Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Podsumowanie

Opisano zoptymalizowaną procedurę oczyszczania neuronalnych progenitorów pochodzących z grzebienia neuronalnego z tkanek zarodkowych myszy. Metoda ta wykorzystuje ekspresję fluorescencyjnych alleli reporterowych do izolowania odrębnych populacji za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Technikę tę można zastosować do izolowania neuronalnych subpopulacji na różnych etapach rozwoju lub z tkanek dorosłych.

Streszczenie

Podczas rozwoju neuronalne progenitory pochodzące z grzebienia neuronalnego (NC) migrują z rurki nerwowej, aby tworzyć zwoje autonomiczne w narządach trzewnych, takich jak jelita i dolny odcinek dróg moczowych. Zarówno podczas rozwoju, jak i w tkankach dojrzałych, komórki te są często szeroko rozproszone w tkankach, co sprawia, że izolacja dyskretnych populacji za pomocą metod takich jak mikrodysekcja laserowa jest trudna. Można je jednak bezpośrednio zwizualizować dzięki ekspresji fluorescencyjnych reporterów sterowanych przez regiony regulacyjne genów specyficznych dla neuronów, takich jak Tyrozynowa hydroksylaza (TH). Opisujemy metodę zoptymalizowaną pod kątem uzyskania wysokiej wydajności żywych progenitorów neuronalnych TH+ z płodowych tkanek trzewnych myszy, w tym z jelit i dolnego odcinka dróg moczowo-płciowych (LUT), opartą na dysocjacji i fluorescencyjnym sortowaniu komórek (FACS).

Gen Th koduje enzym limitujący szybkość produkcji katecholamin. Enteryczne progenitory neuronalne zaczynają wykazywać ekspresję TH podczas migracji w jelitach płodowych¹, a TH występuje również w podzbiorze neuronów zwojów miednicznych u osobników dorosłych^2-4. Pierwsze pojawienie się tej linii komórkowej, rozmieszczenie tych neuronów w innych obszarach dolnych dróg moczowych (LUT) oraz ich izolacja nie zostały dotąd opisane. Progenitory neuronalne wykazujące ekspresję TH można łatwo zwizualizować dzięki ekspresji EGFP u myszy niosących konstrukt transgenu Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mmnc¹. Obrazowano ekspresję tego transgenu u płodów myszy, aby udokumentować rozmieszczenie komórek TH+ w rozwijającym się LUT w 15,5 dniu po kopulacji (dpc), przyjmując poranek wykrycia czopu za 0,5 dpc; zaobserwowano, że podzbiór progenitorów neuronalnych w zlewających się zwojach miednicznych wykazuje ekspresję EGFP.

W celu wyizolowania progenitorów neuronalnych LUT TH+, zoptymalizowaliśmy metody pierwotnie stosowane do oczyszczania komórek macierzystych grzebienia nerwowego z jelita myszy płodowej^2-6. Poprzednie próby izolacji populacji pochodzących z grzebienia nerwowego opierały się na trawieniu koktajlem kolagenazy i trypsyny w celu uzyskania zawiesin komórkowych do cytometrii przepływowej. W naszych badaniach metody te pozwalały na uzyskanie zawiesin komórkowych z LUT o stosunkowo niskiej żywotności. Biorąc pod uwagę i tak niską częstość występowania progenitorów neuronalnych w tkankach płodowego LUT, podjęliśmy próbę optymalizacji metod dysocjacji w taki sposób, aby zwiększyć przeżywalność komórek w końcowych preparatach. Ustaliliśmy, że łagodna dysocjacja w Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), filtrowanie ręczne oraz sortowanie przepływowe przy niskim ciśnieniu pozwoliły nam na osiągnięcie konsekwentnie wyższej przeżywalności (>70% całkowitej liczby komórek), przy jednoczesnym uzyskaniu wydajności progenitorów neuronalnych wystarczającej do dalszych analiz. Opisana przez nas metoda może znaleźć szerokie zastosowanie w izolacji różnych populacji neuronalnych z tkanek mysich, zarówno płodowych, jak i dorosłych.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek (wszystkie etapy wykonane w komorze z laminarnym przepływem powietrza)

1. Połączyć następujące składniki: 44 ml pożywki L-15, 0,5 ml 100X penicyliny/streptomycyny (P/S), 0,5 ml 100 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 ml 1M HEPES, 5 ml wody jakości do hodowli tkankowych. Przed dodaniem należy dokładnie wymieszać BSA i P/S. Ta objętość powinna być wystarczająca do dysocjacji do pięciu różnych typów tkanek. Pożywka ta zostanie wykorzystana w kroku 3.4 do przygotowania roztworów gaszących używanych po enzymatycznej dysocjacji tkanki.
2. Przefiltrować pożywkę przez filtr polietersulfonowy (PES) 0,22 μm.
3. Przygotować 1X zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) oraz 1X roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) z roztworów stokowych 10X, używając wody jakości do hodowli tkankowych. Przefiltrować przez filtr PES 0,22 μm. Duże objętości tych odczynników można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C, rozdzielając mniejsze objętości w komorze do hodowli tkankowych w razie potrzeby.
4. Napełnić kilka stożkowych probówek 15 ml roztworem 1X HBSS (liczba probówek powinna odpowiadać liczbie tkanek przeznaczonych do dalszej dysekcji), utrzymując probówki w lodzie.

2. Disekcja

1. Uśmierć mysz w określonym dniu ciąży zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalną komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt, a następnie przenieś macicę do szalki Petriego o średnicy 60 lub 100 mm zawierającej lodowaty 1X PBS.
2. Wyjmij zarodki z macicy i uśmierć je poprzez dekapitację w lodowatym 1X PBS. Przesiewaj je pojedynczo pod oświetleniem fluorescencyjnym, dzieląc na grupy zarodków transgenicznych dodatnich oraz nienależących do transgenicznych typu dzikiego (WT). Przez cały czas trwania sekcji utrzymuj zarodki w lodowatym 1X PBS.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym przeprowadź precyzyjną sekcję układu moczowo-płciowego. Przytrzymaj zarodek pęsetą na poziomie przedniej kończyny. Usuń wnętrzności od wątroby w dół do guzka narządów płciowych, wprowadzając pęsetę na poziomie przepony, a następnie gwałtownie pociągnij organy wewnętrzne w dół i z dala od grzbietowej ściany ciała.
4. Dalej wycinaj interesującą tkankę z otaczających ją tkanek (Rycina 1). Umieść każdy rodzaj wyizolowanej tkanki w stożkowej probówce 15 ml zawierającej lodowaty 1X HBSS. Grupuj poszczególne rodzaje tkanek zgodnie z fenotypem zarodka (t.j. wszystkie próbki jelita płodowego GFP+ zostają zgrupowane w jednej stożkowej probówce 15 ml).
5. Równolegle wyizoluj porównywalne tkanki z zarodków typu dzikiego, aby wykorzystać je jako kontrole kompensacyjne w cytometrii przepływowej.

3. Dysocjacja podsekcjonowanych tkanek

1. Odwirować sub-dydsekcjonowaną tkankę przy użyciu siły odśrodkowej 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Po wirowaniu odessać jak największą ilość HBSS.
2. Resuspendować osad tkankowy w roztworze Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), pamiętając o zmianie końcówek pipety między każdą próbką, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej typów tkanek. Ilość dodawanego Accumax można dostosować do większej lub mniejszej ilości tkanki. Zazwyczaj dla 1-5 próbek jelita płodowego stosuje się 1 ml Accumax, jednak większe pule tkankowe będą wymagać większej objętości w celu uzyskania dysocjacji.
3. Umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20-45 min, w zależności od stadium izolowanej tkanki (np. jelito 13,5 dpc 20 min, jelito 15,5 dpc 35 min). W połowie czasu dysocjacji rozbić tkankę mechanicznie, uderzając probówką o ściankę łaźni wodnej (lub dowolną twardą powierzchnię) oraz poprzez „strząsanie” probówki (podobnie jak w przypadku starego termometru rtęciowego). Po zakończeniu czasu dysocjacji powtórzyć procedurę strząsania wielokrotnie, aby dalej dysocjować próbkę. W przypadku próbek bardziej delikatnych należy zmniejszyć intensywność strząsania i zamiast tego zastosować tryturację pipetą w kroku 3.5, aby uzyskać odpowiedni stopień dysocjacji. Typowe czasy dysocjacji dla LUT 14,5 dpc i 15,5 dpc wynoszą odpowiednio 35 i 45 min.
4. Podczas inkubacji tkanki w Accumax przygotować roztwory wygaszające, nazwane Quench oraz Quench 1:5. Roztwór Quench przygotowuje się poprzez dodanie 45 μl DNase I (5 mg/ml) do 6 ml Medium L-15. Roztwór Quench 1:5 przygotowuje się poprzez dodanie 45 μl DNase I (5 mg/ml) do 30 ml Medium L-15.
5. Po zakończeniu dysocjacji przenieść probówki 15 ml na lód i natychmiast dodać 1 ml Quench do każdej probówki. Tryturować każdą próbkę góra-dół, aż tkanka zostanie niemal całkowicie zdysocjowana (Ryc. 2). W roztworze nadal będą obecne niewielkie fragmenty tkanki. Uzyskanie całkowicie homogenicznej próbki nie jest łatwo osiągalne ani pożądane, ponieważ może to prowadzić do obniżenia żywotności komórek.
6. Przez resztę protokołu przechowywać próbkę na lodzie tak długo, jak to możliwe. Należy używać nowej końcówki pipety podczas pobierania Quench lub Quench 1:5, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek.

4. Filtrowanie zawiesiny komórkowej

1. Używając pęsety namoczonej w 70% etanolu, umieść kwadrat o boku 3 cm membrany z nylonowej siatki o wielkości oczek 38 μm (Sefar America) nad wlotem nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Przefiltruj komórki przez siatkę, pipetując zawiesinę do środka membrany za pomocą końcówek o wąskim światle. Jeśli membrana nasyci się podczas filtrowania, należy ją usunąć, osuszyć wlot probówki chusteczką typu kimwipe i użyć nowego kawałka nylonowej siatki do przefiltrowania pozostałej części zawiesiny komórkowej. Po przefiltrowaniu wszystkich komórek użyj 1 ml roztworu Quench 1:5, aby wypłukać probówkę i przefiltrować wszelkie pozostałe komórki.
2. Po zakończeniu filtrowania lub podczas wymiany zapchanej membrany, użyj pęsety, aby zwinąć boki siatki i przetrzyj membraną górną krawędź probówki, aby usunąć wiszące krople z komórkami.
3. Zcentryfuguj zawiesinę komórkową w celu uzyskania osadu przy 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 1 ml roztworu Quench 1:5.
4. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę do polistyrenowych probówek o pojemności 5 ml. Wypłucz probówkę 15 ml za pomocą 1 ml roztworu Quench 1:5 i przefiltruj, aby odzyskać wszystkie pozostałe komórki.

5. Przygotowanie próbek do FACS

1. W przypadku wykorzystania tej samej tkanki do sortowania oraz do kontroli kompensacji, przenieś 1/10^th do 1/20^th objętości próbki do nowej polistyrenowej probówki o pojemności 5 ml, która zostanie wykorzystana do kontroli kompensacji. Próbkę tkanki typu dzikiego należy podzielić na dwie części. Jedna część będzie stanowić niebarwioną próbkę typu dzikiego (tylko WT), natomiast do drugiej połowy należy dodać 7-aminoaktynominę D (7-AAD, fluorescencyjny interkalator wykluczany z żywych komórek, stosowany jako „barwnik żywotności”) (tylko 7-AAD). Poszczególne kontrole te są niezbędne, aby umożliwić kompensację wszelkich nakładek widmowych między emisjami poszczególnych fluoroforów w sorterze przepływowym. Na przykład w przypadku pojedynczego reportera fluorescencyjnego, takiego jak EGFP, niezbędne kontrole obejmowałyby: tylko EGFP, niebarwione komórki WT oraz probówkę zbarwioną tylko 7-AAD. (Rysunek 3).
2. Napełnić wszystkie probówki o pojemności 5 ml zawierające zawiesinę komórek roztworem Quench 1:5 i odwirować przy 210 rcf, 4 °C przez 5 min. Odessać nadsącz, pozostawiając około 200 μl cieczy w probówce.
3. Rozcieńczyć 7-AAD w stosunku 1:1000 w roztworze Quench w stosunku 1:5. Dodać rozcieńczenie barwiące 7-AAD do kontroli kompensacji zawierającej tylko 7-AAD oraz do próbek przeznaczonych do sortowania. Nie dodawać 7-AAD do kontroli kompensacji zawierających tylko EGFP lub tylko WT. Objętość dodawanego 7-AAD będzie zależeć od ilości materiału wyjściowego i wielkości otrzymanego osadu komórkowego. Po dodaniu 7-AAD do odpowiednich probówek próbki są gotowe do sortowania.

   Tkanka	Wielkość puli próbek	Objętość 7-AAD do dodania do probówki*
   Jelito w 15,5 dniu ciąży (dpc)	1-5	200 μl
   15,5 dpc LUT	1-5	150 μl

   
   Tabela 1. Ilość 7-AAD dodana do różnych dysocjatów tkankowych * Końcowa całkowita ilość w każdej probówce będzie różnić się o wartość w zakresie 50-100 μl Ponieważ odsysanie medium jest procesem przybliżonym i wykonuje się je w celu uniknięcia usunięcia osadu, objętości końcowe nie są mierzone, aby zminimalizować manipulacje komórkami w roztworze.
4. Przygotować probówki do zbierania komórek na potrzeby izolacji RNA, dodając 0,75 ml TRIzol-LS do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
5. W przypadku zbierania komórek do in vitro zamiast izolacji RNA, należy sortować komórki bezpośrednio do pożywki do samoodnowy w 6-dołkowych płytkach hodowlanych, pokrytych fibronektyną i wypełnionych pożywką zgodnie z wcześniejszym opisem.^2,6,7

6. Cytometria przepływowa

1. Na cytometrze przepływowym należy w pierwszej kolejności ocenić kontrole kompensacji, pamiętając o płukaniu wstecznym pomiędzy każdą próbką, aby uniknąć kontaminacji. Profile próbek kompensacyjnych należy wykorzystać do ustawienia napięć/bramek do sortowania. Należy zauważyć, że jeśli w pożądanej tkance komórki pozytywne występują w ograniczonej liczbie, do ustalenia ustawień kompensacji można użyć innej tkanki, pod warunkiem, że intensywność fluorescencji i wielkość komórek w próbkach są porównywalne.
2. Należy ustawić parametry kompensacji oraz bramki tak, aby wykluczyć martwe komórki pochłaniające barwnik 7-AAD i zebrać komórki wykazujące wysoką intensywność fluorescencji GFP w stosunku do niebarwionych kontroli (Rysunek 4).
3. Do każdej probówki do mikrocentryfugi należy posortować maksymalnie 25 000 komórek. Sortowanie powinno być przeprowadzane przy jak najniższym ciśnieniu, z dyszą o szerokim prześwicie i niskim przepływie (np. 17 psi, dysza 100 μm, 3 000 zdarzeń/s), aby zachować żywotność progenitorów neuronalnych. W celu izolacji komórek EGFP+ przeprowadzamy izolacje na urządzeniu BD Biosciences FACSAriaII, używając lasera 488 nm 20 mW do wzbudzenia reportera EGFP.
4. Jeśli próbki zawierają wysokie stężenia komórek, zaleca się dalsze rozcieńczenie zawiesiny komórkowej przy użyciu barwnika 7-AAD w stosunku 1:1000, aby uzyskać wyższą wydajność przechwytywania podczas sortowania.
5. Każdą probówkę z komórkami przechwyconymi w TRIzol-LS należy wymieszać na wortexie niezwłocznie po sortowaniu.

7. Reprezentatywne wyniki

Dysocjacja tkanek w celu przygotowania zawiesiny komórek do sortowania przepływowego wymaga precyzyjnego zrównoważenia odpowiedniego trawienia enzymatycznego i unikania nadmiernej dysocjacji, która może prowadzić do niskiej żywotności komórek. Przykład pożądanego poziomu dysocjacji tkanki przedstawiono na Rysunku 2. W tkance poddanej odpowiedniemu trawieniu, przed manualną tryturacją, fragmenty podsekcjonowanych organów są wciąż wyraźnie widoczne (Rysunek 2b, 2f). W tkankach traktowanych enzymatycznie przez zbyt długi czas lub przy zbyt wysokim stężeniu enzymu, w otrzymanej zawiesinie brak jest wszelkich pozostałych dużych fragmentów tkanki (Rysunek 2d, 2h).

Odpowiednia dysocjacja i filtrowanie ręczne pozwalają na uzyskanie profili sortowania w cytometrii przepływowej, które zazwyczaj wykazują ponad 90% żywotnych komórek i wysoki poziom ekspresji EGFP (Rycina 4). Populacje komórek uzyskane tą metodą cechują się dobrą żywotnością i mogą zostać wyizolowane do dalszej hodowli lub analizy ekspresji genów poprzez bramkowanie w celu przechwycenia neuronalnych progenitorów EGFP+.

Rysunek 1. Rozkład neuronalnych progenitorów TH-EGFP+ w płodowym LUT myszy. Cały układ moczowo-płciowy w 15,5 dpc widziany od strony brzusznej w oświetleniu w polu jasnym (a) w porównaniu z rozkładem komórek EGFP+ znakowanych przez ekspresję transgenu TH-EGFP zidentyfikowanych w oświetleniu fluorescencyjnym (b). Ekspresja TH-EGFP występuje w nadnerczach (a) oraz położonych pośrodkowo zwojach trzewnych (cg). Widok boczny (c) wypreparowanego pęcherza w 15,5 dpc wykazuje fluorescencję z ekspresji transgenu w zwojach miednicznych (pg), ścianie pęcherza (bla) i cewce moczowej (u). W widoku grzbietowym (d) komórki EGFP+ są widoczne w przedniej części grzbietowej cewki moczowej. Pozostałe oznaczenia: nerki (k), jądra (t), pęcherz (bla) i guzek płciowy (gt).

Rysunek 2. Obrazy w świetle przechodzącym płodowego LUT w 15 dpc (a) oraz jelita (e), odpowiednio obrazowane w połowie okresu inkubacji dysocjacyjnej, na koniec inkubacji dysocjacyjnej przed rozbiciem (b, f), po manualnym rozbiciu (c, g) oraz w próbce nadmiernie dysocjowanej (d, h).

Rysunek 3. Schemat ilustrujący kontrole kompensacji niezbędne do ustalenia rygorystycznych parametrów bramkowania FACS.

Rysunek 4. Reprezentatywny obraz profili sortowania przepływowego w 14,5 dpc (a) i 15,5 dpc (b). Populacja czarna składa się z pojedynczych komórek, określonych na podstawie rozproszenia światła przedniego i bocznego, które są martwe i znakowane fluorescencją 7-AAD. Populacja szara składa się z pojedynczych komórek, określonych na podstawie rozproszenia światła przedniego i bocznego, które nie przyjęły 7-AAD, a zatem są żywotne. Zielona wyselekcjonowana populacja jest wskazana obramowanym obszarem „GFP+” i składa się z pojedynczych komórek, które nie przyjęły 7-AAD (żywotne) i wykazują fluorescencję EGFP.

Dyskusja

Linie reporterowe myszy wykazujące ekspresję reporterów fluorescencyjnych stają się powszechnie dostępne dzięki licznym staraniom społeczności genetyki mysiej^1,8,9. W rezultacie przedstawiona tutaj metoda dysocjacji może być szeroko stosowana do izolacji konkretnych podtypów neuronów z tkanek płodowych lub dorosłych na podstawie wzorców ekspresji neuroprzekaźników lub receptorów. Choć zoptymalizowaliśmy tę metodę w oparciu o ekspresję fluorescencyjnego transgenu reporterowego, można ją również zastosować do pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Przechowywać w zamrożonych alikwotach po 1 ml
DNase I	Sigma	D-4527	Przechowywać w zamrożeniu w -20 °C, 5 mg/ml w 1xHBSS, (Stosowane w Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7,4	Gibco	70011-044	Dorowadzić do stężenia 1x wodą jakości tkankowej, następnie przefiltrować sterylnie
10X HBSS bez Ca lub Mg	Gibco	14185-052	Dorowadzić do stężenia 1x wodą jakości tkankowej, następnie przefiltrować sterylnie
Pożywka Leibovitz's L-15	Gibco	21083027
Penicylina / Streptomycyna 100X	Gibco	15140-133	Przechowywać w alikwotach w -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Przechowywać w alikwotach w -20 °C, 100 mg/ml w wodzie
Biowhittaker 1M HEPES w 0,85% NaCl	Lonza	17-737E
Membrana nylonowa NITEX 38 μm	Sefar America	3-38/22	Wyciąć kwadraty o boku ok. 3 cm. Sterylizować na noc pod działaniem promieni UV w komorze laminarnej
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
Probówki polistyrenowe 5 ml	Falcon	352058
Probówki stożkowe 15 ml	Corning	430790
Precyzyjna pęseta anatomiczna	Fine Science Instruments	11251-30	Pęseta Dumont#5, Dumoxel, standardowa końcówka 0,1x0,06 mm
Łyżeczka do sekcji	Fine Science Instruments	10370-18