Artykuł metodologiczny

Inżynieria przylegających bakterii poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

DOI:

10.3791/4176

⸱

16 listopada 2012

 ,  ,  ,  , 
1UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, 2Département Biosciences, INSA de Lyon, Université de Lyon, 3INSERM U758, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université de Lyon, 4Laboratoire de Génie Civil et Ingénierie Environnementale, INSA de Lyon, Université de Lyon

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat wydzielniczy, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i przylegających polimerów pozwala na wymierny wzrost przyczepności podwozia E. coli 1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i ilościowego określania przestrzegania zaleceń lekarskich.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda polega na przeprojektowaniu właściwości przylegania E. coli poprzez zgromadzenie minimalnej liczby genów curli pod kontrolą silnego i nadmiernie indukowalnego przez metal promotora, oraz na wizualizacji i ilościowym określeniu wynikowego przyrostu przylegania bakterii. Metoda ta wykorzystuje odpowiednie inżynierskie zasady abstrakcji i standaryzacji biologii syntetycznej, a jej wynikiem jest BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).

Pierwszy krok polega na zaprojektowaniu syntetycznego operonu poświęconego nadprodukcji curli w odpowiedzi na metal, a tym samym na zwiększeniu zdolności przylegania dzikiego szczepu. Oryginalny operon curli został zmodyfikowany in silico w celu optymalizacji sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych oraz ucieczki od "naturalnej" regulacji curli. Takie podejście pozwoliło z sukcesem przetestować naszą obecną wiedzę na temat produkcji loków. Co więcej, uproszczenie regulacji curli poprzez przełączenie endogennego promotora kompleksu (zidentyfikowano ponad 10 regulatorów transkrypcji) na prosty promotor regulowany metalem, co znacznie ułatwia kontrolowanie przestrzegania zaleceń lekarskich.

Drugi krok obejmuje jakościową i ilościową ocenę zdolności do przestrzegania zaleceń poprzez zastosowanie prostych metod. Metody te mają zastosowanie do szerokiej gamy bakterii przylegających, niezależnie od struktur biologicznych biorących udział w tworzeniu biofilmu. Test przyczepności w 24-dołkowych płytkach polistyrenowych zapewnia szybką wstępną wizualizację biofilmu bakteryjnego po barwieniu fioletem krystalicznym. Ten test jakościowy można udoskonalić poprzez ilościowe określenie procentowego stopnia przestrzegania zaleceń lekarskich. Taka metoda jest bardzo prosta, ale dokładniejsza niż tylko barwienie fioletem krystalicznym, jak opisano wcześniej1, zarówno z dobrą powtarzalnością, jak i odtwarzalnością. Wizualizacja bakterii znakowanych GFP na szkiełkach za pomocą fluorescencji lub laserowej mikroskopii konfokalnej pozwala na wzmocnienie wyników uzyskanych testem na płytce 24-dołkowej poprzez bezpośrednią obserwację zjawiska.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteryjne przyleganie do abiotycznego wsparcia odgrywa główną rolę w bioremediacji, biokatalizie czy mikrobiologicznych ogniwach paliwowych. Procesy bioremediacji wykorzystują zdolności mikroorganizmów do rozkładu substancji organicznych lub do modyfikacji dystrybucji metali (immobilizacja, ulatnianie się) lub specjacji. Te korzystne działania obserwuje się w ekosystemach wodnych i lądowych, ale także w sztucznych systemach opracowanych do oczyszczania zanieczyszczonej wody z odpadów przemysłowych i domowych. Intensywność i jakość aktywności mikrobiologicznej zależy od czynników fizykochemicznych, ale także od trybu życia mikroorganizmów (swobodnie pływających lub osadzonych w biofilmie). Tworzenie biofilmu jest związane z metabolizmem sprzyjającym oporności na biocydy za pomocą różnych mechanizmów. Zjawisko to będzie zatem wspierane w większości procesów bioremediacji. Co więcej, inżynieria komórek Escherichia coli w celu kontrolowania tworzenia biofilmu została z powodzeniem zastosowana do unieruchomienia czujników całych komórek na biochipach2-3.

Adaptacja mikroorganizmów do wysokiego stężenia metali zachodzi poprzez różne mechanizmy, takie jak adsorpcja do składników macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywacja pompy wypływowej lub specyficzne nośniki zdolne do koncentracji metalu w komórce. Zwiększenie tej aktywności bakteryjnej za pomocą inżynierii genetycznej pozwala na skuteczne i tanie leczenie zanieczyszczeń metalami w skali laboratoryjnej, zwłaszcza w przypadku wysoce toksycznych metali w niewielkiej ilości, jak opisali Raghu i in. 2008 4. Remediacja bakteryjna stanowi w tym przypadku konkurencyjną i oszczędną metodę w porównaniu z klasycznymi procesami chemicznymi wykorzystującymi żywice jonowymienne. Autorzy opisali E. Podwozie coli genetycznie zmodyfikowane pod kątem wychwytu i zatrzymywania kobaltu najpierw poprzez wybicie genu rcnA kodującego pompę wypływu, a następnie przez transformację z plazmidem wielokopijnym, co pozwala na nadprodukcję transportera o preferencyjnym wychwycie kobaltu. Taki szczep wydaje się być skuteczną alternatywą dla żywic jonowymiennych do oczyszczania ścieków radioaktywnych, ale kluczową nierozwiązaną kwestią jest odzyskiwanie skażonych bakterii na końcu procesu 4. Celem naszej pracy było zatem zaprojektowanie specjalnie zaprojektowanego szczepu, który byłby w stanie przykleić się do abiotycznych podpór, takich jak szkło lub plastik.

Spośród całego zestawu zrostów i przylegających fimbrii zidentyfikowanych u bakterii Gram-, zdecydowaliśmy się zaprojektować system umożliwiający produkcję loków. Kędzierzawe są cienkimi (średnica 2-5 nm) i wysoce agregacyjnymi włóknami amyloidowymi, które wystają z powierzchni E. coli i Salmonelli jako niekrystaliczna i nierozpuszczalna matryca 5-7. Kędzierzawe biorą również udział w kolonizacji powierzchni abiotycznych i rozwoju biofilmów 8. Niedawno wykazano, że Curli wiążą jony rtęci 9. Wiadomo, że amyloidy mają wysokie powinowactwo do jonów metali, takich jak Cu2+, Zn2+ i Fe3 + 10. Ta właściwość może jeszcze bardziej poprawić odkażanie ścieków zanieczyszczonych metalami. Klaster csg jest odpowiedzialny za produkcję włókien curli i składa się z dwóch różnie transkrybowanych operonów (ryc. 1). Geny csgB, csgA i csgC stanowią operon zmysłowy, kodując dwie podjednostki curli, CsgA i CsgB. Wydaje się, że CsgC jest zaangażowane w aktywność redoks w systemie biogenezy curli i wpływa na zachowanie porów CsgG 11. Jednak brak csgC w większości bakterii wytwarzających kędzierzawe wskazuje, że odpowiednie białko zapewnia tylko drugorzędny poziom kontroli nad biogenezą kędzierzawki. Aby uprościć system, zostaliśmy wybrani do pracy z minimalną liczbą genów.

Operonenuje csgDEFG koduje białka niezbędne do regulacji i transportu CsgA i CsgB na powierzchnię komórki. CsgD jest aktywatorem transkrypcji operonu csgBAC i odgrywa kluczową rolę w kontroli tworzenia biofilmu poprzez kontrolowanie produkcji fimbrii kędzierzawych i innych składników biofilmu, takich jak celuloza 12 oraz poprzez hamowanie produkcji wici 13. CsgE, CsgF i CsgG stanowią specyficzny dla curli aparat wydzielniczy w błonie zewnętrznej, przez który wydzielane jest główne białko podjednostkowe curli CsgA jako białko rozpuszczalne. Polimeryzacja CsgA jest zależna in vivo od białka nukleatorowego związanego z błoną CsgB (przegląd w 14). Wykazano, że złożone szlaki regulacyjne obejmujące kilka dwuskładnikowych systemów kontrolują ekspresję genu curli 15-16. Te złożone regulacje pozwalają bakteriom na tworzenie grubych biofilmów poprzez produkcję loków w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, ale są trudne do kontrolowania w zastosowaniach przemysłowych. Aby ułatwić odzysk bakterii wypełnionych metalem podczas procesu przemysłowego, wiązanie bakterii do stałego podłoża musi być kontrolowane przez dobrze zdefiniowany parametr(y). Właściwości adhezyjne loków są związane z ich amyloidową naturą 17 i mogą być wykorzystane do poprawy procesów bioremediacji, ale konieczne jest stworzenie prostszego i łatwiejszego do kontrolowania urządzenia.

Spośród tych 7 genów wybrano 18, zestaw 5 absolutnie wymaganych genów do syntezy curli (csgB i csgA kodujących monomery włókien) i eksportu (csgE, csgF i csgG, kodujących kompleks wydzielania loków) do skonstruowania syntetycznego operonu. Aby uciec przed "naturalną" regulacją curli, zaprojektowano i zsyntetyzowano syntetyczny operon składający się z tych 5 genów csg pod kontrolą silnego i nadmiernie indukowalnego kobaltu promotora (ryc. 2). Opisano krok po kroku analizę obszaru kodowania kursowego oraz procedurę projektowania funkcjonalnego operonu syntetycznego. Wyjaśniono dwie metody wizualizacji i ilościowego określania przylegania bakterii do polistyrenu i szkła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt i synteza operonu Curli z biocegły

  1. Określ organizację genetyczną i zlokalizuj endogenne sygnały transkrypcyjne i translacyjne genów kędzierzawych. Informacje te są gromadzone w specjalistycznych bazach danych, takich jak RegulonDBa lub EcoGeneb i uzupełniane przez uważne czytanie odpowiednich publikacji. Zarządzanie danymi i wstępną analizę in silico przeprowadzono za pomocą oprogramowania Clone Managerc.
  2. Wybierz odpowiednie sekwencje kodowania. Do skonstruowania syntetycznego operonu wybrano zestaw pięciu absolutnie niezbędnych genów do syntezy loków (csgB i csgA kodujących monomery włókien) i eksportu (csgE, csgF i csgG, kodujących kompleks wydzielania loków). Wyodrębnij wybrane sekwencje z bazy danych w formacie FASTA.
    Ponieważ klaster csgGFE jest antysensowny w genomie E. coli, przekształć tę sekwencję w jej odwrotny odpowiednik dopełniacza za pomocą narzędzi Clone Manager Operations> Process molecule>Invert molecule. Wklej sekwencję csgEFG za csgBA za pomocą funkcji "Ligate" (Klonuj> Ligate).
  3. Dodaj odpowiedniego promotora. Umieszczając pięć wybranych genów curli pod kontrolą promotora Prcn, przewiduje się, że curli będą nadprodukowane w obecności kobaltu i niklu. Locus rcn koduje pompę wypływową odpowiedzialną za detoksykację Ni i Co (rcnA) oraz jej pokrewny metaloregulator (rcnR). RcnR kontroluje ekspresję rcnA i własnego genu w odpowiedzi na Ni i Co 19. Sekwencja rcn składająca się z rcnR CDS, całego regionu międzygenowego rcn oraz 41 pierwszych nukleotydów rcnA umieszczono przed sekwencją chimeryczną csgBAEFG (ryc. 1, sekwencja całego konstruktu jest podana jako dane uzupełniające).
  4. Zoptymalizuj sygnały transkrypcyjne. Idealne miejsce wiązania rybosomów (lub idealne RBS = AAGGAGGTATATA) dodano przed pierwszym ATG sekwencji DNA csgBA. Drugi doskonały RBS został dodany przed sekwencją csgEFG. Zachowano endogenne RBS dla genów csgB i csgF oraz csgG.
  5. Aby spełnić standardy iGEM, urządzenie musi być otoczone standardowym prefiksem i sufiksem BioBrick, zawierającym miejsca ograniczeń dla EcoRI, PstI (prefiks) oraz SpeI i XbaI (sufiks). Wklej odpowiednie sekwencje na każdym końcu urządzeniad.
  6. Wyeliminuj wszelkie miejsca rozpoznawania EcoRI, PstI, SpeI i XbaI w urządzeniu. Aby ułatwić dalszy proces montażu, sama część BioBrick nie może zawierać żadnego z tych miejsc ograniczenia. Analiza restrykcyjna in silico urządzenia ujawniła jedno miejsce PstI w sekwencji csgA, jedno miejsce PstI w sekwencji rcnR i jedno miejsce EcoRI w genie csgE. Miejsca te znajdują się odpowiednio w pozycjach 80 (Mut1), 1340 (Mut2) i 1830 (Mut3) sekwencji urządzenia (dane uzupełniające) i zostały zmodyfikowane w następujący sposób przez ciche mutacje.
    Mut1 PstI strona CTGCAG zmieniona w CGTCTG
    Mut2 PstI strona CTGCAG zmieniona w CAGCAG
    Mut3 EcoRI strona GAATTC zmieniona w GAATT
  7. Przeprowadź symulację translacji za pomocą oprogramowania Clone Manager (Operacja>Cząsteczki procesu>Tłumacz cząsteczki). Użyj programu do wyrównywania sekwencji BLAST, aby zweryfikować idealną homologię między białkiem kędzierzawym typu dzikiego a białkami kodowanymi przez operon syntetyczny.
  8. Zamów operon syntetyczny. Komercyjne usługi syntezy genów są dostępne w wielu firmach na całym świecie, naszym partnerem był Genecust (Luksemburg). 4 μg sztucznego operonu (3165 pz) otrzymano kilka tygodni później i wstawiono do pUC57 (pIG2).

2. Wizualizacja i ilościowe określenie bakterii przylegających do polistyrenu

  1. Wypełnić każdą studzienkę 24-dołkowej płytki polistyrenowej 2 ml minimalnej pożywki M63 (glukoza 0,2%) i zaszczepić każdą studzienkę 106 komórkami nocnej hodowli. Hoduj bakterie w temperaturze 30 °C przez 18 do 48 godzin bez wstrząsania. Każda kolumna (4 dołki) reprezentuje modalność. W razie potrzeby dodaj odpowiednią ilość kobaltu (25 do 100 mM) i antybiotyku (ampicylina 100 μg.L-1). 3 pierwsze rzędy 24-dołkowej płytki służą do ilościowego oznaczania przylegających bakterii poprzez uśrednienie 3 powtórzeń, ostatni pozostały rząd służy do wizualizacji biofilmu.
  2. Dla 3 pierwszych rzędów płytki 24-dołkowej: dla każdej studzienki odzyskać supernatant zawierający komórki planktonowe.
  3. Ostrożnie przepłukać każdą studzienkę 1 ml M63 i połączyć 1 ml roztworu z początkowym supernatantem otrzymanym w 2.2). Ten basen jest określany jako komórki pływackie (=S).
  4. Odzyskać biofilm w 1 ml M63 poprzez skrobanie i pipetowanie w górę i w dół (=B). Wir 15 sek. Oszacuj liczbę bakterii przyczepionych do powierzchni i pływających na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm (OD600), aby uzyskać procent przylegania odpowiadający każdej modalności.
  5. Procent przestrzegania zaleceń lekarskich oblicza się według wzoru: Bx100/(3xS+B).
  6. Tylko w ostatnim rzędzie płytki 24-dołkowej: odrzucić komórki planktonowe.
  7. Przepłukać 1 ml M63 biofilm, który powstał na dnie płytki.
  8. Suszyć otwartą płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C.
  9. Dodaj 100 μl 20% fioletu krystalicznego przez 2 minuty do każdej studzienki, a następnie obficie przemyj wodą, aby uwidocznić bakterie przyczepione do powierzchni.
    Aby zapewnić odtwarzalność, należy przeprowadzić trzy niezależne testy (płytki).

3. Wizualizacja przylegających bakterii na szkle za pomocą mikroskopii

  1. Zaopatrz się w obudowę fluorescencyjną. Szczep E. coli SCC1e, który konstytutywnie wyraża białko zielonej fluorescencji (GFP) bez zauważalnej różnicy w stosunku do szczepu macierzystego MG1655 20, jest odpowiednim gospodarzem dla plazmidu zawierającego syntetyczny operon curli.
  2. Przekształć SCC1 za pomocą plazmidu pIG2 (= syntetyczny operon curli wstawiony w miejscu EcoRI / PstI plazmidu pUC57), aby otrzymać szczep S23. Przekształć SCC1 za pomocą plazmidu kontrolnego (pUC18), aby uzyskać szczep kontrolny S24 21.
  3. Wyhodować przez noc prekultury szczepów S23 i kontrolnych (S24) w temperaturze 30 °C w pożywce M63 z dodatkiem glukozy (0,2 %) i ampicyliny (100 μg.L-1).
  4. Zaszczepić 15 ml tej samej pożywki na szalkach Petriego 100 μl prekultur. Dodaj odpowiednie stężenie kobaltu (tj. 25 μM) i nie zapomnij o kontroli negatywnej bez kobaltu. Wprowadź 3 prostokątne szklane szkiełko nakrywkowe do każdej szalki Petriego. Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C bez wstrząsania.
  5. Usuń szkiełko nakrywkowe z szalki Petriego i ostrożnie je osusz. Ostrożnie oczyść dolną część twarzy małym bawełnianym materiałem nasączonym etanolem 70 °, wycierając wszelkie pozostałości bakterii. W przypadku obserwacji konfokalnej należy oczyścić oba górne końce na kilka milimetrów, aby umożliwić dalsze utrwalenie szkiełka nakrywkowego.
  6. Przylegające bakterie można uwidocznić bezpośrednio, ale szybko pod mikroskopem fluorescencyjnym, ale należy zachować ostrożność przy wysuszaniu próbki.
  7. W przypadku obserwacji konfokalnej należy umieścić szkiełko nakryte na szkiełku podstawowym z górną powierzchnią pokrytą biofilmem umieszczonym stroną zadrukowaną do góry. Biofilm jest następnie pokryty większym szkiełkiem nakrywkowym, które jest mocowane do szkiełka za pomocą lakieru. Odwróć konfigurację tak, aby biofilm znalazł się teraz na dolnej powierzchni.
  8. Umieść zestaw pod konfokalnym mikroskopem laserowym. Prawy konfokalny mikroskop laserowy Axioplan2 LSM510 (Zeiss) został użyty na platformie Platimf.
  9. ustawienie. Wzbudzić GFP przy 488 nm i zebrać fluorescencję bakteryjną w zakresie od 500 do 600 nm. Użyj 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju do robienia zdjęć w trybie konfokalnym skanowania laserowego. Zeskanuj ogólne trójwymiarowe struktury biofilmów od powierzchni ciała stałego do granicy faz z pożywką wzrostową, wykonując krok 1 μm.
  10. Wykonuj projekcje trójwymiarowe za pomocą oprogramowania IMARIS (Bitplane, Zurych, Szwajcaria). Określić grubość biofilmu poprzez analizę średniej wartości z wzdłuż statystycznych odcinków podłużnych. Kwantyfikacja bioobjętości biofilmu może być wyekstrahowana z konfokalnych stosów z, jak opisano w innym miejscu 22.

aRegulonDB dostarcza mechanistycznych informacji o organizacji operonów i ich dekompozycji na jednostki transkrypcyjne, promotory i ich typ sigma, geny i ich miejsca wiązania rybosomów, terminatory, miejsca wiązania określonych regulatorów transkrypcji, a także ich organizację w frazy regulacyjne. http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

bBaza danych EcoGene zawiera zaktualizowane informacje o genomie E. coli K-12 i sekwencjach proteomu, w tym obszerne bibliografie genów. Głównym celem projektu EcoGene była ponowna ocena miejsc rozpoczęcia tłumaczeń. http://ecogene.org/

chttp://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

dhttp://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix

eDar od Chun Chau Sze, Uniwersytet Techniczny Nan Yang, Singapur.

fPlatforma mikroskopowa Platim UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adnotacja in silico sekwencji csg typu dzikiego E. coli K12 związana z optymalizacją sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych pozwoliła na zaprojektowanie pojedynczego syntetycznego operonu curli Prcn-csg pokazanego na rysunku 3 (pełna sekwencja w danych uzupełniających). Protokoły 2 i 3 wykorzystano do wizualizacji i ilościowego określenia przestrzegania zaleceń związanych z produkcją loków. Stosując barwienie fioletem krystalicznym na 24-dołkowych płytkach polistyr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki krytyczne

Najważniejszym krokiem w tym podejściu biologii syntetycznej jest projektowanie genów. Projektowanie syntetycznych genów musi być skrupulatne, aby zapewnić wydajną produkcję systemu. Dwa geny kodujące monomery włókien i trzy geny kodujące białka zaangażowane w ich system wydzielania zostały połączone z silnym i indukowanym metalem promotorem, aby stworzyć nową jednostkę funkcjonalną do nowego zastosowania: biodekontaminacji ścieków jądrowych. Zgodnie z planem i przewidywaniami, ur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy pozostałym członkom zespołu Lyon INSA-ENS iGEM (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy, Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon i Valérie Desjardin), naszym sponsorom za wsparcie finansowe (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon i Wydział Nauk Biologicznych INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé za krytyczną lekturę tego manuskryptu oraz dr C.C. Sze za prezent szczepowy. B. Drogue otrzymuje stypendium doktoranckie w Région Rhône-Alpes.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pIG2pUC57(pMB1 ori, 2710 pz) z fragmentem EcoRI/PstI o sile 3165 pz zawierającym syntetyczny Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr
pUC18Plazmid wielokopijny (pMB1 ori, 2686 pz), Ampr
S23SSC1 (= MG1655 ze znacznikiem GFP, dar C.C. Sze)/pIG2
S24SSC1/pUC18
CoCl2Sigma0,1M roztwór podstawowy przechowywany w temperaturze pokojowej
M6329
Płytka 24-dołkowa Nunc55429Polistyrenowe płytki 24-dołkowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
  2. Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
  3. Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
  4. Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
  5. Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
  6. Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  9. Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
  10. Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
  11. Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
  12. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
  13. Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
  14. Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
  15. Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
  16. Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
  17. Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
  18. Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
  19. Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
  20. Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
  23. Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
  24. Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
  25. Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
  26. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  27. Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
  28. Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
  29. Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

adhezja bakteryjnanadekskrecja curlipromotor regulowany przez metalebarwienie fioletem krystalicznymmikroskopia konfokalnabakterie z tagiem GFPilo ciowe oznaczanie biofilmutest adhezji do polistyrenuoprogramowanie Clone Manager

Powiązane artykuły