, 5 mg/ml trypsyny, 2 mg/ml EDTA w soli fizjologicznej), inkubując przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zawiesinę odwirowuje się przez 10 minut (150 g). Komórki zawiesza się ponownie w 5 ml DMEM (uzupełnionym FCS (10% v/v), streptomycyną (0,1 mg/ml), penicyliną (100 j.m./ml) i amfoterycyną B (0,5 μg/ml)) i zlicza za pomocą hemocytometru, a stężenie dostosowuje się do wysiewu. Komórki są zwykle wysiewane po 50 000 komórek na studzienkę.
2. W razie potrzeby, przed wysianiem komórek na rusztowaniu, komórki można wstępnie oznaczyć za pomocą CellTracker na czerwono lub zielono. Komórki przemywać się 3 x 5 ml PBS. Dodaje się roztwór 10 mM CellTracker w surowicy, odpowiednim dla komórek, pożywce (10 ml) i komórki inkubuje się przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji komórki są myte w 3 x 5 ml PBS, po czym są wysiewane na rusztowania. Następnie powierzchnię rusztowań można zobrazować w mikroskopie Axon ImageExpress (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) przy 570 nm λex - 620 nm λem (CellTracker czerwony) i 480 nm λex - 533 nm λem (CellTracker zielony). Do zbadania penetracji komórek w głąb rusztowań można użyć wielofotonowego mikroskopu konfokalnego. W ten sposób można osiągnąć penetrację około 200 mikronów do większości rusztowań z komórkami lub bez.
3. Próbki po hodowli utrwala się w 1 ml 3,7% formaldehydu w PBS w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przemywa się 3 x 1 ml PBS.
4. Do każdej próbki dodaje się 200 μl przeciwciał pierwszorzędowych elastyny (5% v/v w PBS, króliczej anty-ludzkiej alfa elastynie, AbDserotec, Kidlington, Wielka Brytania) i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
5. Próbki przemywa się 3 x 1 ml PBS, a następnie inkubuje w roztworze przeciwciała drugorzędowego (0,5% v/v koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (FC):FITC) w PBS zawierającym DAPI (1 μg/ml) przez 30 minut.
6. Następnie próbki przemuje się 3 x 1 ml PBS.
7. Próbki DAPI i przeciwciał drugorzędowych są następnie obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym Axon ImageExpress, 365 nm λex - 460 nm λem dla DAPI i 480 nm λex - 533 nm λem dla przeciwciała drugorzędowego. DAPI barwi jądra i pozwala bardzo łatwo zobaczyć rozmieszczenie komórek we włóknach.

7. Poddawanie komórek na rusztowaniach dwuosiowemu warunkowaniu dynamicznemu

Aby zbadać wpływ dynamicznego kondycjonowania na produkcję ECM fibroblastów, opracowaliśmy prosty bioreaktor typu proof-of-concept, aby to zbadać.

1. Zmontuj balon i aparaturę do regulacji przepływu i przygotuj system tak, aby można go było łatwo umieścić w sterylnym naczyniu odpowiednim do hodowli komórkowej po pokryciu.
2. Aparat wraz z balonem należy sterylizować w autoklawie (122 °C, 220 mBar przez 1 godzinę). Możemy potwierdzić, że balony przetrwają autoklawowanie bez negatywnego wpływu na ich funkcję poprzez wielokrotne ich napełnianie i opróżnianie.
3. W czystym pomieszczeniu rozpakuj urządzenie w okapie z przepływem laminarnym w pozycji, w której można je nakręcić elektrolitycznie.
4. Napompuj balon do wymaganej powierzchni (pamiętaj, że balon nadal musi zmieścić się w naczyniu hodowlanym) solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i podłącz PBS do uziemienia elektrycznego w miejscu aparatu, który nie musi być sterylny (rura odgałęziająca na kranie 3-kierunkowym).
5. Elektrowirować wymagany polimer na balonie, używając normalnych warunków wirowania, stosując odległość roboczą 10 cm. Pozostaw rusztowanie do wyschnięcia na 1 godzinę. "Mokre" włókna są na tyle "lepkie", że przylegają do powierzchni balonu bez późniejszego odklejania się.
6. Umieść balon w sterylnym naczyniu i przetransportuj go do okapu z przepływem laminarnym odpowiedniego do hodowli komórek.
7. Wyjąć balon z naczynia i umieścić go na sterylnej powierzchni (szalka Petriego) i wielokrotnie (co 20 sekund) pipetować zawiesinę komórek (1 x 10⁶ komórek w 5 ml DMEM) na powlekany balon przez 20 minut, aby spróbować równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni.
8. Umieścić balon w naczyniu hodowlanym i dodać wstępnie podgrzaną pożywkę odpowiednią do typu komórki.
9. Podłącz urządzenie do pompowania do pompy strzykawkowej (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, USA) i napompuj/opróżnij balon zgodnie z wymaganiami, aby uzyskać rozciągnięcie dwuosiowe. Sterowana komputerowo pompa strzykawkowa może być użyta do osiągnięcia bardziej złożonego reżimu rozdęcia.

8. Reprezentatywne wyniki

Poniższe rysunki są reprezentatywnymi wynikami, których można się spodziewać, jeśli powyższe metody są przestrzegane.

Elektroprzędzenie może być wykorzystane do tworzenia rusztowań o losowych i uporządkowanych architekturach (Rysunek 1), jest to powtarzalne, a włókna są jednolite. Wiele rodzajów polimerów może być przędzonych elektrolitycznie o właściwościach, które mogą się znacznie różnić, jak pokazano na rysunku 2 dla PHBV, PLA lub PCL. Elektroprzędzenie może wytwarzać lekkie, puszyste rusztowania lub gęste, nieprzepuszczalne błony komórkowe (patrz rysunek 3). Wszystkie pokazane tutaj rusztowania ułatwiały przyczepianie się i proliferację komórek. Wcześniejsze prace wykazały, że komórki mogą migrować przez te rusztowania na głębokość co najmniej 500-600 μm.9 W przypadku PLA średnia średnica włókna wynosi 3 μm; dla PHBV jest to 0,3 μm z perłami w zakresie 5-20 μm; dla PCL wynosi 3 μm; a dla PLGA jest to 11 μm. Inne badania z użyciem innych systemów rozpuszczalnikowych donoszą, że PHBV może być przędzony elektrolitycznie jako włókna bez kulek lub pereł polimerowych. ^10,11

Jeśli wymagane są grubsze rusztowania, wyżarzanie parowe i cieplne może być stosowane do wyżarzania warstw rusztowań razem (zobacz Rysunek 4). Te warstwy rusztowania nie rozwarstwiają się i znalezienie połączenia między warstwami może być bardzo trudne.

Pokazujemy, że dwuwarstwowe błony mogą być tworzone, gdzie komórki A i B mogą być hodowane na osobnej membranie bez mieszania, jak pokazano na rysunku 5. Tutaj demonstrujemy to za pomocą ludzkich fibroblastów skórnych barwionych dwoma różnymi fluorescencyjnymi barwnikami śledzącymi komórki. Taka dwuwarstwowa błona byłaby przydatna podczas hodowli komórek w celu utworzenia twardej tkanki, takiej jak kość lub chrząstka z jednej strony, oddzielonej od komórek zaprojektowanych do tworzenia miękkiej (i zwykle szybciej rosnącej) tkanki po drugiej stronie, takiej jak naprawa rozszczepu podniebienia lub rekonstrukcyjna chirurgia periodontologiczna. ^{12, 13}

Jeśli chodzi o wpływ sterylizacji na rusztowania elektroprzędzone, wcześniej informowaliśmy, że metoda sterylizacji wpływa na rusztowanie i późniejszą hodowlę komórkową. ⁹ Zostało to zilustrowane na rysunku 6, który przedstawia wpływ kwasu nadoctowego, promieniowania gamma i etanolu na średnicę włókien i ostateczną wytrzymałość na rozciąganie oraz moduł Younga rusztowania PLGA.

Promieniowanie gamma nie ma znaczącego wpływu na średnicę włókien, podczas gdy kwas nadoctowy i etanol zmniejszają średnicę włókien o około 50%. W odniesieniu do wytrzymałości na rozciąganie każda z metod sterylizacji zmieniała ostateczną wytrzymałość na rozciąganie i elastyczność rusztowań. Hodowla komórek na tych rusztowaniach jeszcze bardziej zmniejszyła końcowe naprężenie rozciągające, ale zwiększyła elastyczność.

Na koniec, przedstawiono metodę testowania wpływu dynamicznego rozprężenia dwuosiowego na komórki hodowane na rusztowaniach elektroprzędzonych. To podejście oparte na słuszności koncepcji pokazuje, że komórki zachowują żywotność podczas dynamicznego rozdęcia, ale także wytwarzają zwiększone ilości elastyny w tych warunkach. Kontrastuje to wyraźnie z brakiem elastyny, gdy te same komórki na tym samym rusztowaniu są utrzymywane w warunkach statycznych (patrz ryc. 7).

Rysunek 1. Przedstawia karykaturę przedstawiającą elektroprzędzarkę i przędzenie przypadkowych i równoległych włókien, a następnie warstw włókien nałożonych na siebie. Prostopadłe włókna można wytworzyć poprzez elektroprzędzenie zestawu wyrównanych włókien na folii aluminiowej, obrócenie folii o 90°, a następnie natychmiastowe elektroprzędzenie drugiego zestawu wyrównanych włókien na nich.

Rysunek 2. Pokazuje morfologię losowych mat elektroprzędzonych (A) PLA (podziałka 100 μm), (B) PHBV (podziałka 100 μm), (C) PCL (podziałka 100 μm) i (D) PLGA (podziałka 200 μm). Należy pamiętać, że PLA, PCL i PLGA są jednolitymi rusztowaniami z mikrofibry. PHBV jest przędzony jako "naszyjnik z pereł" z nanowłóknami łączącymi koraliki o wielkości 5-20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Produkcja rusztowań wielowarstwowych. Tutaj rusztowania są początkowo przędzone za pomocą PHBV, a następnie stosuje się strzykawki wypełnione PLA lub PCL. Są one wirowane na rusztowaniu PHBV. Rysunek przedstawia wygląd tych wielowarstwowych rusztowań, (A) pojedyncza warstwa PHBV, (B) przekrój poprzeczny dwuwarstwy PHBV-PLA, pokazujący gęstą nanowłóknistą warstwę PHBV "naszyjnika z pereł" (po lewej) i bardziej otwartą warstwę mikrofibry PLA (po prawej) oraz (C) Pojedyncza warstwa PLA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Grubsze rusztowania można wytwarzać przez wyżarzanie cieplne i wyżarzanie w parze. (A) i (B) pokazują przekrój przez rusztowanie PLA wyżarzane w parze, w którym początkowe rusztowania włókniste o wielkości około 150 μm są umieszczane razem, a opary dichlorometanu są używane do tworzenia znacznie grubszych rusztowań o wielkości do 500 μm. W (C) i (D) widać, że rusztowanie składa się z warstw znacznie grubszych włókien przeplatanych warstwami cieńszych włókien powstałych w wyniku wyżarzania cieplnego warstw cienkich i grubych włókien razem. Takie podejście można wykorzystać do produkcji rusztowań o złożonych właściwościach mechanicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Wygląd komórek na rusztowaniu dwuwarstwowym. We wszystkich przypadkach obecne komórki są ludzkimi fibroblastami skóry. (A) Fibroblasty na elektroprzędzonym PLA, w których komórki są utrwalane i barwione DAPI. (B) Komórki barwione DAPI na PHBV. W (C) fibroblasty są wstępnie wybarwione życiodajnym barwnikiem, zielonym CellTrackerem, i można zobaczyć ich wygląd po stronie PLA dwuwarstwy. (D) Przekrój przez dwuwarstwę z zabarwionymi na czerwono fibroblastami na dolnej powierzchni PHBV i zabarwionymi na zielono fibroblastami na górnej powierzchni PLA. (E) Fibroblasty wstępnie wybarwione czerwienią CellTracker wyhodowane na powierzchni PHBV. Zastosowanie ważnych barwników fluorescencyjnych zapewnia wygodną metodologię obserwacji rozmieszczenia komórek na rusztowaniu, gdy komórki nadal rosną. Można rutynowo używać tych barwników przez co najmniej 7 dni. Jednak stężenie barwnika ulega rozcieńczeniu, gdy komórki się dzielą. Paski skali są równe 0,1 mm.

Rysunek 6. Właściwości biomechaniczne rusztowania elektroprzędzonego uzyskuje się za pomocą tensjometru Bose Electroforce (A). (B) Krzywe naprężeń/odkształceń rusztowań PLGA wysterylizowanych przez promieniowanie gamma, alkohol, kwas nadoctowy lub wytworzonych w sposób aseptyczny. Z takiego wykresu można uzyskać trzy pomiary: maksymalne naprężenie rozciągające (UTS), któremu może zostać poddane włókno przed zerwaniem, ostateczne odkształcenie rozciągające i moduł Younga. Ten ostatni wskazuje na elastyczność rusztowania. (C) Wpływ każdej metody sterylizacji na średnicę włókien PLGA w μm. Każda metodologia sterylizacji zmniejszała UTS. Zarówno kwas nadoctowy, jak i promieniowanie gamma zmniejszają moduł Younga, dając bardziej elastyczne rusztowanie, alkohol sprawia, że rusztowanie jest szczególnie kruche. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 7. Rysunek ten pokazuje użycie prostego balonu do zapewnienia dwuosiowego bioreaktora, na którym rusztowania (i komórki rosnące w rusztowaniach) mogą być poddawane dwuosiowemu rozciągnięciu przez pewien czas. (A) Opróżniony balon, na który zostały osadzone włókna elektroprzędzione (PHBV). Na tym etapie balon jest częściowo pokryty włóknami. (B) Balon w pełni pokryty włóknami PHBV i PLA. (C) Zawiesina komórkowa jest wielokrotnie pipetowana na balon. (D) Balon umieszczony w butelce ze sterylnym podłożem, w którym balon jest podłączony do pompy strzykawkowej, a PBS (używany jako elektrolit przewodzący) jest używany do delikatnego nadmuchania i umożliwienia opróżnienia balonu w stosunku do zaprogramowanego harmonogramu. (E) Komórki na rusztowaniach wyjmowane z balonu na zakończenie doświadczenia i przeprowadzana analiza pod kątem żywotności komórek wykazana w (F), gdzie komórki zdolne do życia rozwijają ciemnoniebieskie zabarwienie przy użyciu wskaźnika metabolicznego bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu. (G) Pokazuje, że komórki (niebieskie) hodowane na tym balonie i poddawane dwuosiowemu rozdęciu rozwijają włókna elastyny (zielone, barwione przy użyciu przeciwciał specyficznych dla elastyny), podczas gdy te same komórki na identycznym rusztowaniu (H) hodowane w warunkach statycznych mają znikomą produkcję elastyny. Paski skali są równe 0,025 mm.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.