Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.
Artykuł metodologiczny
Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po inicjacji prymordium liścia akumulacja biomasy jest kontrolowana głównie przez proliferację i ekspansję komórek w liściach1. Jednak liść Arabidopsis jest złożonym organem składającym się z wielu różnych typów komórek i kilku struktur. Jednocześnie rosnący liść zawiera komórki na różnych etapach rozwoju, przy czym komórki najdalej oddalone od ogonka liściowego jako pierwsze przestają się rozszerzać i przechodzą w stan starzenia (senescencji)1. W związku z tym różne komórki w obrębie liścia w dowolnym momencie mogą się dzielić, wydłużać lub różnicować; być aktywne, objęte stresem lub martwe; oraz/lub reagować na bodźce w podzbiorach swojego typu komórkowego. Sprawia to, że badania genomowe liścia są wymagające: na przykład podczas analizy danych ekspresji z całych liści sygnały z sieci genetycznych działających w odrębnych strefach odpowiedzi komórkowej lub typach komórek zostaną pomieszane, co doprowadzi do wygenerowania niedokładnego profilu.
Aby rozwiązać ten problem, opisano kilka metod umożliwiających badanie specyficznej dla komórek ekspresji genów. Należą do nich mikrodysekcja sterowana laserem (LCM)2 lub wykorzystanie roślin wykazujących ekspresję GFP do generowania protoplastów i późniejszego sortowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej (FACS)3,4, niedawno opisany system INTACT do precypitacji jąder komórkowych5 oraz immunoprecypitacja polizomów6.
Metoda FACS była z sukcesem wykorzystywana w wielu badaniach, w tym do wykazania, że tożsamość komórki oraz jej odległość od wierzchołka korzenia mają istotny wpływ na profile ekspresji licznej grupy genów3,7. FACS linii GFP wykorzystywano również do wykazania specyficznej dla komórek regulacji transkrypcyjnej podczas reakcji korzeni na azot i rozwoju korzeni bocznych8, stresu solnego9, dystrybucji auksyn w korzeniu10 oraz do stworzenia mapy ekspresji genów w merystemie wierzchołkowym pędu Arabidopsis11. Chociaż FACS był wcześniej stosowany do sortowania protoplastów pochodzących z liści Arabidopsis na podstawie autofluorescencji12,13, dotychczas wykorzystanie FACS w liniach Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP w liściach było bardzo ograniczone4. W poniższym protokole opisujemy metodę otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilnych z FACS, przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu procedury generowania protoplastów. Metodę tę demonstrujemy na przykładzie linii Arabidopsis KC464, która wykazuje ekspresję GFP w epidermie adaksjalnej14, linii KC274, która wykazuje ekspresję GFP w tkance przewodzącej14 oraz linii Arabidopsis TP382, która wykazuje ekspresję podwójnej konstrukcji GFP połączonej z sygnałem lokalizacji jądrowej w komórkach aparatów szparkowych (dane niepokazane; Rycina 2). Obecnie stosujemy tę metodę do badania zarówno specyficznej dla typu komórek ekspresji podczas rozwoju i stresu, jak i heterogenicznych populacji komórek na różnych etapach starzenia się.
Protokół
1. Generowanie protoplastów
- Zebrać materiał liściowy i pociąć go na paski o szerokości 1 mm (Rycina 1) za pomocą żyletki. W przypadku próbek zawierających więcej niż jeden liść, przed cięciem można łatwo ułożyć w stos do 15 liści.
- Bezzwłocznie przenieść paski liści do okrągłej szalki Petriego o średnicy 9 cm zawierającej 20 ml roztworu A (400 mM mannitolu, 20 mM uwodnionego MES, 20 mM KCl, 10 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0,1% BSA i 2,5 mM β-merkaptoetanolu, pH 5,7) z dodatkiem enzymów do protoplastowania (1,2% celulozy R-10, 0,6% celulozy RS i 0,4% macerozymu R-10) oraz inhibitorów RNazy i transkrypcji (1×ProtectRNA i 10 μg/ml aktynomycyny D); delikatnie rozdzielić paski liści i poddać infiltracji próżniowej przez 2 × 5 min.
- Umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 90 rpm w temperaturze pokojowej i inkubować w celu uzyskania protoplastów przez 3-4 h.
- W czasie inkubacji paski liści należy rozdzielać od siebie za pomocą płaskich pęset w odstępach półgodzinnych.
- Umieścić sitko komórkowe 70 μm (Fisher Scientific) w probówce o pojemności 50 ml i delikatnie przefiltrować przez nie roztwór do protoplastowania. Pozwoli to na usunięcie pasków liści, które zostaną zatrzymane przez sito, podczas gdy protoplasty przejdą przez nie.
- Przepłukać paski liści 4 ml roztworu A i delikatnie przefiltrować przez to samo sito.
- Przenieść protoplasty do probówek o okrągłym dnie i odwirować roztwór protoplastów przy 300 x g przez 5 min, aby uzyskać osad z protoplastów.
- Delikatnie odessać jak największą ilość supernatantu, nie naruszając osadu protoplastów.
- Przepłukać protoplasty 5 ml roztworu A i wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant.
- Resuspendować protoplasty w odpowiedniej objętości roztworu A, używając pipety Pasteura lub uciętego końcówki pipety P1000.
2. FACS protoplastów liściowych
- Bezpośrednio przed sortowaniem resuspenduj protoplasty, używając (nieuciętej) końcówki P1000, aby uniknąć ich zlepiania się.
- Przenieś protoplasty do probówki do sortowania przez filtr filcon 50 μm (BD Biosciences) i rozcieńcz w odpowiedni sposób, aby uniknąć zapchania dyszy sortera komórkowego. Protoplasty są sortowane przy użyciu dyszy 100 μm pod ciśnieniem 20 psi (osłona) i 21-21,5 psi (próbka), przy częstotliwości 39,2 kHz i tempie zdarzeń <4000 (ustawienia te są optymalne dla sortera komórkowego BD Influx (BD Biosciences). Optymalizacja na innych maszynach do sortowania komórek może wymagać korekty tych parametrów).
- Protoplasty pozytywne pod kątem GFP są identyfikowane przy użyciu lasera argonowego 488 nm i poprzez wykreślenie sygnału z filtra pasmowo-przepustowego 580/30 (pomarańczowy) względem filtra pasmowo-przepustowego 530/40 (zielony). Protoplasty GFP-dodatnie znajdą się w populacji high 530/low 580, protoplasty GFP-ujemne w populacji low 530/low 580, a martwe/obumierające protoplasty oraz debris w populacji high 580 (Rysunek 2).
- Podczas sortowania protoplastów, z których będzie ekstrahowane RNA, powinny być one sortowane bezpośrednio do co najmniej 4 objętości buforu lizującego zawierającego czynnik redukujący (np. β-merkaptoetanol). Ponadto czas sortowania pojedynczej próbki powinien być ograniczony do 20-30 min, a w jednym czasie przetwarzane powinny być maksymalnie dwie do trzech próbek.
- W celu wizualizacji posortowanych protoplastów powinny być one sortowane bezpośrednio do co najmniej 8 objętości roztworu A, a następnie zebrane za pomocą wirowania w celu ich zagęszczenia.
3. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis, które są wykorzystywane do fluorescencyjnego sortowania komórek (Rycina 1). Generowanie protoplastów w obecności RNazy oraz inhibitorów transkrypcji zapobiega uruchomieniu odpowiedzi transkrypcyjnej w komórkach. Skutkuje to jednak powstaniem wielu martwych i obumierających protoplastów, które wykazują znaczny poziom autofluorescencji. Podczas sortowania protoplastów przygotowanych tą metodą bardzo często obserwuje się kilka odrębnych populacji na wykresach fluorescencji 580 nm względem 530 nm wykorzystywanej do sortowania. Przykłady tego zjawiska wraz z bramkami sortowania zastosowanymi w tym protokole przedstawiono na Rycynie 3.
Protoplasty można rozdzielić do 8 objętości roztworu A i zebrać w celu wizualizacji w celu weryfikacji wzbogacenia. Rysunek 2G przedstawia przykład tej procedury z wykorzystaniem linii TP382, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach szparkowych.
Przykłady wydajności uzyskanych za pomocą tej metody, zarówno przed, jak i po amplifikacji, przedstawiono w Tabeli 1. Uzyskane ilości są wystarczające do amplifikacji przy użyciu systemu Ovation Pico WTA (500 pg-50 ng), a tym samym do późniejszej analizy za pomocą qPCR (Rysunek 4), sekwencjonowania nowej generacji lub mikromacierzy.
Rycina 1. Ogólny schemat przebiegu eksperymentu. 1) Zbiór wybranych liści z linii Arabidopsis wykazującej ekspresję GFP. 2) Szybkie pocięcie na paski o szerokości ok. 1 mm i natychmiastowe przeniesienie ich do roztworu do protoplastyki oraz poddanie infiltracji próżniowej. 3) Inkubacja przez 3-4 hr. 4) Delikatna filtracja roztworu z protoplastami przez sito 70 μm, przeniesienie do probówek z okrągłym dnem i wytrącenie protoplastów poprzez wirowanie. 5) Bezpośrednio przed sortowaniem resuspensja protoplastów i przeniesienie do probówki do sortowania przez filtr 50 μm. 6) Sortowanie żywych protoplastów GFP-dodatnich i GFP-ujemnych. 7) Protoplasty mogą teraz zostać poddane analizie wizualnej lub z wykorzystaniem technik takich jak qPCR, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) lub mikromacierze.
Rysunek 2. Linie KC464, KC274 i TP382 wykorzystane w niniejszym badaniu. A) Przekrój poprzeczny liścia KC464 wykazujący ekspresję GFP w epidermie adaksjalnej. B) Protoplasty pochodzące z liści KC464. C) Przekrój poprzeczny liścia KC274 wykazujący ekspresję GFP w układzie przewodzącym. D) Protoplasty pochodzące z liści KC274. E) Liść TP382 wykazujący ekspresję GFP w komórkach szparkowych. F) Protoplasty pochodzące z liści TP382. G) Przykład wzbogacenia uzyskanego za pomocą FACS dla komórek szparkowych wykazujących ekspresję GFP w złożonym tle komórek liścia, pokazujący protoplasty zawierające GFP z populacji protoplastów o wysokiej fluorescencji 530/niskiej fluorescencji 580 pochodzących z liści TP382. A-F: Obrazy z mikroskopu konfokalnego; G: Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego. Paski skali na obrazach wynoszą 50 μm.
Rysunek 3. Typowe wykresy kropkowe z akwizycji FACS dla sygnałów z filtrów pasmowych 580/30 nm (pomarańczowy) vs. 530/40 nm (zielony) (sorter komórek BD Influx). Przedstawione bramki sortowania są tymi, które są typowo stosowane podczas sortowania. A) Wykres kropkowy protoplastów wyizolowanych z liści Col-4, uzyskanych bez użycia inhibitorów, wykazujący pojedynczą populację low 530/low 580. B) Wykres kropkowy protoplastów wyizolowanych z liści wt Col-4, uzyskanych w obecności inhibitorów, wykazujący przesunięcie fluorescencji 580 spowodowane stresem i barwieniem przez inhibitory. C-E) Wykresy kropkowe protoplastów wyizolowanych z liści odpowiednio linii KC74, KC464 i TP382, uzyskanych w obecności inhibitorów, wykazujące populacje zawierające GFP w populacjach high 530/low 580. Podano wartości procentowe zdarzeń w populacjach GFP (high 530/low 580). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Rysunek 4. Ekspresja GFP w reprezentatywnych frakcjach populacji wyodrębnionych za pomocą bramkowania, zgodnie z Rysunkiem 3. Dla każdego typu frakcji uzyskano dwie powtórzenia biologiczne, które powielono przy użyciu systemu Ovation Pico WTA, a następnie przeprowadzono qPCR z użyciem starterów specyficznych dla GFP (Tabela 2). Przedstawione wartości to najwyższe (czerwone), najniższe (zielone) oraz średnie wartości względne. Populacja high 580 została w tym przypadku podzielona na dwie: low 530/low 580 oraz high 530/low 580, dla których zastosowano pojedyncze powtórzenie biologiczne, dlatego przedstawiono tylko pojedynczą wartość. ACT2 (At3g18780) służył jako standard dla wszystkich próbek. Leaf: cały liść. Unsorted: nieposortowane protoplasty. GFP1: high 530/low 580 i Rest1: low 530/low 580, GFP2: high 530/high 580 i Rest2: low 530/high 580, zgodnie z opisem na Rysunku 3 i w wstawce. Wyniki stanowią weryfikację ocen optycznych zawartości GFP w komórkach w posortowanych frakcjach (np. Rysunek 2G). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
| Próbka | Liczba liści | Liczba komórek | Wydajność RNA (ng) | Wydajność RNA (amplifikowany; ng) |
| Cały liść A Cały liść B | 1 1 | - - | 8001 10525 | 4623*** 4572*** |
| Nieposortowane protoplasty A Niesortowane protoplasty B | 5 5 | - - | 2433 2625 | 1152*** 3321*** |
| GFP1 A Rest1 A | 15 | 6039 (0.39%*) 55389 (6.40%*) | -** -** | 861 489 |
| GFP1 B Rest1 B | 15 | 10783 (0.63%*) 57040 (7.49%*) | -** -** | 537 420 |
| GFP2 Odpoczynek 2 | 15 | 18337 (1.49%*) 62405 (73.49%*) | -** -** | 360 411 |
Tabela 1. Próbki pobrane za pomocą FACS i przeanalizowane metodą qPCR w celu ustalenia, która frakcja zawiera żywe protoplasty wykazujące ekspresję GFP. W tabeli uwzględniono również całkowitą wydajność RNA w ng przed i po amplifikacji z użyciem systemu Ovation Pico WTA (NuGen). Frakcje GFP1, GFP2, Rest1 i Rest2 są przedstawione na wstawce na Rysunku 4. *Procent komórek w stosunku do całkowitego przebiegu sortowania komórek podano w nawiasach obok liczby komórek w frakcji. Procenty te nie są ze sobą skorelowane dla każdej próbki, ponieważ przebiegi sortowania FACS dla frakcji „Rest” zostały przerwane wcześniej niż dla frakcji GFP ze względu na znacznie większą liczbę zebranych komórek Rest. **50 ng użyte jako materiał wejściowy do reakcji amplifikacji, zgodnie z protokołem producenta.
| Starter | Sekwencja |
| mGFP5-ER.fw | GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA |
| mGFP5-ER.rv | TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT |
| ACT2.fw | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
| ACT2.rv | GCCATCCAAGCTGTTCTCTC |
Tabela 2. Startery do qPCR.
Dyskusja
Opisaliśmy metodę pozwalającą na wykorzystanie roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP w liściach do generowania protoplastów i późniejszego sortowania komórek za pomocą FACS. Metoda ta pozwala na uzyskanie ilości RNA wystarczającej do amplifikacji, a w konsekwencji do dalszej analizy za pomocą qPCR lub mikromacierzy. Frakcje poddane sortowaniu są silnie wzbogacone w komórki zawierające GFP, co wykazano za pomocą qPCR (Ryc. 2).
Aby uzyskać wysoką wydajność żywych protoplastów, kluczowe jest szybkie działanie podczas początkowych etapów procedury, aż do momentu próżniowej infiltracji pasków liści roztworem do izolacji protoplastów zawierającym inhibitor. Ponadto, podczas przygotowywania pasków liści o szerokości 1 mm, bardzo ważne jest krojenie lub nacinanie liści zamiast ich „siekania” lub rozgniatania, ponieważ prowadzi to do nadmiernych uszkodzeń i w konsekwencji do niższej wydajności protoplastów.
Kluczową różnicą między opisaną tutaj metodą a innymi opublikowanymi metodami jest zastosowanie inhibitorów RNazy oraz inhibitorów transkrypcji. Większość metod opracowano dla korzeni Arabidopsis, z których protoplasty można generować łatwiej. Jednak w przypadku pracy z liśćmi, z wyłączeniem mezofylu, konieczne jest wydłużenie czasu generowania protoplastów. Dlatego istotne jest uwzględnienie tych inhibitorów w celu ochrony przed zmianami w ekspresji genów wynikającymi z samego procesu generowania protoplastów (dane nie zostały przedstawione). Jednak obecność inhibitorów prowadzi do niemożności wywołania odpowiedzi transkrypcyjnej, poprzez włączanie lub wyłączanie genów, co prawdopodobnie czyni protoplasty bardziej podatnymi, ponieważ prowadzi to do utraty plastyczności niezbędnej do przeciwdziałania stresom towarzyszącym procedurze protoplastyzacji.
Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną tutaj metodę w odniesieniu do wielu linii Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP. Co istotne, wykorzystaliśmy tę metodę w liniach GFP wykazujących silną ekspresję GFP w jądrze komórkowym lub znacznie słabszą ekspresję w sposób nielokalizowany/rozproszony w cytozolu, co ma miejsce w przypadku użytych tutaj linii KC464 i KC274. Oba typy linii są kompatybilne z tą metodą i pozwalają na uzyskanie wysoce wzbogaconych frakcji protoplastów wykazujących ekspresję GFP (Rysunek 2 i 3). Metodę tę można łatwo dostosować do innych fluoroforów, przy czym fluorofor musi zostać wybrany tak, aby jego fluorescencja znacząco różniła się od autofluorescencji komórek martwych lub obumierających, aby zachować możliwość selekcji żywych komórek.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace prowadzone w laboratorium Buchanan-Wollaston nad profilowaniem specyficznym dla typu komórek i stadium rozwoju są wspierane przez projekt AGRON-OMICS (grant nr LSHG-CT-2006-037704) w ramach 6th Framework Progamme Komisji Europejskiej. Prace prowadzone w laboratorium Gifford nad profilowaniem specyficznym dla typu komórek są wspierane przez grant BBSRC New Investigator (BB/H019502/1).
Linie Arabidopsis KC274 i KC464 otrzymano od A.A.R. Webba (University of Cambridge).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Celulaza R-10 | Melford | C8001 | |
| Celulaza RS | Melford | C8003 | |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 | |
| Aktynomicyna D | Sigma-Aldrich | A1410 | |
| Sito do komórek 70 μm | Fisher | FB35181 | |
| Filtry filcon typu kubkowego 50 μm | BD Biosciences | 340630 |
Bibliografia
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6(2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
Przedruki i uprawnienia
