Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Podsumowanie

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis, które są kompatybilne z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS), co umożliwia badania konkretnych populacji komórek. Metoda ta jest odpowiednia dla każdej linii Arabidopsis, w której GFP jest ekspresowane w podzbiorze komórek.

Streszczenie

Po zainicjowaniu primordium liścia, akumulacja biomasy jest kontrolowana głównie przez proliferację i ekspansję komórek w liściach¹. Jednak liść Arabidopsis jest złożonym organem składającym się z wielu różnych typów komórek i kilku struktur. Jednocześnie rosnący liść zawiera komórki na różnych etapach rozwoju, przy czym komórki najdalej oddalone od ogonka liściowego jako pierwsze przestają się powiększać i wchodzą w proces starzenia¹. W związku z tym różne komórki w liściu w danym momencie mogą się dzielić, wydłużać lub różnicować; być aktywne, poddane stresowi lub martwe; i/lub reagować na bodźce w podzespołach swojego typu komórkowego. To sprawia, że badania genomiczne liścia są trudne: na przykład podczas analizy danych ekspresji z całych liści sygnały z sieci genetycznych działających w odrębnych strefach odpowiedzi komórkowej lub typach komórek zostaną pomylone, co doprowadzi do wygenerowania nieścisłego profilu.

Aby rozwiązać ten problem, opisano kilka metod umożliwiających badanie specyficznej dla komórek ekspresji genów. Należą do nich mikrodysekcja wspomagana laserem (LCM)² lub wykorzystanie roślin wykazujących ekspresję GFP do generowania protoplastów i następnego sortowania komórek metodą FACS (fluorescence activated cell sorting)^3,4, niedawno opisany system INTACT do precypitacji jąder komórkowych⁵ oraz immunoprecypitacja polizomów⁶.

Metoda FACS została z sukcesem wykorzystana w wielu badaniach, w tym do wykazania, że tożsamość komórki oraz jej odległość od wierzchołka korzenia mają istotny wpływ na profile ekspresji licznych genów^3,7. FACS linii GFP wykorzystano również do wykazania komórkowo-specyficznej regulacji transkrypcyjnej podczas reakcji korzenia na azot i rozwoju korzeni bocznych⁸, stresu solnego⁹, dystrybucji auksyn w korzeniu¹⁰ oraz do stworzenia mapy ekspresji genów w merystemie wierzchołkowym pędu Arabidopsis¹¹. Choć FACS był wcześniej stosowany do sortowania protoplastów pochodzących z liści Arabidopsis na podstawie autofluorescencji^12,13, do tej pory zastosowanie FACS w liniach Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP w liściach było bardzo ograniczone⁴. W poniższym protokole opisujemy metodę otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilnych z FACS, przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu reżimu generowania protoplastów. Demonstrujemy tę metodę na przykładzie linii Arabidopsis KC464, która wykazuje ekspresję GFP w epidermie adaksjalnej¹⁴, linii KC274, wykazującej ekspresję GFP w tkance przewodzącej¹⁴ oraz linii Arabidopsis TP382, która wykazuje ekspresję podwójnego konstruktu GFP połączonego z sygnałem lokalizacji jądrowej w komórkach szparkowych (dane nie pokazano; Rycina 2). Obecnie wykorzystujemy tę metodę do badania ekspresji specyficznej dla typu komórek podczas rozwoju i stresu, a także heterogenicznych populacji komórek na różnych etapach starzenia.

Protokół

1. Generowanie protoplastów

1. Zebrać materiał liściowy i pociąć go żyletką na paski o szerokości 1 mm (Rysunek 1). W przypadku próbek zawierających więcej niż jeden liść, przed cięciem można łatwo ułożyć w stos do 15 liści.
2. Bezzwłocznie przenieść paski liści do okrągłej szalki Petriego o średnicy 9 cm zawierającej 20 ml roztworu A (400 mM mannitolu, 20 mM wodnego MES, 20 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 0,1% BSA i 2,5 mM β-merkaptoetanolu, pH 5,7) z dodatkiem enzymów do izolacji protoplastów (1,2% celulazy R-10, 0,6% celulazy RS i 0,4% macerozymu R-10) oraz RNazy i inhibitorów transkrypcji (1×ProtectRNA i 10 μg/ml aktynomycyny D); delikatnie rozdzielić paski liści i poddać infiltracji próżniowej przez 2 × 5 min.
3. Umieścić szalkę Petriego na wytrząsarze orbitalnym ustawionym na 90 rpm w temperaturze pokojowej i inkubować w celu izolacji protoplastów przez 3-4 h.
   1. Podczas inkubacji paski liści należy rozdzielać od siebie za pomocą płaskich pęset w odstępach półgodzinnych.
4. Umieścić sito komórkowe 70 μm (Fisher Scientific) w probówce 50 ml i delikatnie przefiltrować przez nie roztwór z protoplastami. Pozwoli to na usunięcie pasków liści, które zostaną zatrzymane przez sito, podczas gdy protoplasty przejdą przez nie.
5. Przepłukać paski liści 4 ml roztworu A i delikatnie przefiltrować przez to samo sito.
6. Przenieść protoplasty do probówek z okrągłym dnem i odwirować zawiesinę protoplastów przy 300 x g przez 5 min, aby uzyskać osad protoplastów.
7. Delikatnie odessać jak najwięcej nadmiaru nadosadu, uważając, aby nie naruszyć osadu protoplastów.
8. Przepłukać protoplasty 5 ml roztworu A i wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć nadosad.
9. Resuspendować protoplasty w odpowiedniej objętości roztworu A, używając pipety Pasteura lub obciętego końcówki P1000.

2. FACS protoplastów liściowych

1. Bezpośrednio przed sortowaniem resuspenduj protoplasty za pomocą (nieuciętej) końcówki P1000, aby uniknąć ich zlepiania się.
2. Przenieś protoplasty do probówki do sortowania przez filtr filcon 50 μm (BD Biosciences) i rozcieńcz w odpowiedni sposób, aby uniknąć zapchania dyszy sortera komórkowego. Protoplasty są sortowane przy użyciu dyszy 100 μm pod ciśnieniem 20 psi (osłona) i 21-21,5 psi (próbka), częstotliwością 39,2 kHz oraz szybkością zdarzeń <4000 (ustawienia te są optymalne dla sortera komórkowego BD Influx (BD Biosciences). Optymalizacja na innych urządzeniach do sortowania komórek może wymagać korekty tych parametrów).
3. Protoplasty wykazujące ekspresję GFP są identyfikowane przy użyciu lasera argonowego 488 nm poprzez zestawienie wyników z filtra pasmowo-przepustowego 580/30 (pomarańczowy) względem filtra pasmowo-przepustowego 530/40 (zielony). Protoplasty GFP-dodatnie będą znajdować się w populacji high 530/low 580, protoplasty GFP-ujemne w populacji low 530/low 580, natomiast martwe/obumierające protoplasty oraz debris w populacji high 580 (Rysunek 2).
   1. W przypadku sortowania protoplastów, z których będzie ekstrahowane RNA, należy je sortować bezpośrednio do co najmniej 4 objętości buforu lizującego zawierającego środek redukujący (np. β-merkaptoetanol). Dodatkowo czas sortowania pojedynczej próbki powinien być ograniczony do 20-30 min, a jednorazowo przetwarzane powinny być maksymalnie dwie do trzech próbek.
   2. W celu wizualizacji posortowanych protoplastów należy je sortować bezpośrednio do co najmniej 8 objętości roztworu A, a następnie zebrać poprzez wirowanie w celu ich zagęszczenia.

3. Reprezentatywne wyniki

Niniejszy protokół opisuje metodę pozyskiwania protoplastów z liści Arabidopsis, które są wykorzystywane do fluorescencyjnego sortowania komórek (Rycina 1). Generowanie protoplastów w obecności RNazy i inhibitorów transkrypcji zapobiega wywołaniu odpowiedzi transkrypcyjnej w komórkach. Skutkuje to powstaniem wielu martwych i obumierających protoplastów, które wykazują znaczny poziom autofluorescencji. Podczas sortowania protoplastów przygotowanych tą metodą bardzo często obserwuje się kilka odrębnych populacji na wykresach fluorescencji 580 nm względem 530 nm wykorzystywanej do sortowania. Przykłady tego zjawiska wraz z bramkami sortującymi zastosowanymi w niniejszym protokole przedstawiono na Rycini 3.

Protoplasty można podzielić na 8 objętości roztworu A i zebrać w celu wizualizacji w celu potwierdzenia wzbogacenia. Rycina 2G przedstawia przykład takiego procesu z wykorzystaniem linii TP382, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach szparkowych.

Przykłady wydajności uzyskanych za pomocą tej metody, zarówno przed, jak i po amplifikacji, przedstawiono w Tabeli 1. Uzyskane ilości są wystarczające do amplifikacji przy użyciu systemu Ovation Pico WTA (500 pg-50 ng), a w konsekwencji do późniejszej analizy metodą qPCR (Rysunek 4), sekwencjonowania nowej generacji lub mikroarray.

Rysunek 1. Ogólny schemat przebiegu eksperymentu. 1) Pobranie odpowiednich liści z linii Arabidopsis wykazującej ekspresję GFP. 2) Szybkie pocięcie ich na paski o szerokości ~1 mm, natychmiastowe przeniesienie do roztworu do protoplastowania i infiltracja próżniowa. 3) Inkubacja przez 3-4 hr. 4) Delikatne filtrowanie roztworu protoplastów przez sito 70 μm, przeniesienie do probówek z okrągłym dnem i pelletowanie protoplastów przez wirowanie. 5) Bezpośrednio przed sortowaniem resuspensja protoplastów i przeniesienie do probówki do sortowania przez filtr 50 μm. 6) Sortowanie żywych protoplastów GFP-dodatnich i GFP-ujemnych. 7) Protoplasty mogą teraz zostać poddane analizie wizualnej lub z zastosowaniem technik takich jak qPCR, sekwencjonowanie nowej generacji lub mikroarray.

Rysunek 2. Linie KC464, KC274 i TP382 wykorzystane w niniejszym badaniu. A) Przekrój poprzeczny liścia KC464 wykazujący ekspresję GFP w epidermie adaksjalnej. B) Protoplasty wyizolowane z liści KC464. C) Przekrój poprzeczny liścia KC274 wykazujący ekspresję GFP w wiązkach przewodzących. D) Protoplasty wyizolowane z liści KC274. E) Liść TP382 wykazujący ekspresję GFP w komórkach szparkowych. F) Protoplasty wyizolowane z liści TP382. G) Przykład wzbogacenia uzyskanego metodą FACS dla komórek szparkowych wykazujących ekspresję GFP na tle złożonych komórek liścia, przedstawiający protoplasty zawierające GFP z populacji o wysokim sygnale 530/niskim 580, wyizolowane z liści TP382. A-F: Obrazy z mikroskopu konfokalnego; G: Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego. Paski skali na obrazach wynoszą 50 μm.

Rysunek 3. Typowe wykresy kropkowe z akwizycji FACS dla sygnałów z filtrów pasmowych 580/30 nm (pomarańczowy) vs. 530/40 nm (zielony) (sorter komórek BD Influx). Przedstawione bramki sortowania to takie, które są zazwyczaj stosowane podczas sortowania. A) Wykres kropkowy protoplastów wyizolowanych z liści Col-4, uzyskanych bez zastosowania inhibitorów, wykazujący pojedynczą populację niskiego poziomu 530/niskiego poziomu 580. B) Wykres kropkowy protoplastów wyizolowanych z liści Col-4 typu dzikiego (wt), uzyskanych w obecności inhibitorów, wykazujący przesunięcie fluorescencji 580 wynikające ze stresu i barwienia przez inhibitory. C-E) Wykresy kropkowe protoplastów wyizolowanych z liści linii odpowiednio KC74, KC464 i TP382, uzyskanych w obecności inhibitorów, wykazujące populacje zawierające GFP w grupach wysokiego poziomu 530/niskiego poziomu 580. Podano wartości procentowe zdarzeń w populacjach GFP (wysoki poziom 530/niski poziom 580). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rysunek 4. Ekspresja GFP w reprezentatywnych frakcjach populacji wyodrębnionych za pomocą bramkowania, jak pokazano na Rysunku 3. Dla każdego typu frakcji uzyskano dwie powtórzenia biologiczne, które namnożono za pomocą systemu Ovation Pico WTA, a następnie przeprowadzono qPCR z użyciem specyficznych dla GFP starterów (Tabela 2). Przedstawione wartości to najwyższe (czerwone), najniższe (zielone) oraz średnie wartości względne. Populacja high 580 została w tym przypadku podzielona na dwie: low 530/low 580 oraz high 530/low 580, dla których wykorzystano pojedyncze powtórzenie biologiczne, dlatego przedstawiono tylko pojedynczą wartość. Jako standard dla wszystkich próbek wykorzystano ACT2 (At3g18780). Leaf: cały liść. Unsorted: nieposortowane protoplasty. GFP1: high 530/low 580 oraz Rest1: low 530/low 580, GFP2: high 530/high 580 oraz Rest2: low 530/high 580, zgodnie z opisem na Rysunku 3 i w wstawce. Wyniki stanowią weryfikację optycznych ocen zawartości GFP w komórkach w posortowanych frakcjach (np. Rysunek 2G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Próbka	Liczba liści	Liczba komórek	Wydajność RNA (ng)	Wydajność RNA (amplifikowane; ng)
Cały liść A Cały liść B	1 1	- -	8001 10525	4623*** 4572***
Niesortowane protoplasty A Niesortowane protoplasty B	5 5	- -	2433 2625	1152*** 3321***
GFP1 A Rest1 A	15	6039 (0.39%*) 55389 (6.40%*)	-** -**	861 489
GFP1 B Rest1 B	15	10783 (0.63%*) 57040 (7.49%*)	-** -**	537 420
GFP2 Rest2	15	18337 (1.49%*) 62405 (73.49%*)	-** -**	360 411

Tabela 1. Próbki pobrane za pomocą FACS i przeanalizowane metodą qPCR w celu ustalenia, która frakcja zawiera żywe protoplasty wykazujące ekspresję GFP. W tabeli uwzględniono również całkowitą wydajność RNA w ng przed i po amplifikacji z wykorzystaniem systemu Ovation Pico WTA (NuGen). Frakcje GFP1, GFP2, Rest1 i Rest2 są przedstawione na wstawce w Rysunku 4. *Procent komórek w stosunku do całkowitej liczby komórek w procesie sortowania podano w nawiasach obok liczby komórek w danej frakcji. Procenty te nie są ze sobą skorelowane dla każdej próbki, ponieważ sortowanie FACS dla frakcji „Rest” zostało przerwane wcześniej niż dla frakcji GFP ze względu na znacznie większą liczbę zebranych komórek Rest. **50 ng użyto jako materiał wyjściowy do reakcji amplifikacji, zgodnie z protokołem producenta.

Starter	Sekwencja
mGFP5-ER.fw	GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA
mGFP5-ER.rv	TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT
ACT2.fw	GCCATCCAAGCTGTTCTCTC
ACT2.rv	GCCATCCAAGCTGTTCTCTC

Tabela 2. Primery do qPCR.

Dyskusja

Opisaliśmy metodę umożliwiającą wykorzystanie roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP w liściach do generowania protoplastów i ich późniejszej sortowania komórek za pomocą FACS. Metoda ta pozwala na uzyskanie ilości RNA wystarczających do amplifikacji, a tym samym do dalszej analizy za pomocą qPCR lub mikromacierzy. Posortowane frakcje są silnie wzbogacone w komórki zawierające GFP, co wykazano za pomocą qPCR (Rysunek 2).

Aby uzyskać wysoką wydajność żywych protoplastów, kluczowe jest szybkie działanie podczas początkowych etapów procedury, aż do momentu próżniowej infiltracji pasków liści roztworem do izolacji protoplastów zawierającym inhibitor. Ponadto, podczas przygotowywania 1 mm pasków liści bardzo ważne jest, aby liście kroić lub przecinać, a nie „siekać” lub miażdżyć, ponieważ prowadzi to do nadmiernych uszkodzeń i w konsekwencji do niższej wydajności protoplastów.

Kluczową różnicą między opisaną tutaj metodą a innymi opublikowanymi metodami jest zastosowanie inhibitorów RNazy oraz inhibitorów transkrypcji. Większość metod opracowano dla korzeni Arabidopsis, z których protoplasty można generować łatwiej. Jednak w przypadku pracy z liśćmi, z wyłączeniem mezofilu, konieczne jest wydłużenie czasu generowania protoplastów. Dlatego istotne jest zastosowanie tych inhibitorów, aby zapobiec zmianom w ekspresji genów wynikającym z samego procesu generowania protoplastów (dane nie pokazano). Jednak obecność inhibitorów prowadzi do niemożności wywołania odpowiedzi transkrypcyjnej, poprzez aktywację lub wyciszenie genów, co prawdopodobnie zwiększa podatność protoplastów, ponieważ prowadzi do utraty plastyczności niezbędnej do przeciwdziałania stresom związanym z procedurą izolacji protoplastów.

Opisaną tutaj metodę zastosowaliśmy z sukcesem u wielu linii Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP. Co istotne, metoda ta była wykorzystywana w liniach z GFP, w których białko to było silnie wyrażone w jądrze komórkowym lub znacznie słabiej w sposób rozproszony/niezlokalizowany w cytozolu, tak jak ma to miejsce w liniach KC464 i KC274 użytych w niniejszej procedurze. Oba typy linii są kompatybilne z tą metodą i pozwalają na uzyskanie frakcji protoplastów wykazujących ekspresję GFP o wysokim stopniu wzbogacenia (Rycina 2 i 3). Metoda ta może zostać łatwo dostosowana do innych fluoroforów, przy czym fluorofor musi zostać wybrany tak, aby jego fluorescencja istotnie różniła się od autofluorescencji komórek martwych lub obumierających, co pozwoli na zachowanie możliwości selekcji żywych komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Celulaza R-10	Melford	C8001
Celulaza RS	Melford	C8003
Macerozym R-10	Melford	M8002
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
ProtectRNA	Sigma-Aldrich	R7397
Aktynomycyna D	Sigma-Aldrich	A1410
Sito komórkowe 70 μm	Fisher	FB35181
Filtry filcon typu kubkowego 50 μm	BD Biosciences	340630