Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Podsumowanie

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca²⁺ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca²⁺.

Streszczenie

Mimo ogromnego wzrostu naszej wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw kodowania informacji w mózgu, wciąż pozostaje centralne pytanie dotyczące precyzyjnych etapów molekularnych, a także aktywności specyficznych neuronów w wielofunkcyjnych jądrach obszarów mózgu, takich jak podwzgórze. Problem ten obejmuje identyfikację komponentów molekularnych zaangażowanych w regulację różnych kaskad transdukcji sygnałów neurohormonalnych. Wzrosty wewnątrzkomórkowego poziomu Ca²⁺ odgrywają istotną rolę w regulowaniu wrażliwości neuronów, zarówno na poziomie transdukcji sygnału, jak i w miejscach synaptycznych.

Powstały nowe narzędzia pomagające w identyfikacji neuronów w niezliczonej liczbie komórek mózgowych poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą konkretnego promotora. Aby monitorować odpowiedzi Ca²⁺ indukowane bodźcem w neuronach znakowanych GFP, zarówno w wymiarze przestrzennym, jak i czasowym, konieczne jest zastosowanie wskaźnika Ca²⁺ o fluorescencji innej niż zielona. Ponadto mikroskopia konfokalna jest preferowaną metodą obrazowania pojedynczych neuronów w skrawkach tkanki ze względu na możliwość wizualizacji neuronów w odrębnych płaszczyznach głębokości wewnątrz tkanki oraz ograniczanie fluorescencji poza ogniskową. Ratiometryczny wskaźnik Ca²⁺ fura-2 był stosowany w połączeniu z neuronami znakowanymi GFP¹. Jednak barwnik ten jest wzbudzany światłem ultrafioletowym (UV). Koszt lasera oraz ograniczona głębokość penetracji optycznej światła UV utrudniały jego stosowanie w wielu laboratoriach. Co więcej, fluorescencja GFP może zakłócać sygnały fura-2². Dlatego zdecydowaliśmy się zastosować czerwony fluorescencyjny wskaźnik Ca²⁺. Duży przesunięcie Stokesa w przypadku fura-red umożliwia wielokolorową analizę czerwonej fluorescencji w połączeniu z GFP przy użyciu pojedynczej długości fali wzbudzenia. Wcześniej uzyskaliśmy dobre wyniki, stosując fura-red w połączeniu z neuronami węchowymi znakowanymi GFP³. Protokoły dla skrawków tkanki węchowej wydawały się działać równie dobrze w neuronach podwzgórza⁴. Obrazowanie Ca²⁺ oparte na fura-red zostało również z sukcesem połączone z komórkami β trzustki znakowanymi GFP oraz receptorami znakowanymi GFP eksprymowanymi w komórkach HEK^5,6. Specyficzną cechą fura-red jest to, że intensywność jego fluorescencji przy 650 nm maleje po związaniu wapnia przez wskaźnik⁷. W związku z tym fluorescencja neuronów w stanie spoczynku, z niskim stężeniem Ca²⁺, ma stosunkowo wysoką intensywność. Należy zauważyć, że istnieją lub są obecnie opracowywane inne czerwone barwniki wskaźnikowe Ca²⁺, które mogą dawać lepsze lub ulepszone wyniki w różnych neuronach i obszarach mózgu.

Protokół

1. Przygotowanie roztworu i żelu agarozowego

1. Przygotować roztwór zewnątrzkomórkowy zgodnie z tabelą, używając wody podwójnie destylowanej. Po 10 min napowietrzania karbogenem (95% O₂ / 5% CO₂) pH wyniesie ~7.3, a osmolarność 300 mOsm⁸. W przypadku potrzeby uzyskania wyższej osmolarności, można ją skorygować poprzez dodanie większej ilości glukozy (1 mM odpowiada 1 mOsm). Roztwór należy przefiltrować dwukrotnie przez filtr membranowy 0.2 μm w celu usunięcia cząsteczek kurzu i ewentualnych zanieczyszczeń bakteryjnych.

Nazwa odczynnika	Skrót	Masa cząsteczkowa	Stęż.	Firma	Nr kat.°
Chlorek sodu	NaCl	58,44 g/mol	120 mM	VWR	27810
Wodorowęglan sodu	NaHCO33	84,01 g/mol	25 mM	Merck	106329
Chlorek potasu	KCl	74,55 g/mol	5 mM	Merck	104936
BES*	C6H15Brak danych wejściowych do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego.5S	213,25 g/mol	5 mM	Sigma	14853
Siarczan magnezu, bezwodny	MgSO44	120,37 g/mol	1 mM	Sigma	M7506
Dwuwodny chlorek wapnia	CaCl*2H2O2O	147,02 g/mol	1 mM	Merck	102382
D(+)-glukoza monohydrat	C6H12O8*H2O	198,17 g/mol	10 mM	Merck	108342

* Kwas N,N-bis(2-hydroksyetylo)-2-aminoetanosulfonowy

2. Roztwór przechowuje się w temperaturze 4 °C, jednak przed użyciem należy go napowietrzać karbogenem (95% O₂ / 5% CO₂) przez 10 min.
3. W tym czasie należy przygotować również bloki żelu agarowego o objętości 1 cm³ w celu stabilizacji mózgu podczas procedury cięcia (patrz krok 3). Najpierw rozpuścić 4% (w/v) agar (Sigma) w wodzie dwukrotnie destylowanej, podgrzewając roztwór do temperatury około 60 °C. Podgrzany roztwór rozpuszczonego agaru wlewa się do kwadratowej szalki Petriego do wysokości 1 cm. Po ochłodzeniu i stwardnieniu żel agarowy 4% tnie się na bloki o objętości 1 cm³. Bloki te można przechowywać do 4 tygodni w temperaturze 4 °C.

2. Disekcja mózgu myszy

Należy upewnić się, że wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez komisje ds. dobrostanu zwierząt w odpowiednich instytucjach.

1. Przed uśmierceniem zwierzęcia należy upewnić się, że bloki żelu agarowego są gotowe do użycia.
2. Zanurzyć mysz w znieczuleniu izofluranem (1-4% izofluranu w tlenie przy użyciu precyzyjnego waporyzatora przez około 1 min). Ważne jest zapobieganie hipoksji, a tym samym uszkodzeniom neuronów. Wadą izofluranu są koszty i logistyka związane z użyciem precyzyjnych waporyzatorów. Alternatywą może być śmiertelna dawka w systemie otwartym, ponieważ mysz i tak zostanie uśmiercona. W takim przypadku poważną kwestią jest bezpieczeństwo i higiena pracy. Izofluran musi być bezpośrednio odprowadzany z pomieszczenia. Dlatego podanie nadmiarowej dawki w systemie otwartym powinno odbywać się w dygestorium chemicznym.
3. Uśmiercić mysz poprzez dekapitację po monitorowaniu głębokości znieczulenia poprzez sprawdzenie odruchu stopy tylnej. Ten odruch uciskania łapy lub palca wykonuje się poprzez mocne ściśnięcie łapy lub palca między palcami, aby wywołać reakcję wycofania u zwierzęcia. Zwierzę wykazujące odruch nie znajduje się na chirurgicznym poziomie znieczulenia i zdecydowanie nie jest w stanie, w której można przeprowadzić eutanazję.
4. Po dekapitacji naciąć skórę głowy jednokrawędziową żyletką centralnie w kierunku strzałkowym, od kości czołowej do występu zewnętrznego kości potylicznej. Odsunąć dwie części skóry, najpierw od przyśrodkowego końca ogonowego w kierunku rostralno-boczny, a następnie w dół w kierunku brzusznym (Rycina 1A-C).
5. Wykonać dwa nacięcia boczne i jedno rostralne w otworze wielkim (foramen magnum) za pomocą małych nożyczek sprężynowych (kierunki cięcia wskazują czarne przerywane strzałki na Rycynie 1C). Ostrożnie oddzielić czaszkę od strony przyśrodkowo-ogonowej do boczno-rostralnej za pomocą pęsety stępionej (patrz szerokie szare strzałki na Rycynie 1C). U starszych zwierząt pomocne i często niezbędne jest wykonanie małego nacięcia w szwie strzałkowym, aby uniknąć uszkodzenia warstw kory mózgowej.
6. W tym momencie kości potyliczna, międzyścienna i ciemieniowa powinny być oddzielone. Jeśli opona twarda jest nadal obecna, należy ją ostrożnie usunąć pęsetą, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu w następnym kroku.
7. Usunąć kość łuskową, przedni otwór sitowy oraz otwór czołowy (Rycina 1D).
8. Mózg można teraz łatwo usunąć za pomocą odwróconej mikroszpatułki w kształcie łyżeczki, przecinając nerwy czaszkowe (Rycina 1E).

3. Wycinanie coronalnych przekrojów podwzgórza mózgu myszy

1. Umieść mózg stroną brzuszną na powierzchni odpornej na przecięcia i usuń móżdżek za pomocą jednostronnej żyletki (Rycina 2A). Ta prosta powierzchnia cięcia będzie podstawą do zamocowania mózgu na płytce, co umożliwi wycinanie koronalnych przekrojów mózgu.
2. Przyklej mózg przeciętą sekcją do płytki podstawowej mikrotomu (Zeiss, Hyrax V50), używając niewielkiej ilości szybko utwardzalnego, wysokowydajnego kleju cyjanoakrylowego (Loctite 406; Rycina 1A). Dodatkowo przyklej blok żelu agarowego o objętości 1 cm³ (patrz 1.5) po stronie brzusznej mózgu (patrz 'v' na Rycynie 2B) do płytki podstawowej mikrotomu (Zeiss, Hyrax V50), aby podeprzeć i ustabilizować mózg podczas krojenia. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużo kleju, aby uniknąć jego przedostania się między mózgiem a blokiem żelu, co mogłoby utrudnić usuwanie plastrów tkanki po cięciu. Blok żelowy powinien znajdować się po przeciwnej stronie ostrza tnącego mikrotomu (Rycina 2B).
3. Po kilku sekundach, gdy spoiwo wyschnie, umieść płytkę w kąpieli mikrotomu wypełnionej schłodzonym do 6 °C, napowietrzanym (95% O₂ / 5% CO₂) roztworem zewnątrzkomórkowym (patrz 1.1).
4. Zastosuj odpowiednio niską prędkość krojenia i wycinaj plastry o grubości 300 μm. W przypadku naszego mikrotomu stosujemy częstotliwość 60 Hz, amplitudę 0,8 mm i prędkość 0,8 mm/s (Rycina 2C). Koronalne plastry mózgu zbiera się bezpośrednio po każdym cięciu lub można je pozostawić w kąpieli do czasu pocięcia całego mózgu. Plastry koronalne mózgu ostrożnie przenosi się do zlewki z zimnym, napowietrzanym roztworem zewnątrzkomórkowym. Do przenoszenia zaprojektowano różne narzędzia (np. przycięte szerokie plastikowe lub szklane pipety Pasteura lub szerokie szpatułki łyżeczkowe). Wybór narzędzia zależy od preferencji eksperymentatora. Co najważniejsze, z plastrami należy obchodzić się odpowiednio, aby zminimalizować uszkodzenia.
5. Jeśli mikrotom można zaprogramować do automatycznego krojenia plastrów, w tym momencie można rozpocząć przygotowywanie roztworu do ładowania barwnika wskaźnika Ca²⁺. W przeciwnym razie zaleca się, aby przygotowanie tego roztworu odbyło się przed zakończeniem krojenia mózgu, w celu zminimalizowania opóźnień w pomiarach odpowiedzi Ca²⁺ w neuronach, a konkretnie przed rozpoczęciem kroku 2.

4. Przygotowanie roztworu ładującego barwnik wskaźnikowy Ca²⁺

Krytycznym etapem podczas ładowania neuronów często pozostaje kondycja komórek, która zależy od stopnia uszkodzeń wywołanych procedurą sekcji oraz od szybkości jej przeprowadzenia. Kolejnym niezbędnym krokiem wydaje się być zastosowanie świeżego roztworu Pluronic F-127 (patrz 4.1). Zaleca się przygotowywanie tego roztworu w laboratorium i rezygnację z gotowych produktów dostarczanych przez producentów. W zależności od temperatury, wilgotności oraz czasu przechowywania roztworu Pluronic F-127, odnotowaliśmy degradację neuronów węchowych i mózgowych podczas procedury ładowania Ca²⁺.

1. Przygotować 20% (w/v) roztwór Pluronic F-127 (Sigma) w dimetylosulfoksydzie (DMSO), dodając proszek Pluronic F-127 do roztworu DMSO. Roztwór ten należy poddać bezpośrednio sonikacji bez wcześniejszego mieszania w wirówce (vortex). Pluronic F-127 rozpuści się w ciągu 2 min sonikacji. Roztwory Pluronic F-127 w ilości 100 μl przygotowuje się świeżo w każdym tygodniu.
2. Pobrać jedną probówkę zawierającą 50 μg przepuszczalnego przez błony komórkowe barwnika fura-red/AM (Invitrogen; AM, ester acetoksymetylowy) i dodać 5 μl 20% roztworu Pluronic F-127. Wymieszać roztwór za pomocą końcówki pipety.
3. Do mieszaniny dodać 45 μl roztworu zewnątrzkomórkowego (patrz 1.1) i krótko wymieszać w wirówce.
4. Dodać kolejne 325 μl roztworu zewnątrzkomórkowego i sonikować probówkę przez 3 min.
5. Po sonikacji dodać 1,156 ml natlenionego (95% O₂ / 5% CO₂) roztworu zewnątrzkomórkowego, aby otrzymać końcowy roztwór do ładowania barwnikiem wskaźnikowym Ca²⁺ (30 μM fura-red/AM, 0,33% DMSO i 0,065% Pluronic F-127). Probówkę przechowywać w ciemnym miejscu do momentu użycia (patrz 4.8).
6. Przenieść koronalne skrawki mózgu do 6-dołkowej płytki hodowlanej (BD Falcon) wypełnionej natlenionym (95% O₂ / 5% CO₂) roztworem zewnątrzkomórkowym (do sześciu skrawków na dołek).
7. Odssać natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy z dołków płytki, uważając, aby nie uszkodzić skrawków mózgu.
8. Do każdego dołka nanieść bezpośrednio pipetą 750 μl roztworu do ładowania barwnikiem wskaźnikowym Ca²⁺. Skrawki mózgu powinny zostać przykryte roztworem zawierającym fura-red/AM (ładowanie przez imersję).
9. Inkubować skrawki w inkubatorze do hodowli komórkowych z kontrolą O₂/CO₂ (O₂: 23,5%; CO₂: 5%) przez 45 do 60 min w temperaturze 37 °C.
10. Po zakończeniu czasu inkubacji zastąpić roztwór do ładowania barwnikiem wskaźnikowym Ca²⁺ świeżym natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby zapobiec przeładowaniu komórek barwnikiem fura-red oraz uniknąć subtelnego wpływu na pomiar Ca²⁺ wynikającego z działania chelatującego barwnika. Następnie skrawki przechowuje się w inkubatorze O₂/CO₂ (ustawienia jak w poprzednim punkcie) do momentu użycia; pozostają one żywotne przez maksymalnie 3-6 godz.

5. Mikroskopia i analiza

W niniejszym protokole w skrawkach mózgu będzie jednocześnie mierzone natężenie fluorescencji GFP, służącego do identyfikacji komórki docelowej, oraz barwnika wskaźnikowego Ca²⁺. W związku z tym mikroskop konfokalny powinien być wyposażony w odpowiedni laser, filtry oraz dwie fotopowielacze do zbierania dwóch sygnałów emisji. GFP oraz zmianę natężenia fluorescencji fura-red można mierzyć przy użyciu pojedynczej długości fali wzbudzenia 488 nm. Fluorescencję emisyjną z fluoroforów można zbierać za pomocą filtra 522/DF35 nm dla GFP oraz filtra długoprzepustowego dla długości fal powyżej 600 nm dla fura-red.

1. Aby rozpocząć monitorowanie zmian w sygnale fluorescencji wywołanych bodźcem, które stanowią miarę wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺, jeden z załadowanych fura-red skrawków mózgu przenosi się do komory rejestracyjnej (t.j. Warner Instruments RC-27 Open Bath Chamber), którą można zamontować w układzie mikroskopu konfokalnego (Rycina 3A,B).
2. Należy unieruchomić skrawek mózgu za pomocą harfy (Rycina 3C), aby zapobiec jego przemieszczaniu się pod wpływem prędkości perfuzji roztworu w kąpieli (natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy; patrz krok 1.1). Harfa (uchwyt do skrawków) składa się z równoległego układu nylonowych nici (oddzielonych od siebie o ~1 mm) rozpiętych na srebrnej lub platynowej ramie w kształcie litery U. Temperatura roztworu kąpieli na tym etapie powinna wynosić co najmniej temperaturę pokojową. W przypadku konieczności zastosowania wyższych temperatur należy zachować odpowiednią ostrożność, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na soczewkach mikroskopu oraz przesunięciu płaszczyzny ogniskowania z powodu rozszerzalności cieplnej elementów mikroskopu.
3. Skrawek należy perfundować przez 10 min natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby usunąć nadmiar barwnika wskaźnika Ca²⁺ z przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Prędkość przepływu perfuzji należy ustawić na ~100 μl/s (wskaźówki dotyczące odpowiedniego systemu perfuzji znajdują się w ⁹).
4. Należy obejrzeć skrawek pod mikroskopem przy małym powiększeniu, odnotować jego orientację w dokumentacji oraz zlokalizować w skrawku obszar zainteresowania, w naszym przypadku obszar podwzgórza w mózgu.
5. Należy zmienić powiększenie na duże i odnaleźć w skrawku interesującą komórkę, zbierając obrazy GFP i jednocześnie sprawdzając intensywność fluorescencji sygnału fura-red (Rycina 4A-C). Komórki znajdujące się blisko powierzchni mogą być uszkodzone lub martwe. Dlatego do obrazowania należy wybierać komórki położone na głębokości większej niż 10 μm. Byliśmy w stanie wiarygodnie mierzyć komórki do głębokości 40-50 μm, powyżej której natężenie sygnału zaczęło spadać. Należy pamiętać, że sygnał fura-red z komórek w stanie spoczynku, przy niskim stężeniu Ca²⁺, wykazuje relatywnie wysoką intensywność fluorescencji. Wysoka intensywność fluorescencji nie jest w tym przypadku oznaką martwych komórek. Sygnał GFP może być wykorzystany do wykrywania ewentualnego dryfu lub przemieszczania się skrawka tkanki lub jako wskaźnik zmian wewnątrzkomórkowego pH¹⁰.
6. Moc lasera należy ustawić na wartość, która umożliwia pomiary zmian intensywności fluorescencji fura-red i zapobiega blaknięciu obu fluoroforów. Należy zatem zacząć od najniższej mocy lasera i dostosować ją w celu uzyskania wystarczającego stosunku sygnału do szumu poprzez zmianę poziomu czerni (offset), apertury detektora, wzmocnienia (gain) oraz filtrów neutralnych gęstości lasera. Poza mocą lasera, analogiczne czynności należy przeprowadzić dla sygnału GFP.
7. Należy rozpocząć akwizycję obrazów z częstotliwością od 0,5 do 2 Hz w celu zebrania sygnałów fura-red i GFP. Szybkość akwizycji powinna być zoptymalizowana pod kątem oczekiwanej dynamiki sygnału Ca²⁺. Napięciowo zależne piki Ca²⁺ mogą powodować szybsze i krótsze przejścia niż aktywacja niektórych kaskad transdukcji sygnału wymagających aktywacji różnych wtórnych przekaźników. Czas trwania akwizycji obrazów powinien być odpowiedni do celu eksperymentu. Sygnał GFP w czasie pomoże określić, czy nastąpiło jakiekolwiek przemieszczenie skrawka mózgu.
8. Podczas akwizycji i eksperymentu wszystkie ustawienia głowicy skanującej muszą pozostać stałe, aby zarejestrować wiarygodne wyniki, które można porównać.
9. Zmiany fluorescencji w czasie można analizować za pomocą różnych programów matematycznych, t.j. ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/), Igor Pro (Wavemetrics) lub MatLab (The MathWorks). Poprzez obrysowanie somatów neuronu znakowanego GFP w celu wskazania obszaru zainteresowania (ROI), ten sam obszar można analizować pod kątem zmian Ca²⁺ przy użyciu sygnału fluorescencji fura-red w czasie.

Sygnały Ca²⁺ mogą być przedstawione w dowolnych jednostkach fluorescencji lub jako wartości (ΔF/F) względnej zmiany intensywności fluorescencji (ΔF) znormalizowanej do fluorescencji bazowej (F). W przypadku użycia fura-red jako barwnika wskaźnikowego Ca²⁺, procedura ta prowadzi do ujemnego odchylenia przy wzroście wewnątrzkomórkowego stężenia Ca²⁺. Aby ułatwić interpretację wyników, zalecamy pomnożenie wartości ΔF/F przez -1, aby uzyskać dodatnie sygnały fluorescencji obrazujące wzrost poziomu Ca²⁺ (Rysunek 4C).

W celu porównania wyników między neuronami zazwyczaj analizuje się amplitudę i częstotliwość sygnałów Ca²⁺. Jednak niektóre sygnały Ca²⁺ nie występują w regularnych odstępach czasu ani nie mają porównywalnych amplitud. Niektóre sygnały mogą być silnie wypadkowe procesów stochastycznych zachodzących wewnątrz komórki. Z tego powodu, aby ilościowo określić całkowitą zmianę poziomu Ca²⁺ w danej komórce i umożliwić porównanie odpowiedzi Ca²⁺ między neuronami z różnych obszarów mózgu, bardziej odpowiednia jest analiza pola pod krzywą (AUC). Pomiar ten dla ilości Ca²⁺ obejmuje wszelkie początkowe przejściowe wzrosty Ca²⁺, drugie fazy oraz trwałe podwyższone odpowiedzi Ca²⁺ i oscylacje. W takim przypadku należy zadbać o analizę tego samego przedziału czasowego, aby umożliwić porównanie między neuronami.

6. Reprezentatywne wyniki

Aby rozpocząć charakterystykę neuronów podwzgórza wykazujących ekspresję receptora hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRHR), wykorzystaliśmy myszy transgeniczne, które wykazują ekspresję GFP po wycięciu zależnym od Cre w neuronach wykazujących ekspresję GnRHR^4,11. Fluorescencyjne neurony GFP zidentyfikowano w różnych obszarach mózgu, w tym w podwzgórzu. Aby zbadać właściwości fizjologiczne tych neuronów GnRHR, w pierwszej kolejności zarejestrowaliśmy sygnały Ca²⁺ w skrawkach podwzgórza przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Najpierw uzyskaliśmy koronalne skrawki mózgu tych myszy zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Rysunek 1 ilustruje niezbędne narzędzia, materiały i kroki niezbędne do wycięcia mózgu myszy. Koronalne skrawki podwzgórza zostały pocięte (Rysunek 2), a następnie załadowane zgodnie z krokami opisanymi w punkcie 4 protokołu. Pojedyncze skrawki mózgu z odpowiedniego obszaru umieszcza się w komorze rejestracyjnej, unieruchamia za pomocą harfy (Rysunek 3), a następnie obrazuje przy użyciu mikroskopu konfokalnego (patrz kroki 5.1-5.9). Rysunek 4 przedstawia przykład dwóch pojedynczych koronalnych skrawków mózgu z identyfikacją pojedynczych ciał komórek GnRHR-τGFP, fluorescencję spoczynkową po załadowaniu skrawka mózgu fura-red/AM oraz połączony obraz konfokalny wskazujący, że neuron GFP pobrał wystarczającą ilość fura-red, aby umożliwić badanie indukowanych bodźcem sygnałów Ca²⁺ w tych komórkach. Korzystając z naszego protokołu, w pierwszej kolejności przetestowaliśmy, czy neurony GnRHR wykorzystują podobne sygnały Ca²⁺ do detekcji bodźców w różnych obszarach podwzgórza w odpowiedzi na bezpośrednią aktywację GnRH (Rysunek 4E). Sygnały te różniły się jednak kształtem fali w zależności od siły bodźca i obszaru mózgu⁴. Aby ilościowo określić zmianę dynamiki odpowiedzi Ca²⁺, można obliczyć pole pod krzywą (AUC) jako miarę wzrostu wewnątrzkomórkowego Ca²⁺ (Rysunek 4E)⁴. Obecnie prowadzone są badania mające na celu zbadanie podstaw molekularnych fal i oscylacji Ca²⁺, ich zależności od płci i statusu hormonalnego zwierzęcia oraz tego, czy mogą być one modulowane przez inne naturalne bodźce.

Rysunek 1. Narzędzia, materiały i etapy wycinania mózgu myszy. A. Narzędzia i materiały używane do sekcji mózgu: 1, superglue Loctite 406; 2, szpatułka z mikrolyżeczką; 3, jednostronne żyletka; 4, małe i średnie nożyczki sprężynowe; 5, pęseta tępą; 6, nożyczki; 7, szalka Petri z blokiem żelu agarowego; 8, płytka bazowa do montażu mózgu w mikrotomie. B-F. Zdjęcia niektórych etapów opisanych w punkcie 2 protokołu. B. Fotografia głowy myszy wskazująca miejsce nacięcia skóry głowy (czerwona linia) oraz strzałki (pomarańczowe) wskazujące kierunek, w którym skóra powinna być odsuwana od kości (patrz krok 2.4). C. Fotografia głowy myszy po odsunięciu skóry, ukazująca struktury kostne (patrz krok 2.4). Kierunek cięcia nożyczkami oraz kierunek otwierania czaszki pęsetą tępą są wskazane odpowiednio czarnymi przerywanymi strzałkami lub szarymi szerokimi strzałkami. D. Fotografia mózgu myszy po usunięciu poszczególnych struktur kostnych (patrz kroki 2.5 - 2.7). E. Fotografia usuwania mózgu, który jest nadal połączony z czaszką za pomocą nerwów czaszkowych. F. Fotografia stosunkowo nieuszkodzonego mózgu myszy.

Rycina 2. Wycinanie koronalnych przekrojów podwzgórza mózgu myszy. A. Fotografia wskazująca położenie jednokrawędziowego ostrza brzytwy służącego do usunięcia móżdżku (patrz krok 3.1). B. Położenie bloku żelu agarowego w stosunku do mózgu przyklejonego do płyty podstawowej mikrotomu (patrz krok 3.2). C. Wycinanie koronalnego przekroju mózgu (zwróć uwagę na położenie mózgu i bloku żelowego względem ostrza tnącego mikrotomu; patrz krok 3.4). d, grzbietowo; v, brzusznie.

Rycina 3. Przekrój mózgu umieszczony w komorze rejestracyjnej. A,B. Widok ogólny (A) oraz powiększenie (B) otwartej komory rejestracyjnej typu bath Warner Instruments RC-27, zapewniającej szeroki dostęp do obszarów podwzgórza w koronalnym przekroju mózgu (patrz krok 5.1). C. Metalowa harfa w kształcie litery U zawierająca równoległe rzędy nylonowych nici, które utrzymują przekrój w pozycji w komorze rejestracyjnej (patrz krok 5.2).

Rysunek 4. Ca²⁺ sygnały w neuronach τGFP w skrawkach mózgu podwzgórza myszy. A-D. Identyfikacja neuronu GFP i jednoczesna akwizycja fluorescencji fura-red w koronalnych skrawkach mózgu myszy. A. Obraz konfokalny koronalnego skrawka mózgu identyfikujący neurony GnRHR-τGFP (zielony). B. Stosunkowo jednolity sygnał fluorescencji (czerwony) obszaru mózgu pokazanego na A, zaobserwowany po załadowaniu skrawka mózgu fura-red/AM. C. Obraz złożony przedstawiający neurony ukazane na A załadowane Ca²⁺ barwnik wskaźnikowy (żółtawy). Granice ciał komórkowych neuronów GFP oznaczono przerywanymi białymi liniami, natomiast dwa przykłady ciał komórkowych nie-GFP (strzałki) oznaczono liniami szarymi. D. Przykład neuronu GFP i nie-GFP z wyższym poziomem fluorescencji czerwonej w porównaniu z tłem. E. Przykłady indukowanych bodźcem zmian Ca w ciele komórkowym²⁺ odpowiedzi poszczególnych neuronów oznaczonych GFP w różnych obszarach podwzgórza (Pe, jądro okoiventrykularne; DM, podwzgórze grzbietowo-przyśrodkowe; Arc, jądro łukowate). Pole pod krzywą (AUC) przedstawiono kolorem czerwonym. Wyraźne Ca²⁺ Sygnały między neuronami wykazującymi ekspresję GnRHR z różnych jąder podwzgórza można porównać, wykorzystując AUC jako szacunek całkowitej zmiany poziomu Ca2+²⁺ w danej komórce w tym samym okresie. F. Rysunki schematyczne i diagram wskazujące lokalizację neuronów z etykietą GFP analizowanych w punktach A-E. Górny panellokalizacja koronalnego przekroju mózgu zawierającego obszary podwzgórza (czerwona linia). Panel środkowy i dolnySchematyczny rysunek przekroju mózgu (środek) oraz powiększenie obszaru zaznaczonego czerwoną ramką (dolny panel) czerwone kropki wskazują przybliżoną pozycję zarejestrowanych neuronów z oznakowaniem GFP z obszarów Pe, DM i Arc pokazanych w E; czarny obszar na schemacie w dolnym panelu: 3^rd komora. Dwa dolne schematy zostały opracowane na podstawie prac Paxinosa i Franklina¹²Liczba w lewym dolnym rogu wskazuje odległość (mm) od Bregmy.

Dyskusja

Kluczowym pytaniem w neuronauce jest zrozumienie, w jaki sposób mózg przetwarza informacje społeczne. Dominującym źródłem informacji niezbędnych do rozpoznawania społecznego są sygnały węchowe lub feromonowe. Detekcja tych sygnałów przez populacje neuronalne w nosie oraz ich rozpoznawanie w mózgu, w szczególności w podwzgórzu, odgrywają kluczową rolę w wielu procesach społecznych i wpływają na hormony oraz inne czynniki neuroendokrynne^13-16. Istotną przeszkodą w analizie odpowiedzi neuronalnych w obszarach móz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimetylosulfoksyd	Fisher Scientific	BP231
Mikrotom z wibrującym nożem Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Urządzenie chłodzące CU 65 do mikrotomu Hyrax V 50	Zeiss	9920120
Inkubator O2/CO2, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Szpatułki podwójne, w kształcie łyżeczki	Bochem	3182
Mikroszpatułki, w kształcie łyżeczki	Bochem	3344
Nożyczki sprężynowe, Moria-Vannas-Wolff – ostrza 7 mm	Fine Science Tools	15370-52
Nożyczki sprężynowe, Vannas – ostrza 3 mm	Fine Science Tools	15000-00
Nożyczki Wagnera	Fine Science Tools	14071-12
Pinceta medyczna, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Duża prostokątna otwarta komora kąpieli (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Mikroskop konfokalny BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.