Zoptymalizowana procedura sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) izolacji autonomicznych progenitorów nerwowych z narządów trzewnych płodów myszy

Podsumowanie

Opisana jest zoptymalizowana procedura oczyszczania neuronalnych progenitorów pochodzących z grzebienia nerwowego z tkanek płodowych myszy. Metoda ta wykorzystuje ekspresję fluorescencyjnych alleli reporterowych do izolowania dyskretnych populacji poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Technika ta może być stosowana do izolowania subpopulacji neuronów w trakcie rozwoju lub z tkanek dorosłych.

Streszczenie

Podczas rozwoju progenitory neuronalne pochodzące z grzebienia nerwowego (NC) migrują z cewy nerwowej, tworząc autonomiczne zwoje w narządach trzewnych, takich jak jelito i dolne drogi moczowe. Zarówno podczas rozwoju, jak i w dojrzałych tkankach, komórki te są często szeroko rozproszone w tkankach, tak że izolacja dyskretnych populacji przy użyciu metod takich jak mikrodyssekcja wychwytywania laserowego jest trudna. Można je jednak bezpośrednio uwidocznić poprzez ekspresję fluorescencyjnych reporterów napędzanych z regionów regulatorowych genów specyficznych dla neuronów, takich jak hydroksylaza tyrozyny (TH). Opisujemy metodę zoptymalizowaną pod kątem wysokiej wydajności żywotnych progenitorów neuronalnych TH + z tkanek trzewnych płodu myszy, w tym jelit i dolnych dróg moczowo-płciowych (LUT), w oparciu o dysocjację i sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).

Gen Th koduje enzym ograniczający szybkość produkcji katecholamin. Progenitorzy neuronów jelitowych zaczynają wyrażać TH podczas ich migracji w jelicie płodu¹, a TH jest również obecny w podzbiorze dorosłych neuronów zwojów miednicy^2-4 . Pierwsze pojawienie się tej linii i rozmieszczenie tych neuronów w innych aspektach LUT oraz ich izolacja nie zostały opisane. Neuronalne progenitory wyrażające TH można łatwo uwidocznić przez ekspresję EGFP u myszy przenoszących konstrukt transgenu Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat / Mmnc¹. Zobrazowaliśmy ekspresję tego transgenu u płodów myszy, aby udokumentować rozmieszczenie komórek TH + w rozwijającym się LUT po 15,5 dniu po stosunku (dpc), oznaczając poranek wykrycia czopa jako 0,5 dpc i zaobserwowaliśmy, że podzbiór neuronalnych komórek progenitorowych w łączących się zwojach miednicy wyraża EGFP.

Aby wyizolować progenitory neuronów LUT TH+, zoptymalizowaliśmy metody, które początkowo były używane do oczyszczania komórek macierzystych grzebienia nerwowego z jelita myszy płodu^2-6. Wcześniejsze wysiłki mające na celu wyizolowanie populacji pochodzących z NC opierały się na trawieniu koktajlem kolagenazy i trypsyny w celu uzyskania zawiesin komórkowych do cytometrii przepływowej. W naszych rękach metody te pozwoliły na uzyskanie zawiesin komórkowych z LUT o stosunkowo niskiej żywotności. Biorąc pod uwagę i tak już niską częstość występowania neuronalnych komórek progenitorowych w tkankach płodowych LUT, postanowiliśmy zoptymalizować metody dysocjacji tak, aby zwiększyć przeżywalność komórek w końcowych dysocjacjach. Ustaliliśmy, że delikatna dysocjacja w Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), ręczne filtrowanie i sortowanie przepływowe przy niskich ciśnieniach pozwoliły nam osiągnąć konsekwentnie większą przeżywalność (>70% wszystkich komórek) z późniejszymi wydajnościami neuronalnych progenitorów wystarczającymi do dalszej analizy. Opisana przez nas metoda może być szeroko stosowana do izolowania różnych populacji neuronów z tkanek płodowych lub dorosłych myszy.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki (wszystkie etapy wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej)

1. Połącz następujące elementy: 44 ml pożywki L-15, 0,5 ml 100 razy penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,5 ml 100 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 ml 1M HEPES, 5 ml wody klasy kultur tkankowych. Pamiętaj, aby dokładnie wymieszać BSA i P/S przed dodaniem. Objętość ta powinna być wystarczająca do dysocjacji do pięciu różnych typów tkanek. Pożywka ta zostanie użyta w kroku 3.4 do przygotowania roztworów hartowniczych do użycia po enzymatycznej dysocjacji tkanki.
2. Media filtracyjne przez filtr polieterosulfonowy (PES) 0,22 μm.
3. Przygotuj 1X Zbilansowany Roztwór Soli Hanka (HBSS) i 1X Sól Fizjologiczną Buforowaną Fosforanami (PBS) z 10X Stocks, używając wody klasy do kultur tkankowych. Przefiltrować przez filtr PES 0,22 μm. Duże ilości tych odczynników można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C, w razie potrzeby porcjując mniejsze objętości w kapturze do hodowli tkankowych.
4. Napełnij wiele stożkowych probówek o pojemności 15 ml 1X HBSS (liczba probówek równa liczbie tkanek, które planujesz podpreparować), utrzymując probówki na lodzie.

2. Sekcja

1. Poddaj eutanazję ciężarnej myszy w czasie zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania i przenieś macicę na 60 lub 100 mm szalkę Petriego zawierającą lodowaty 1X PBS.
2. Usuń zarodki z macicy i poddaj eutanazji przez dekapitację w lodowatym 1X PBS. Badanie przesiewowe przeprowadzane indywidualnie w oświetleniu fluorescencyjnym, dzieląc na dodatnie pule transgeniczne i nietransgeniczne typu dzikiego (WT). Trzymaj zarodki w lodowatym 1X PBS podczas sekcji.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym przeprowadź subsekcję dróg moczowo-płciowych. Przytrzymaj zarodek na miejscu na poziomie kończyn przednich za pomocą cienkich kleszczy. Usuń wnętrzności z wątroby w dół do guzka narządów płciowych, wkładając kleszcze na poziomie przepony, a następnie energicznie ciągnąc narządy wewnętrzne w dół i odsuwając je od grzbietowej ściany ciała.
4. Następnie należy wyciąć tkankę będącą przedmiotem zainteresowania z dala od otaczającej tkanki (ryc. 1). Umieść każdy indywidualnie wycięty typ tkanki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej lodowaty 1X HBSS. Połączyć ze sobą każdy typ tkanki zgodnie z fenotypem zarodka (tj. wszystkie próbki jelita płodu GFP+ są zebrane w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 ml).
5. Równolegle należy przeprowadzić sekcję porównywalnych tkanek z zarodków typu dzikiego w celu wykorzystania ich do kontroli kompensacyjnej w cytometrii przepływowej.

3. Dysocjacja tkanek podwypreparowanych

1. Wypreparowana tkanka w postaci osadu przez odwirowanie przy względnej sile odśrodkowej 210 (rcf), 4 °C przez 5 min. Po odwirowaniu odessać jak najwięcej HBSS.
2. Zawiesić ponownie osad tkankowy w Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), pamiętając o zmianie końcówek pipet między każdą próbką, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego typów tkanek. Ilość dodanego Accumax może być skalowana dla większych lub mniejszych ilości tkanki. Zazwyczaj w przypadku 1-5 próbek jelita płodu stosuje się 1 ml Accumax, ale większe pule tkanek będą wymagały większej objętości, aby osiągnąć dysocjację.
3. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20-45 minut, w zależności od etapu izolowanej tkanki (np. 13,5 dpc jelito 20 min, 15,5 dpc jelito 35 min). W połowie czasu dysocjacji ręcznie rozbij tkankę, uderzając rurką o bok łaźni wodnej (lub jakąkolwiek stałą powierzchnię) i "trzepnąc" rurką (tak jak potrząsa się staromodnym termometrem rtęciowym). Pod koniec czasu dysocjacji powtórzyć procedurę wstrząsania wiele razy, aby jeszcze bardziej zdysocjować próbkę. W przypadku bardziej delikatnych próbek należy zmniejszyć energiczność wstrząsu i zamiast tego użyć rozcierania pipetami w kroku 3.5, aby osiągnąć odpowiedni poziom dysocjacji. Typowe czasy dysocjacji dla tablic LUT 14,5 dpc i 15,5 dpc wynoszą odpowiednio 35 i 45 minut.
4. Podczas inkubacji tkanki w Accumax, przygotuj roztwory hartownicze, zwane Quench i Quench 1:5. Hartowanie odbywa się przez dodanie 45 μl 5 mg/ml DNazy I do 6 ml pożywki L-15. Hartowanie w stosunku 1:5 wykonuje się przez dodanie 45 μl 5 mg/ml DNazy I do 30 ml pożywki L-15.
5. Pod koniec dysocjacji przenieść 15 ml probówek na lód i natychmiast dodać 1 ml Quench do każdej probówki. Dziel każdą próbkę w górę i w dół, aż tkanka zostanie prawie całkowicie zdysocjowana (ryc. 2). W roztworze nadal będą obecne małe kawałki tkanki. Uzyskanie całkowicie jednorodnej próbki nie jest ani łatwe, ani pożądane, ponieważ może skutkować słabą żywotnością komórek.
6. Utrzymuj próbkę na lodzie tak długo, jak to możliwe, przez pozostałą część protokołu. Należy pamiętać, aby używać świeżej końcówki do pipet podczas pipetowania Quench lub Quench 1:5, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbek.

4. Zawieszenie komórek filtrujących

1. Za pomocą kleszczy nasączonych 70% etanolem umieść 3 cm kwadrat nylonowej membrany siatkowej o grubości 38 μm (Sefar America) nad otworem nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przefiltruj komórki przez siatkę, pipetując do środka membrany za pomocą końcówek o wąskim otworze. Jeśli membrana zostanie nasycona podczas filtrowania, usuń ją, osusz wylot rurki chusteczką kimwipe i użyj nowego kawałka nylonowej siatki do przefiltrowania pozostałej zawiesiny komórek. Po przefiltrowaniu wszystkich komórek użyj 1 ml Quench 1:5, aby przepłukać probówkę i przefiltrować wszelkie pozostałe komórki.
2. Po zakończeniu filtrowania lub wymianie zatkanej membrany użyj kleszczyków, aby zwinąć boki siatki i przetrzyj membranę w poprzek rurki, aby usunąć wszelkie zwisające kropelki komórek.
3. Zawiesina komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Odessać z supernatantu i ponownie zawiesić osad w 1 ml Ukruszyć w stosunku 1:5.
4. Zawiesinę komórek filtracyjnych przez siatkę nylonową do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml. Przepłukać probówkę o pojemności 15 ml za pomocą 1 ml Ugaszać w stosunku 1:5 i przefiltrować, aby uchwycić pozostałe komórki.

5. Przygotowanie próbek do FACS

1. W przypadku użycia tej samej tkanki do sortowania i kontroli kompensacyjnej, należy przenieść od 1/10 do 1/20 objętości próbki do nowej probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml w celu wykorzystania do kontroli kompensacyjnej. Podzielić próbkę tkanki typu dzikiego na dwie porcje. Jedna porcja będzie niebarwionym typem dzikim (tylko WT), podczas gdy druga połowa będzie zawierała 7-aminoaktynomycynę D (7-AAD, fluorescencyjny interkalator wykluczony z żywych komórek używanych jako "barwnik żywotności") dodany do niej (tylko 7-AAD). Te indywidualne kontrole są potrzebne, aby umożliwić kompensację jakiegokolwiek nakładania się widma między emisją dyskretnych fluoroforów w sortowniku przepływowym. Na przykład w przypadku pojedynczego reportera fluorescencyjnego, takiego jak EGFP, niezbędne kontrole obejmowałyby: tylko EGFP, niebarwione ogniwa WT i probówkę barwioną tylko 7-AAD (Figura 3).
2. Napełnić wszystkie probówki o pojemności 5 ml zawierające zawiesinę komórkową roztworem Quench w stosunku 1:5 i odwirować w temperaturze 210 rcf, 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant, pozostawiając około 200 μl cieczy w probówce.
3. Rozcieńczyć 7-AAD 1:1000 w Quench 1:5. Dodać rozcieńczenie barwienia 7-AAD do kontroli kompensacji tylko 7-AAD i próbek do sortowania. Nie dodawaj 7-AAD do kontrolek kompensacji tylko EGFP lub tylko WT. Objętość 7-AAD, która ma zostać dodana, będzie się różnić w zależności od ilości materiału wyjściowego i wielkości uzyskanej osadki komórkowej. Po dodaniu 7-AAD do odpowiednich probówek, próbki są gotowe do sortowania. tkanka Wielkość puli próbek Tom 7-AAD do dodania do probówki* 15,5 dpc Jelito 1-5 200 μl 15,5 dpc LUT 1-5 150 μl
   Tabela 1. Ilość 7-AAD dodana do różnych tkanek dysocjuje * Ostateczna całkowita ilość w każdej probówce będzie się różnić o ilość w zakresie od 50 do 100 μl, ponieważ aspiracja pożywki jest procesem przybliżonym i wykonywanym w celu uniknięcia osadu. Objętości końcowe nie są mierzone, aby zminimalizować obchodzenie się z komórkami w roztworze.
4. Przygotować probówki do wychwytywania komórek do izolacji RNA, dodając 0,75 ml TRIzol-LS do 1,5 ml probówek do mikrowirówek.
5. W przypadku pobierania komórek do hodowli in vitro, a nie izolacji RNA, należy sortować komórki bezpośrednio na pożywki samoodnawiające się na 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej, pokrytych fibronektyną i wypełnionych pożywką, jak opisano wcześniej. ^2,6,7

6. Cytometria przepływowa

1. Na cytometrze przepływowym należy najpierw ocenić mechanizmy kontrolne kompensacji, pamiętając o płukaniu wstecznym między każdą próbką, aby uniknąć zanieczyszczenia. Użyj profili próbek kompensacyjnych, aby ustawić napięcia/bramki do sortowania. Należy zauważyć, że jeśli dodatnie komórki w pożądanej tkance są obecne w ograniczonej liczbie, do ustalenia ustawień kompensacji można użyć odrębnej tkanki, o ile intensywność fluorescencji i wielkość komórek między próbkami są porównywalne.
2. Ustaw parametry kompensacji i bramki, aby uniknąć martwych komórek, które pobierają barwnik 7-AAD i zbierają komórki wykazujące wysoką intensywność fluorescencji GFP w porównaniu z niebarwionymi kontrolami (ryc. 4).
3. Sortuj maksymalnie 25 000 komórek do każdej probówki do mikrowirówki. Sortowanie powinno odbywać się przy najniższym możliwym ciśnieniu z dyszą o szerokim otworze i niskim natężeniu przepływu (np. dysza 17 psi, 100 μm, 3 000 zdarzeń / s), aby zachować żywotność neuronalnych progenitorów. W celu wyizolowania komórek EGFP+ wykonujemy nasze izolacje na BD Biosciences FACSAriaII przy użyciu lasera 488nm 20mW w celu wzbudzenia reportera EGFP.
4. Jeśli próbki zawierają wysokie stężenia komórek, zaleca się dalsze rozcieńczanie zawiesiny komórek za pomocą barwnika 1:1000 7-AAD, aby osiągnąć wyższą skuteczność wychwytywania podczas sortowania.
5. Wirować każdą probówkę komórek przechwyconych w TRIzol-LS natychmiast po sortowaniu.

7. Reprezentatywne wyniki

Dysocjacja tkanek w celu wytworzenia zawiesiny komórek do sortowania przepływowego to delikatna równowaga między odpowiednim trawieniem enzymatycznym a unikaniem nadmiernego trawienia, które może skutkować niską żywotnością komórek. Przykład pożądanego poziomu dysocjacji tkanek przedstawiono na rysunku 2. W odpowiednio strawionej tkance przed ręcznym rozwarstwieniem nadal wyraźnie widoczne są fragmenty podwypreparowanych narządów (ryc. 2b, 2f). W tkankach, które są poddawane obróbce enzymatycznej przez zbyt długi okres czasu lub przy zbyt wysokim stężeniu enzymu, powstała zawiesina nie zawiera żadnych szczątkowych dużych kawałków tkanki (ryc. 2d, 2h).

Odpowiednia dysocjacja i ręczne filtrowanie tworzą profile sortowania w cytometrii przepływowej, które zazwyczaj wykazują więcej niż 90% żywotnych komórek i wykazują wysoki poziom ekspresji EGFP (Rysunek 4). Populacje komórek uzyskane tą metodą wykazują dobrą żywotność i mogą być wychwytywane w celu późniejszej hodowli lub analizy ekspresji genów poprzez bramkowanie w celu wychwycenia neuronalnych komórek progenitorowych EGFP+.

Rysunek 1. Dystrybucja neuronalnych komórek progenitorowych TH-EGFP+ w płodowym LUT myszy. Cały układ moczowo-płciowy w temperaturze 15,5 dpc oglądany brzusznie w jasnym świetle pola (a) w porównaniu z dystrybucją komórek EGFP+ znakowanych ekspresją transgenu TH-EGFP zidentyfikowaną w oświetleniu fluorescencyjnym (b). Ekspresja TH-EGFP jest obecna w nadnerczach (a) i przyśrodkowo zlokalizowanych zwojach trzewnej (cg). Widok boczny (c) podrozciętego pęcherza moczowego 15,5 dpc TH-EGFP wykazuje fluorescencję ekspresji transgenu w zwojach miednicy (pg), ścianie pęcherza moczowego (bla) i cewce moczowej (u). W widoku grzbietowym (d) komórki EGFP+ są widoczne w przedniej cewki moczowej grzbietowej. Inne etykiety: nerki (k), jądra (t), pęcherz moczowy (bla) i guzek narządów płciowych (gt).

Rysunek 2. Obrazy w jasnym polu 15 dpc płodu LUT (a) i jelita (e), odpowiednio, zobrazowane w połowie okresu inkubacji dysocjacji, pod koniec inkubacji dysocjacji przed przerwaniem (b, f), po ręcznym przerwaniu (c, g) oraz w próbce, która została nadmiernie zdysocjowana (d, h).

Rysunek 3. Schemat ideowy ilustruje kontrole kompensacji potrzebne do ustalenia rygorystycznych parametrów bramkowania FACS.

Rysunek 4. Reprezentatywny obraz profili sortowania przepływowego przy 14,5 dpc (a) i 15,5 dpc (b). populacja składa się z pojedynczych komórek opartych na rozproszeniu do przodu i na boki, które są martwe i znakowane fluorescencją 7-AAD. Szara populacja składa się z komórek singletowych opartych na rozproszeniu do przodu i boku, które wykluczyły 7-AAD i dlatego są żywotne. Zielona bramkowana populacja jest oznaczona obszarem "GFP+" i składa się z pojedynczych komórek, które wykluczyły 7-AAD (żywotne) i wykazują fluorescencję EGFP.

Dyskusja

Mysie linie reporterowe wyrażające fluorescencyjne reportery stają się szeroko dostępne dzięki wielu wysiłkom w społeczności genetyki mysiej^1,8,9. W rezultacie, przedstawiona tutaj metoda dysocjacji może być szeroko stosowana do izolacji dyskretnych podtypów neuronów w oparciu o wzorce ekspresji neuroprzekaźników lub receptorów z tkanek płodu lub dorosłych. Chociaż zoptymalizowaliśmy tę metodę w oparciu o ekspresję fluorescencyjnego reportera transgenu, można ją również zastosować do próbek wyrażających recept...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Przechowywać zamrożone w 1 ml porcji
DNase I	Sigma	D-4527	Przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -20 ° C 5 mg / ml w 1xHBSS, (Stosowany w Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7,4	Gibco	70011-044	Uzupełnij do 1x wodą o jakości do hodowli tkankowej, a następnie sterylnym filtrem
10X HBSS bez Ca lub Mg	Gibco	14185-052	Uzupełnij do 1x wodą do hodowli tkankowych, a następnie sterylnym filtrem
Leibovitz's L-15	medium Gibco	21083027
Penicylina / Streptomycyna 100X	Gibco	15140-133	Przechowywać w temperaturze -20 ° C
BSA	Sigma	A3912-100G	Przechowywać z podaniem -20 & deg; C, 100 mg/ml w wodzie
Biowhittaker 1M HEPES w 0,85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μ m Membrana z siatki nylonowej NITEX	Sefar America	3-38/22	Pocięte na ~3 cm kwadraty. Zabieg UV przez noc w celu sterylizacji w kapturze do hodowli tkankowej.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml probówki polistyrenowe	Falcon	352058
15 ml probówki stożkowe	Corning	430790
Drobne kleszcze preparacyjne	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 kleszcz, Dumoxel, końcówka standardowa 0,1x0,06mm
Łyżka preparcyjna	Fine Science Instruments	10370-18