Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

13.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4176

⸱

16 listopada 2012

 ,  ,  ,  , 
1UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne, Université Lyon 1, Université de Lyon, 2Département Biosciences, INSA de Lyon, Université de Lyon, 3INSERM U758, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université de Lyon, 4Laboratoire de Génie Civil et Ingénierie Environnementale, INSA de Lyon, Université de Lyon

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Streszczenie

Opisana tutaj metoda polega na modyfikacji właściwości adhezyjnych E. coli poprzez zgromadzenie minimalnej liczby genów curli pod kontrolą silnego i nadindukowalnego metalami promotora, a następnie wizualizację i kwantyfikację wynikającego z tego wzrostu adhezji bakteryjnej. Metoda ta wykorzystuje odpowiednie zasady inżynieryjne dotyczące abstrakcji i standaryzacji biologii syntetycznej, co doprowadziło do stworzenia Biobricku BBa_K540000 (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).

Pierwszy etap polega na zaprojektowaniu syntetycznego operonu odpowiedzialnego za nadekspresję curli w odpowiedzi na obecność metalu, a tym samym na zwiększeniu zdolności adhezyjnych szczepu typu dzikiego. Oryginalny operon curli został zmodyfikowany in silico w celu optymalizacji sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych oraz uniknięcia „naturalnej” regulacji curli. Podejście to pozwoliło na pomyślne przetestowanie naszej aktualnej wiedzy na temat produkcji curli. Ponadto uproszczenie regulacji curli poprzez zastąpienie endogennego złożonego promotora (zidentyfikowano ponad 10 regulatorów transkrypcyjnych) prostym promotorem regulowanym przez metal sprawia, że adhezja jest znacznie łatwiejsza do kontrolowania.

Drugi krok obejmuje jakościową i ilościową ocenę zdolności do adhezji poprzez zastosowanie prostych metod. Metody te można stosować w odniesieniu do szerokiego zakresu bakterii adhezyjnych, niezależnie od struktur biologicznych biorących udział w tworzeniu biofilmu. Test adhezji na polistyrenowych płytkach 24-dołkowych zapewnia szybką, wstępną wizualizację biofilmu bakteryjnego po barwieniu fioletem krystalicznym. Ten test jakościowy można uzupełnić o ilościowe określenie procentu adhezji. Metoda ta jest bardzo prosta, a jednocześnie dokładniejsza niż samo barwienie fioletem krystalicznym, opisane wcześniej 1, charakteryzując się dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością. Wizualizacja bakterii znakowanych GFP na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej pozwala na wzmocnienie wyników otrzymanych w teście na płytkach 24-dołkowych poprzez bezpośrednią obserwację zjawiska.

Wprowadzenie

Adhezja bakterii do nośników abiotycznych odgrywa kluczową rolę w bioremediacji, biokatalizie lub w mikrobiologicznych ogniwach paliwowych. Procesy bioremediacji wykorzystują zdolność mikroorganizmów do degradacji substancji organicznych lub do modyfikacji rozkładu (immobilizacja, ulatnianie) bądź specjacji metali. Te korzystne działania obserwuje się w ekosystemach wodnych i lądowych, a także w systemach sztucznych opracowanych w celu oczyszczania zanieczyszczonej wody z odpadów przemysłowych i bytowych. Intensywność i jakość aktywności mikrobiologicznej zależą od czynników fizykochemicznych, ale także od trybu życia mikroorganizmów (wolno żyjących lub wbudowanych w biofilm). Tworzenie biofilmu wiąże się z metabolizmem promującym odporność na biocydy poprzez różnorodne mechanizmy. Zjawisko to jest zatem pożądane w większości procesów bioremediacji. Ponadto inżynieria komórek Escherichia coli w celu kontrolowania tworzenia biofilmu została z sukcesem zastosowana do immobilizacji biosensorów całokomórkowych na biochipach2-3.

Adaptacja mikroorganizmów do wysokich stężeń metali odbywa się poprzez różnorodne mechanizmy, takie jak adsorpcja do składników macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywacja pomp efleksowych lub swoistych transporterów zdolnych do koncentrowania metalu wewnątrz komórki. Zwiększenie tych aktywności bakteryjnych poprzez inżynierię genetyczną umożliwia efektywne i tanie usuwanie zanieczyszczeń metalami w skali laboratoryjnej, szczególnie w przypadku metali o wysokiej toksyczności występujących w niewielkich ilościach, jak opisali Raghu et al. 2008 4. Bioremediacja bakteryjna stanowi w tym przypadku konkurencyjną i oszczędną metodę w porównaniu z klasycznymi procesami chemicznymi z wykorzystaniem żywic jonowymiennych. Autorzy opisali chassis E. coli zmodyfikowanych genetycznie w celu zwiększenia poboru i retencji kobaltu, najpierw poprzez knockout genu rcnA kodującego pompę efleksową, a następnie poprzez transformację plazmidem wielokopiowym umożliwiającym nadekspresję transportera z preferencyjnym powinowactwem do kobaltu. Taki szczep wydaje się być wydajną alternatywą dla żywic jonowymiennych w oczyszczaniu ścieków radioaktywnych, jednak kluczowym nierozwiązanym problemem pozostaje odzyskanie zanieczyszczonych bakterii na koniec procesu 4. Celem naszej pracy było zatem stworzenie specjalnie zaprojektowanego szczepu zdolnego do przylegania do nośników abiotycznych, takich jak szkło lub plastik.

Spośród całego zestawu adhezyn i fimbrii adhezyjnych zidentyfikowanych u bakterii Gram-ujemnych, zdecydowaliśmy się zaprojektować system umożliwiający produkcję curli. Curli to cienkie (średnica 2-5 nm) i silnie agregujące włókna amyloidowe, które wystają z powierzchni E. coli oraz Salmonella w postaci niekrystalicznej i nierozpuszczalnej macierzy 5-7. Curli biorą również udział w kolonizacji powierzchni abiotycznych i rozwoju biofilmów 8. Niedawno wykazano, że curli wiążą jony rtęci 9. Wiadomo, że amyloidy posiadają wysokie powinowactwo do jonów metali, takich jak Cu2+, Zn2+ i Fe3+ 10. Właściwość ta może dodatkowo usprawnić dekontaminację ścieków zanieczyszczonych metalami. Klastry csg odpowiadają za produkcję włókien curli i składają się z dwóch operonów transkrybowanych w przeciwnych kierunkach (Rysunek 1). Geny csgB, csgA i csgC tworzą operon sens, kodujący dwie podjednostki curli: CsgA i CsgB. CsgC wydaje się być zaangażowane w aktywność redoks w obrębie systemu biogenezy curli oraz wpływać na zachowanie porów CsgG 11. Jednak brak csgC u większości bakterii produkujących curli wskazuje, że odpowiadające mu białko zapewnia jedynie wtórny poziom kontroli nad biogenezą curli. Aby uprościć system, zdecydowaliśmy się pracować z minimalną liczbą genów.

Operon csgDEFG koduje białka niezbędne w regulacji i transporcie CsgA i CsgB na powierzchnię komórki. CsgD jest aktywatorem transkrypcyjnym operonu csgBAC i odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu tworzenia biofilmu poprzez regulację produkcji fimbrii curli oraz innych komponentów biofilmu, takich jak celuloza 12, a także poprzez hamowanie produkcji wici 13. CsgE, CsgF i CsgG tworzą specyficzny dla curli aparat wydzielniczy w błonie zewnętrznej, przez który główna białkowa podjednostka curli CsgA jest wydzielana jako białko rozpuszczalne. Polimeryzacja CsgA zależy in vivo od związanego z błoną białka nukleatora CsgB (przegląd w 14). Wykazano, że ekspresja genów curli jest kontrolowana przez złożone szlaki regulacyjne obejmujące kilka dwuskładnikowych systemów sygnałowych 15-16. Te złożone regulacje pozwalają bakteriom tworzyć grube biofilmy poprzez produkcję curli w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, lecz są trudne do kontrolowania w zastosowaniach przemysłowych. Aby ułatwić odzyskiwanie bakterii wypełnionych metalami podczas procesu przemysłowego, unieruchomienie bakterii na stałym nośniku musi być kontrolowane przez dobrze zdefiniowany parametr lub parametry. Adhezyjne właściwości curli są związane z ich naturą amyloidową 17 i mogłyby zostać wykorzystane do usprawnienia procesów bioremediacji, jednak konieczne jest stworzenie prostszego i łatwiej kontrolowanego mechanizmu.

Spośród tych 7 genów 18 do konstrukcji syntetycznego operonu wybrano zestaw 5 genów absolutnie niezbędnych do syntezy curli (csgB oraz csgA kodujących monomery włókien) i ich eksportu (csgE csgF oraz csgG kodujących kompleks sekrecji curli). Aby uniknąć „naturalnej” regulacji curli, zaprojektowano i zsyntetyzowano syntetyczny operon obejmujący te 5 genów csg pod kontrolą silnego i indukowalnego kobaltem promotora (Rycina 2). Opisano szczegółową analizę regionu kodującego curli oraz procedurę projektowania funkcjonalnego syntetycznego operonu. Wyjaśniono dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji adhezji bakterii do polistyrenu i szkła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projekt i synteza Biobrick operonu curli

  1. Określ organizację genetyczną oraz zlokalizuj endogenne sygnały transkrypcyjne i translacyjne genów kurli. Informacje te są gromadzone w specjalistycznych bazach danych, takich jak RegulonDBa lub EcoGeneb i uzupełnione starannym zapoznaniem się z odpowiednimi publikacjami. Zarządzanie danymi i in silico analizy wstępne przeprowadzono za pomocą oprogramowania Clone Managerc.
  2. Wybierz odpowiednie sekwencje kodujące. Zestaw pięciu genów absolutnie niezbędnych do syntezy curlów (csgB i csgA kodujących monomery włókien) i eksportu (csgE csgF i csgG, kodujących kompleks wydzielniczy curliny) wybrano do konstrukcji operonu syntezyjnego. Wyodrębnij wybrane sekwencje z bazy danych w formacie FASTA.
    Ponieważ csgGFE klastra jest antysensowny w E. coli genom, przekonwertuj tę sekwencję na jej odwrotną komplementarną za pomocą narzędzi Operations w programie Clone Manager> Proces cząsteczkowy>Odwróć cząsteczkę. Wklej csgEFG sekwencja za csgBA przy użyciu funkcji „Ligate” (Clone> Ligacja).
  3. Dodaj odpowiedni promotor. Poprzez umieszczenie pięciu wybranych genów czerwieni pod kontrolą promotoru Prcn, przewiduje się nadprodukcję curli w obecności kobaltu i niklu. rcn lokus koduje pompę wydzielniczą odpowiedzialną za detoksykację Ni i Co (rcnA) oraz jego odpowiedni regulator metaloaktywowany (rcnR). RcnR kontroluje ekspresję rcnA i jej własny gen w odpowiedzi na Ni i Co 19. The rcn sekwencja obejmująca rcnR CDS, całość rcn region międzygenowy oraz 41 pierwszych nukleotydów rcnA znajdował się przed csgBAEFG sekwencja chimeryczna (Rysunek 1, sekwencja całego konstruktu została podana jako dane uzupełniające).
  4. Optymalizacja sygnałów transkrypcyjnych. Idealny miejsce wiązania rybosomu (ang. perfect RBS = AAGGAGGTATATA) został dodany przed pierwszym kodonem ATG csgBA Sekwencja DNA. Drugi idealny RBS został dodany przed csgEFG sekwencja. Endogenne RBS dla csgB i csgF i csgG geny zostały zachowane.
  5. Aby spełnić standardy iGEM, urządzenie musi być otoczone standardowym prefiksem i sufiksem BioBrick, zawierającymi miejsca restrykcyjne dla EcoRI, PstI (przedrostek) oraz SpeI oraz XbaI (sufiks). Wklej odpowiednie sekwencje na każdym końcu konstruktud.
  6. Wyeliminuj wszystko EcoRI, PstJa, SpeI oraz Xbamiejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego I w urządzeniu. Aby ułatwić dalszy proces montażu, sam element BioBrick nie powinien zawierać żadnych z tych miejsc restrykcyjnych. Analiza in silico miejsc restrykcyjnych w urządzeniu ujawniła jedno Pstmiejsce I w csgA sekwencja, jeden Pstmiejsce I w rcnR sekwencja i jedna EcoMiejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego w csgE gena. Miejsca te znajdują się odpowiednio na pozycji 80 (Mut1), 1340 (Mut2) i 1830 (Mut3) sekwencji konstruktu (dane uzupełniające) i zostały zmodyfikowane w sposób następujący za pomocą mutacji cichych.
    Mut1 PstLokus I CTGCAG zmieniony na CGTCTG
    Mut2 PstLokus I CTGCAG zmieniony na CAGCAG
    Mut3 EcoMiejsce restrykcyjne GAATTC zmienione na GAATT
  7. Przeprowadź symulację klonowania za pomocą oprogramowania Clone Manager (Operation>Przetwarzanie cząsteczek>Użyj programu do analizy sekwencji BLAST, aby zweryfikować pełną homologię między białkiem czerwieni dzikiego typu a białkami kodowanymi przez sztuczny operon.
  8. Zamów syntetyczny operon. Usługi syntezy genów oferowane są przez wiele firm na całym świecie; naszym partnerem była firma Genecust (Luksemburg). 4 μg sztuczny operon (3165 pz) otrzymano kilka tygodni później i włączono do wektora pUC57 (pIG2)

2. Wizualizacja i ilościowe oznaczanie bakterii przylegających do polistyrenu

  1. Wypełnij każdą studzienkę płytki polistyrenowej 24-dołkowej 2 ml minimalnego ośrodka M63 (glukoza 0,2%) i zaszczep każdą studzienkę 106 komórek z nocnej hodowli. Hoduj bakterie przez 18–48 godz. w 30 °C bez mieszania. Każdy wiersz (4 studzienki) reprezentuje jedną modalność. Dodaj odpowiednią ilość kobaltu (25–100 mM) oraz antybiotyku (ampicylina 100 μg·L-1), jeśli to konieczne. Trzy pierwsze wiersze płytki 24-dołkowej są używane do ilościowego oznaczania bakterii przylegających poprzez uśrednienie trzech powtórzeń, ostatni wiersz jest używany do wizualizacji biofilmu.
  2. Dla trzech pierwszych wierszy płytki 24-dołkowej: z każdej studzienki pobierz supernatant zawierający komórki planktoniczne.
  3. Delikatnie przepłucz każdą studzienkę 1 ml M63 i połącz 1 ml płukania z początkowym supernatantem uzyskanym w punkcie 2.2). Mieszaninę tę nazywa się komórkami pływającymi (=S).
  4. Pobierz biofilm do 1 ml M63, przez sczepianie i pipetowanie w górę i w dół (=B). Wytrząsaj przez 15 sekund. Oszacuj liczbę bakterii przylegających do powierzchni i pływających na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm (OD600), aby uzyskać procent przylegania odpowiadający każdej modalności.
  5. Procent przylegania oblicza się według wzoru: B×100/(3×S+B).
  6. Wyłącznie dla ostatniego wiersza płytki 24-dołkowej: usuń komórki planktoniczne.
  7. Przepłucz biofilm, który wytworzył się na dnie płytki, 1 ml M63.
  8. Wysusz otwartą płytkę przez 1 godz. w 80 °C.
  9. Dodaj do każdej studzienki 100 μl 20% fioleci krystalicznej na 2 min, a następnie dokładnie przepłucz wodą, aby zwizualizować bakterie przylegające do powierzchni.
    Należy przeprowadzić trzy niezależne oznaczenia (płytki), aby zapewnić powtarzalność wyników.

3. Wizualizacja przylegających bakterii na szkle metodą mikroskopową

  1. Uzyskaj szkielet fluorescencyjny. E. coli SCC1e szczep, który konstytutywnie ekspresuje zielony białko fluorescencyjne (GFP) bez obserwowalnej różnicy w porównaniu z szczepem macierzystym MG1655 20 jest odpowiednim gospodarzem dla plazmidu zawierającego syntetyczny operon czerwieni
  2. Transformuj szczep SCC1 plazmidem pIG2 (=syntetyczny operon cURLi wbudowany w) EcoRI/PstI miejsce plazmidu pUC57), aby uzyskać szczep S23. Przekształć SCC1 plazmidem kontrolnym (pUC18), aby uzyskać szczep kontrolny S24 21.
  3. Upraszczając regulację czerwi przez przełączenie endogennego złożonego promotoru (zidentyfikowano ponad 10 regulatorów transkrypcyjnych) na prosty promotor regulowany metalem, znacznie ułatwia się kontrolę przylegania. Drugi krok obejmuje ocenę jakościową i ilościową zdolności przylegania za pomocą prostych metod. Metody te można zastosować do szerokiego zakresu bakterii przylegających, niezależnie od struktur biologicznych zaangażowanych w tworzenie biofilmu. Test przylegania w 24-dołkowych płytach polistyrenowych pozwala na szybką wstępną wizualizację biofilmu bakteryjnego po barwieniu fioletem krystalicznym. Tę ocenę jakościową można doprecyzować poprzez ilościowe oznaczenie procentu przylegania. Taka metoda jest bardzo prosta, ale bardziej dokładna niż sama metoda barwienia fioletem krystalicznym, opisana wcześniej1, cechując się dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością. Wizualizacja bakterii znakowanych GFP na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej pozwala wzmocnić wyniki uzyskane w teście na 24-dołkowej płycie poprzez bezpośrednią obserwację zjawiska. 30 °C w pożywce M63 uzupełnionej glukozą (0,2%) i ampicylina (100 μg.-1).
  4. Zaszczep 15 ml tego samego podłoża w szalkach Petriego 100 μl kultur wstępnych. Dodaj odpowiednie stężenie kobaltu (czyli 25 μM) i nie zapomnij o ujemnej kontroli bez kobaltu. Umieść 3 prostokątne szkiełka pokrywkowe w każdej szalce Petriego. Inkubuj nocą w temperaturze 30 °C bez mieszania
  5. Usuń szkiełko z płytki Petriego i ostrożnie je osusz. Delikatnie wyczyść dolną powierzchnię małą watą nasączoną 70 ° etanol, usuwając wszelkie pozostałości bakteryjne. W celu obserwacji konfokalnej oczyść oba górne końce na kilka milimetrów, aby umożliwić późniejsze zamocowanie pokrywki.
  6. Przyległe bakterie można wizualizować bezpośrednio, ale szybko, pod mikroskopem fluorescencyjnym, należy jednak uważnie unikać wysychania próbki.
  7. W celu obserwacji konfokalnej należy umieścić szkiełko pokrywowe na szkiełku podstawowym tak, aby strona górna pokryta biofilmem była skierowana do góry. Następnie biofilm przykrywa się większym szkiełkiem pokrywовым, które przykleja się do szkiełka podstawowego lakierem. Następnie cały zestaw odwraca się, tak aby biofilm znalazł się na dolnej stronie.
  8. Umieść zestaw pod mikroskopem konfokalnym z laserem. Użyto mikroskopu konfokalnego z laserem Axioplan2 LSM510 (Zeiss) na platformie Platimf.
  9. Ustawienie. Wzbudź GFP przy długości fali 488 nm i zbieraj fluorescencję bakterii w zakresie od 500 do 600 nm. Do pozyskiwania obrazów w trybie konfokalnego skanowania laserowego użyj obiektywu 40x z zanurzeniem olejowym. Skanuj całe trójwymiarowe struktury biofilmów od powierzchni stałej aż do granicy fazowej ze środowiskiem wzrostu, stosując krok 1 μm.
  10. Wykonaj trójwymiarowe projekcje za pomocą oprogramowania IMARIS (Bitplane, Zürich, Szwajcaria). Oceń grubość biofilmu poprzez analizę średniej wartości z wzdłuż statystycznych przekrojów podłużnych. Ilościowe określenie objętości biofilmu można uzyskać z zestawów obrazów konfokalnych w kierunku osi z, zgodnie z opisem w innych publikacjach. 22.

aRegulonDB zawiera informacje o mechanizmach organizacji operonów oraz ich rozkładzie na jednostki transkrypcyjne, promotory i ich typ sigma, geny oraz miejsca wiązania rybosomów, terminatory, miejsca wiązania specyficznych regulatorów transkrypcyjnych, a także ich organizacji w ramach regulacyjnych fraz. http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp

bBaza danych EcoGene zawiera aktualne informacje o sekwencjach genomu i proteomu szczepu E. coli K-12, w tym obszerne bibliografie genów. Głównym celem projektu EcoGene była ponowna ocena miejsc inicjacji translacji. http://ecogene.org/

chttp://www.scied.com/dl_cmp9d.htm

dhttp://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Pomoc:Prefiks_i_sufiks_BioBrick

ePrezent od Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, Singapur.

fPlatforma mikroskopowa UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

In silico adnotacja sekwencji csg typu dzikiego E. coli K12 powiązana z optymalizacją sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych pozwoliła na zaprojektowanie pojedynczego syntetycznego operonu curli Prcn-csg przedstawionego na Rysunku 3 (pełna sekwencja w danych uzupełniających). Do wizualizacji i kwantyfikacji adhezji związanej z produkcją curli wykorzystano protokół 2 i protokół 3. Dzięki barwieniu fioletem krystalicznym na polistyrenowych płytkach 24-dołkowych (prot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe etapy

Kluczowym etapem w tym podejściu z zakresu biologii syntetycznej jest projektowanie genów. Projektowanie genów syntetycznych musi być skrupulatne, aby zapewnić wydajną produkcję systemu. Dwa geny kodujące monomery włókien oraz trzy geny kodujące białka zaangażowane w ich system sekrecji zostały połączone z silnym, indukowalnym metalem promotorem w celu stworzenia nowej jednostki funkcjonalnej do nowatorskiego zastosowania: biodekontaminacji ścieków nuklearnych. Zgodnie z planem i p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy pozostałym członkom zespołu Lyon INSA-ENS iGEM (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy, Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon oraz Valérie Desjardin), naszym sponsorom za wsparcie finansowe (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon oraz Departament Nauk Biologicznych INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé za krytyczną lekturę niniejszego manuskryptu oraz dr C.C. Sze za przekazanie szczepu. B. Drogue otrzymał stypendium doktoranckie z Région Rhône-Alpes.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pIG2pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) z fragmentem EcoRI/PstI o długości 3165 bp zawierającym syntetyczny operon Prcn-csgBAEFG ; Ampr
pUC18Plazmid wielokopiowy (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr
S23SSC1 (= MG1655 z tagiem GFP, dar od C.C. Sze)/pIG2
S24SSC1/pUC18
CoCl2SigmaRoztwór stokowy 0,1M przechowywany w temperaturze pokojowej
M6329
Płytka 24-dołkowa Nunc55429Polistyrenowe płytki 24-dołkowe

Bibliografia

  1. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).
  2. Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
  3. Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
  4. Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
  5. Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
  6. Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  9. Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
  10. Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
  11. Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
  12. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
  13. Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
  14. Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
  15. Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
  16. Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
  17. Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
  18. Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
  19. Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
  20. Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
  21. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
  22. Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
  23. Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
  24. Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
  25. Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
  26. Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
  27. Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
  28. Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
  29. Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

adhezja bakteryjnanadekskrecja curlipromotor regulowany przez metalebarwienie fioletem krystalicznymmikroskopia konfokalnabakterie z tagiem GFPilościowe oznaczanie biofilmutest adhezji do polistyrenuoprogramowanie Clone Manager
Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.