Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Podsumowanie

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Streszczenie

Odkrycie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (zbiorczo nazywanych neuronalnymi komórkami prekursorowymi) (NPC) w mózgu dorosłych ssaków doprowadziło do szeregu badań mających na celu wykorzystanie multipotencjalnych i proliferacyjnych właściwości tych komórek do rozwoju strategii neuroregeneracyjnych. Kluczowym krokiem dla powodzenia takich strategii jest mobilizacja NPC w kierunku miejsca zmiany chorobowej po przeszczepie egzogennym lub w celu wzmocnienia odpowiedzi endogennych prekursorów, które znajdują się w regionie okołokomorowym OUN. W związku z tym konieczne jest zrozumienie mechanizmów, które promują, kierują i wzmacniają migrację NPC. Nasza praca koncentruje się na wykorzystaniu pól elektrycznych prądu stałego (dcEF) do promowania i kierowania migracją NPC - zjawiskiem znanym jako galwanotaksja. Endogenne fizjologiczne pola elektryczne działają jako krytyczne wskazówki dla migracji komórek podczas normalnego rozwoju i gojenia się ran. Farmakologiczne zaburzenie potencjału cewy transneuronalnej w zarodkach aksolotla powoduje poważne wady rozwojowe¹. W kontekście gojenia się ran szybkość naprawy uszkodzonej rogówki jest bezpośrednio skorelowana z wielkością potencjału nabłonkowego rany, który powstaje po urazie, jak wykazano przez farmakologiczne wzmocnienie lub zakłócenie tego dcEF^2-3. Wykazaliśmy, że dorosłe podwyściółkowe NPC ulegają szybkiej i ukierunkowanej migracji katodowej in vitro po wystawieniu na działanie zewnętrznego dcEF. W tym protokole opisujemy techniki naszego laboratorium do tworzenia prostego i skutecznego testu galwanotaksji do długoterminowej, wysokiej rozdzielczości obserwacji ukierunkowanej translokacji (migracji) ciała komórki na poziomie pojedynczej komórki. Test ten byłby odpowiedni do badania mechanizmów regulujących transdukcję dcEF w ruchliwość komórkową za pomocą myszy transgenicznych lub nokautujących, krótkiego interferującego RNA lub specyficznych agonistów/antagonistów receptorów.

Protokół

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Toronto zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (protokół nr 20009387). Poniższe metody powinny być wykonywane przy użyciu sterylnych narzędzi i technik, w razie potrzeby w okapie z przepływem laminarnym.

W poniższym tekście protokołu fraza "EFH-SFM" odnosi się do pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i heparyną. EFH-SFM jest używany podczas badania galwanotaksji niezróżnicowanych NPC, ponieważ te mitogeny utrzymują NPC w ich niezróżnicowanym stanie⁴. Podczas badania galwanotaksji NPC indukowanych do różnicowania się w dojrzałe typy komórek, "FBS-SFM" odnosi się do pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej 1% płodową surowicą bydlęcą. FBS sprzyja różnicowaniu NPC w dojrzałe fenotypy neuronalne⁵.

1. Izolacja i hodowla prekursorów neuronalnych (nie pokazane w filmie)

1. Znieczulić mysz CD1 (w wieku 6-8 tygodni) izofluoranem i poświęcić ją poprzez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Oblaj głowę 70% etanolem i odetnij głowę zwierzęciu ostrymi nożyczkami preparacyjnymi.
3. Trzymając głowę kleszczami chirurgicznymi, usuń skórę z powierzchni grzbietowej, aby odsłonić czaszkę.
4. Za pomocą skalpela i ostrza nr 11 naciąć czaszkę w zatoce czołowej wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej, a także wzdłuż szwu strzałkowego w kierunku ostroogonowym.
5. Oderwij kości ciemieniowe od głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy nr 7, uważając, aby nie przebić tkanki mózgowej.
6. Włóż cienką szpatułkę pod mózg, zaczynając od spodu móżdżku i przesuwając się w kierunku opuszki węchowej. Trzymając czaszkę na miejscu za pomocą kleszczy, delikatnie wyciągnij mózg z czaszki i natychmiast umieść go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (patrz przepisy poniżej).
7. Pod mikroskopem preparacyjnym, przy użyciu sterylnych nożyczek preparacyjnych i kleszczy, przecięto mózg na pół wzdłuż linii środkowej. Obróć każdą półkulę tak, aby przyśrodkowa (cięta) powierzchnia była skierowana do góry.
8. Wybierz półkulę i z powierzchnią przyśrodkową skierowaną do góry zlokalizuj śledzionę ciała modzelowatego (tylny obszar ciała modzelowatego).
9. Wykonaj nacięcie od powierzchni kory do śledziony ciała modzelowatego wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej.
10. Oderwij naciętą korę w kierunku opuszki węchowej, aby odsłonić przyśrodkowe i boczne ściany komory bocznej.
11. Obróć półkulę tak, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana do góry, i użyj zakrzywionych mikronożyczek, aby wyciąć i zebrać odsłonięte ściany przyśrodkowe i boczne, które zawierają obszar okołokomorowy, w którym znajdują się NPC⁶.
12. Powtórz kroki 1.8-1.11 dla drugiej półkuli.
13. Odpipetować wyizolowaną tkankę do 7 ml roztworu trypsyny (patrz przepis poniżej) w probówce o pojemności 15 ml i umieścić probówkę na kołysce w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 25 minut.
14. Odwirować probówkę z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 2 ml roztworu inhibitora trypsyny (patrz przepis poniżej).
15. Delikatnie rozcieraj tkankę pipetą Pasteura 30-50 razy z małym otworem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
16. Odwirować probówkę z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1-2 ml SFM (patrz przepis poniżej), rozcierając osad 3-5 razy.
17. Odwirować probówkę z prędkością 1 500 obr./min przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml SFM + EFH.
18. Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki w kolbie hodowlanej T25 o gęstości 10 komórek na μl w SFM + EFH.
19. Pozwól kulturze rosnąć bez przeszkód przez 7 dni, aby uzyskać swobodnie unoszące się pierwotne neurosfery składające się z NPC.

2. Przygotowanie komory galwanotaksji

1. Umieść 3 kwadratowe szkiełka nakrywkowe nr 1 (22 x 22 x 0,17 mm) w butelce z kwasem solnym 6N na noc.
2. Następnego dnia za pomocą noża do szkła z diamentową końcówką wytnij 6 prostokątnych pasków (22 x 5 x 0,17 mm) szkła z kwadratu nr 1 szkiełka nakrywkowego.
3. Przenieś kwadratowe i prostokątne szkiełka przemyte kwasem do okapu z przepływem laminarnym. Umyj prostokątne i kwadratowe paski najpierw 70% etanolem, a następnie autoklawowaną wodą z kultur tkankowych i pozostaw do wyschnięcia na chusteczce Kim (dla zwiększenia sterylności szkło można pozostawić do wyschnięcia na powietrzu).
4. Nałóż smar próżniowy na obwód jednej powierzchni kwadratowych szkiełek podstawowych i przymocuj je do podstawy plastikowych szalek Petriego o średnicy 60 mm.
5. Nałóż smar próżniowy wzdłuż długiej osi jednej powierzchni prostokątnych pasków szklanych i uszczelnij je do przeciwległych krawędzi kwadratowych szkiełek szklanych (tak, aby były równoległe do siebie) w celu utworzenia centralnego koryta.
6. Sterylizuj komory promieniami UV przez co najmniej 15 minut w okapie z przepływem laminarnym.
7. Pobrać pipetę 250-300 μl poli-L-lizyny na centralne koryto komór i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
8. Na około 15 minut przed zakończeniem okresu inkubacji przygotować roztwór Matrigel (patrz przepis poniżej).
9. Odessać poli-L-lizynę, przemyć rynny centralne 1 ml wody z autoklawizu i odpipetować 250-300 μl roztworu Matrigel na rynny centralne.
10. Inkubować komory w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
11. Odessać roztwór Matrigelu i delikatnie przemyć środkowe koryta 1-2 ml SFM.
12. Pobrać pipetę 100 μl EFH-SFM lub FBS-SFM na rynny centralne i przenieść komory galwanotaksji na stolik mikroskopu liczącego.
13. Odpipetować 3-4 ml kultury zawierającej neurosferę na szalkę Petriego o średnicy 60 mm i przenieść szalkę Petriego na etap mikroskopu liczącego.
14. Przy ognisku widzenia 5x użyj pipety P10, aby przenieść 5-8 całych neurosfer (do czterech na raz) na centralne koryto każdej komory galwanotaksji bez ich dysocjacji i ostrożnie rozprowadź neurosfery wokół centralnej rynny, nie naruszając substratu Matrigel.
15. Dodaj dodatkowe 150-200 μl EFH-SFM lub FBS-SFM na środkowe rynny.
16. Przenieś komory galwanotaksji do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO₂, w 100% nawilżonego na 17-20 godzin (w przypadku analizy niezróżnicowanych NPC), aby umożliwić neurosferom przyleganie do substratu Matrigel i dysocjację na pojedyncze komórki, jak pokazano na rysunku 1. W przypadku analizy zróżnicowanych NPC okres inkubacji należy wydłużyć do 69-72 godzin, aby umożliwić różnicowanie komórek.

3. Obrazowanie poklatkowe na żywo komórek

1. Pozwól, aby system obrazowania żywych komórek osiągnął równowagę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zapisu poklatkowego.
2. Wytnij dwa 12 cm kawałki srebrnego drutu o średnicy 1 mm, zwiń je z jednego końca i umieść w wybielaczu Clorox na 20 minut, aby utworzyć elektrody Ag/AgCl.
3. Przenieś komory galwanotaksji na stolik mikroskopu liczącego i wybierz, która komora będzie używana do analizy migracji obrazowania żywych komórek w oparciu o następujące kryteria: i) neurosfery powinny być prawie całkowicie zdysocjowane na pojedyncze komórki oraz ii) komórki powinny mieć okrągłe morfologie z niewielkimi lub żadnymi procesami wystającymi z ciał komórkowych.
4. Przenieś wybraną komorę galwanotaksji do okapu z przepływem laminarnym wraz z oddzielnym szkiełkiem nakrywkowym nr 1 i smarem próżniowym.
5. Najpierw umyj szkiełko nakrywkowe 70% etanolem, a następnie wodą w autoklawie i nałóż pasek smaru próżniowego na dwie równoległe krawędzie szkiełka nakrywkowego.
6. Zassać pożywkę hodowlaną z centralnej rynny komory, a następnie szybko umieścić szkiełko nakrywkowe (stroną ze smarem skierowaną w dół) na komorze tak, aby paski tłuszczu spoczywały na dwóch równoległych prostokątnych paskach szkła, skutecznie tworząc dach komory.
7. Odpipetować 100 μl świeżego EFH-SFM lub FBS-SFM do koryta centralnego za pomocą działania kapilarycznego.
8. Użyj smaru próżniowego, aby utworzyć obramowania dla kałuż pożywek hodowlanych na każdym końcu środkowego koryta, jak pokazano na rysunku 2.
9. Wytnij dwa 15-centymetrowe kawałki rurki PVC i użyj strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18, aby ostrożnie wstrzyknąć roztwór agarozy do rurki, upewniając się, że w probówkach nie tworzą się pęcherzyki, i pozwól żelowi zestalić się przez 5 minut.
10. Przenieś komorę galwanotaksji do systemu obrazowania żywych komórek wraz z probówkami z żelem agarozowym, elektrodami Ag/AgCl i parą pustych 60-milimetrowych szalek Petriego, które będą używane jako zbiorniki pożywek hodowlanych i będą zawierać elektrody Ag/AgCl. Pozostaw komorę galwanotaksji na odpoczynek w środowisku o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 20-30 minut.
11. W tym czasie przygotuj pokrywki 2 pustych szalek Petriego oraz pokrywę szalki Petriego w komorze galwanotaksji, wiercąc w nich otwory za pomocą narzędzia Dremel lub podobnego narzędzia, jak pokazano na rysunku 3.
12. Odpipetować 1-1,5 ml EFH-SFM lub FBS-SFM po obu stronach rynny środkowej i 7-8 ml SFM do każdej pustej szalki Petriego. Umieścić po jednej szalce Petriego z każdej strony centralnego koryta komory galwanotaksji i umieścić jedną elektrodę Ag/AgCl w każdej szalce. Wypełnij lukę między komorą galwanotaksji a szalkami Petriego, aby ustanowić ciągłość elektryczną z mostkami żelu agarozowego, jak pokazano na rysunku 4.
13. Podłącz elektrody Ag/AgCl do zewnętrznego źródła zasilania, z amperomierzem połączonym szeregowo do pomiaru prądu elektrycznego i włącz zasilanie. Użyj woltomierza, aby zmierzyć natężenie pola elektrycznego bezpośrednio w poprzek centralnej rynny i wyreguluj moc wyjściową zasilacza, aż do osiągnięcia pożądanego natężenia pola elektrycznego (testy przeprowadzone w tym laboratorium wykorzystują siłę dcEF 250 mV/mm przy prądzie elektrycznym od 1 do 1,5 mA).
14. Zainicjuj moduł poklatkowy w systemie obrazowania żywych komórek i pozwól eksperymentowi działać przez żądany czas. Po zakończeniu testu utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie do standardowej analizy barwienia immunologicznego.

Wyniki

Analiza kinematyczna ujawnia, że w obecności 250 mV/mm dcEF, niezróżnicowane NPC wykazują wysoce ukierunkowaną i szybką galwanotaksję w kierunku katody (Rysunek 5A, Film 1). W przypadku braku dcEF obserwuje się losowy ruch komórek (ryc. 5B, film 2). Przy takim natężeniu pola > 98% niezróżnicowanych NPC migruje przez całe 6-8 godzin, w których są obrazowane, a ponieważ martwe komórki nie migrują, sugeruje to, że pozostają żywotne w tym okresie przy braku lub obecności dcEF.

Dyskusja

Protokół ten został zaadaptowany z dobrze ugruntowanych metod z poprzednich badań^7-9. Komory galwanotaktyczne mogą być konstruowane przy użyciu wielu różnych technik, w tym budowy oddzielnej szklanej studzienki do zatrzymywania wysiewu komórek lub przy użyciu ablacji laserowej CO₂ do mikrowytwarzania centralnego koryta^10,11. Niektóre techniki mogą być bardziej pracochłonne lub kosztowne niż inne. Opisaliśmy prosty i opłacalny test do budowy komory galwanotaksji NPC przy użyciu materiałów ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
izolacja komórek prekursorowych neuronów
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g rozpuszczona w 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g rozpuszczona w 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g rozpuszczona w 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1,302 g rozpuszczony w 100 ml dH2O
0,5 M Glukoza	Sigma	G6152	9,01 g rozpuszczony w 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1,59 g rozpuszczony w 100 ml dH2O
Penicylina-streptomycyna	Gibco	15070
Trypsyna trzustki bydlęcej	Sigma	T1005
Hialuronidaza jąder owiec	Sigma	H6254
Kwas kynureninowy	Sigma	K3375
Inhibitor trypsyny ovomukoid	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glukoza	Sigma	G6152
7,5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23,83 g rozpuszczony w 100 ml dH2O
L-glutamina	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Rozpuścić w 1 ml mieszanki hormonów i poddzielić na 20 μ l jednostek.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Rozpuścić w 0,5 ml mieszaniny hormonów i podwielokrotności do 20 μm; l jednostek.
Heparyna	Sigma	H3149
Apo-transferyna	R& D Systems	3188-AT	0,1 g rozpuszczony w 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Rozpuścić 9,61 mg w roztworze Apo-transferyny
Insulina	Sigma	I5500	Rozpuścić 25 mg w 0,5 ml 0,1N HCl i dodać do 3,5 ml dH20
Selen	Sigma	S9133
Progesteron	Sigma	P6149
Standardowe narzędzia do preparacji	Narzędzia do nauki precyzyjnej Mikroskop
preparacyjny	Zeiss	Stemi 2000
Przygotowanie komory galwanotaksji
Kwadratowe szkiełka osłonowe	VWR	16004
6N Kwas solny	VWR	BDH3204-1
Smar wysokopróżniowy	Dow Corning
60 mm szalki Petriego	Fisher Scientific	0875713A
Poli-L-lizyna	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Rozmrożenie i podwielokrotnienie na 150 μ l jednostki
FBS	Invitrogen	10082139	Używaj tylko w przypadku indukowania różnicowania NPC, w przeciwnym razie użyj pożywki hodowlanej SFM + EFH, jak wskazano powyżej
Mikroskop zliczający	Olympus	CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Inaktywowane termicznie rurki PVC FBS	Sigma	16140071
	Fisher Scientific 80000006		3/32 "ID x 5/32" OD
Wybielacz	Clorox
10 cc	Igła BD	309604
18 mm
Dremel	Dremel	Model 750
Mikroskop odwrócony wyposażony w nawilżaną, inkubowaną komorę	Zeiss	Axiovert-200M
Recipes < td>6,2 ml Item Volume 2M NaCl 1M KCl 0,5 ml 1M MgCl2 0,32 ml 155mM NaHCO3 16,9 ml 1M Glukoza 1 ml 108 mM CaCl2 0,09256 ml Penicylina-streptomycyna 1 ml Woda autoklawowana 74 ml Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy < td>Pozycja Objętość lub masa Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy 30 ml Trzustka bydlęca trypsyna 40 mg Jądra owiec hialuronidaza 22,8 mg Kwas kynureninowy 5 mg Roztwór trypsyny
Item	Objętość lub masa
SFM	15 ml
Inhibitor trypsyny jajomukoid	10 mg

Item	Volume
Woda autoklawowana	37 ml
10X DMEM/F12	10 ml
30% Glukoza	2 ml
7,5% NaHCO3	1,5 ml
1M HEPES	0,5 ml
Transferyna, roztwór putrescyny	4 ml
25 mg roztworu insuliny	4 ml
Selen	100 μ l
Progesteron	100 μ l

Item	Objętość
Woda autoklawowana	37.5 ml
10X DMEM/F12 (3:1)	5 ml
30% Glukoza	1 ml
7,5% NaHCO3	0,75 ml
1M HEPES	0,25 ml
Mieszanka hormonalna	5 ml
L-glutamina	0,5 ml
penicylina-streptomycyna	0,5 ml

Item	Volume
Matrigel	150 μ l
SFM	3,6 ml