Podejście do przetwarzania równoległego wielu celów w celu określenia gen-struktura podjednostki PB2 polimerazy grypy

Summary

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa ważną rolę w rozwoju leków. Równoległe dążenie do wielu celów znacznie zwiększa szansę na sukces w odkrywaniu potencjalnych klientów. Poniższy artykuł pokazuje, w jaki sposób Centrum Genomiki Strukturalnej Chorób Zakaźnych w Seattle wykorzystuje podejście wielocelowe do określania podjednostki PB2 influenza A od genu do struktury.

Abstract

Wybuchy pandemii wysoce zjadliwych szczepów grypy mogą powodować powszechną zachorowalność i śmiertelność w populacjach ludzkich na całym świecie. W samych Stanach Zjednoczonych ^{każdego roku średnio} 41 400 zgonów i 1,86 miliona hospitalizacji jest spowodowanych zakażeniem wirusem grypy1. Mutacje punktowe w podjednostce białka podstawowego polimerazy 2 (PB2) zostały powiązane z adaptacją infekcji wirusowej u ludzi ². Wyniki takich badań ujawniły biologiczne znaczenie PB2 jako czynnika wirulencji, podkreślając w ten sposób jego potencjał jako celu dla leków przeciwwirusowych.

Program genomiki strukturalnej zaproponowany przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) zapewnia finansowanie dla Emerald Bio i trzech innych instytucji Pacific Northwest, które razem tworzą Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). SSGCID ma na celu dostarczenie społeczności naukowej trójwymiarowych struktur białkowych patogenów kategorii A-C NIAID. Udostępnienie takich informacji strukturalnych społeczności naukowej służy przyspieszeniu projektowania leków w oparciu o strukturę.

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa ważną rolę w rozwoju leków. Równoległe dążenie do wielu celów znacznie zwiększa szansę na sukces w odkrywaniu nowych potencjalnych klientów poprzez ukierunkowanie na szlak lub całą rodzinę białek. Firma Emerald Bio opracowała wysokowydajny, wielozadaniowy potok przetwarzania równoległego (MTPP) do określania genów do struktury, aby wesprzeć konsorcjum. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowane do określenia struktury podjednostki PB2 z czterech różnych szczepów grypy A.

Protocol

Przegląd protokołu jest przedstawiony na rysunku 1.

Biologia molekularna

1. Projekt konstrukcji

Użyj oprogramowania Gene Composer do projektowania konstruktów białkowych i syntetycznych sekwencji genów opartych na kodonach. Korzystanie z oprogramowania Gene Composer zostało szczegółowo opisane w innym miejscu ³.

1. Użyj modułu Alignment Viewer i modułu Construct Design, aby porównać wyrównania sekwencji białek i zdefiniować konstrukcję białka. Dopasuj docelową sekwencję aminokwasów zarówno do podstawowych, jak i 3D elementów strukturalnych z homologów w Banku Danych o Białkach (PDB), jeśli jest dostępny (Rysunek 2).
2. Korzystaj z informacji o wyrównaniu, aby tworzyć projekty konstrukcji sterowane strukturą, wybierając nowe terminy na podstawie zachowania struktury podstawowej i struktur 3D homologów.
3. Konstrukcja z wkładką PCR (iPCR) i wektorową PCR (vPCR) amplimerami (startery końcowe).
4. Korzystając z algorytmu białko-DNA firmy Gene Composer, dokonaj odwrotnej translacji sekwencji aminokwasów konstruktu na sekwencję kwasu nukleinowego zmodyfikowaną przez kodony.
5. Użyj odpowiedniej tabeli użycia kodonów (CUT), aby zoptymalizować sekwencję pod kątem ekspresji w E. coli.
6. Praktycznie klonuj wstawkę do wektora pET28 zmodyfikowanego tak, aby zawierał N-końcowy 6-krotny znacznik histydyny i białko fuzyjne Smt3 / SUMO, które pozwala na łatwe oczyszczanie.
7. Złóż zamówienie na syntetyczne geny za pomocą DNA 2.0 i zamów startery od Integrated DNA Technologies.

2. Klonowanie niekompletnego rozszerzenia startera polimerazy (PIPE)

1. Przygotuj startery i geny
   1. Odwirować dostarczone przez dostawcę płytki zawierające startery z prędkością 1 000 obr./min przez 1 min.
   2. Doprowadzić stężenie gruntu do 100 μM i dodać 50 μl buforu TE.
   3. Rozcieńczyć startery do 10 μM wodą dejonizowaną (DI) w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V.
   4. Odwirować dostarczony przez dostawcę gen w probówce o pojemności 1,5 ml z prędkością 1 300 obr./min przez 1 minutę.
   5. Używając buforu TE, doprowadzić stężenie DNA w każdej probówce do 50 ng/μl.
   6. W probówkach o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć każdy starter do 10 ng/μl.
   7. Startery i geny należy przechowywać w temperaturze -20 °C, gdy nie są używane.
2. Przygotuj wstawianie PCR (iPCR)
   1. Rozmrozić fiolkę z Pfu Master Mix na lodzie; geny i startery należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
   2. Utwórz mapę płyt przypisując studnie do zestawu starterów i zbuduj.
   3. Dodaj 13 μl wody DI do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR.
   4. Dodać 5 μl startera do przodu i 5 μl startera wstecznego do każdej reakcji na płytce 96-dołkowej zgodnie z mapą płytki, upewniając się, że końcówki są wymieniane między każdym dołkiem.
   5. Dodać 2 μl każdego genu o pełnej długości do odpowiedniego dołka zgodnie z mapą płytki.
   6. Dodaj 25 μl głównej mieszanki Pfu do każdego dołka, upewniając się, że końcówki są zmieniane między każdym dołkiem.
   7. Przeprowadzaj reakcje cyklicznie, stosując następujące warunki PCR:
      1. 95 °C 2 min
      2. 95 °C 30 sek
      3. 50 °C 45 s
      4. 68 °C 3 min
      5. 4 °C ∞
   8. Powtarzaj kroki b-d przez 25 cykli.
   9. Przenieść 10 μl każdej reakcji iPCR na nową 96-dołkową płytkę PCR.
   10. Do każdej próbki dodać 3 μl barwnika o 6-krotnym obciążeniu.
   11. Oddziel każdą próbkę na 1% żelu agarozowym TAE EtBr przy napięciu 110 V obok drabinki DNA o napięciu 100-500 bps, aby potwierdzić amplifikację fragmentu.
   12. Produkt iPCR należy przechowywać w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany (w miarę możliwości należy unikać zamrażania i rozmrażania).

3. Przygotuj wektorowy PCR (vPCR)

1. Rozpocznij nocną hodowlę przekształconych E. coli za pomocą plazmidu wektorowego pET28.
   1. Zaszczepić dwie probówki bulionu 2-YT po 50 μg/ml kanamycyny.
   2. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce z prędkością 220 obr./min.
2. Odwiruj kultury po nocnym wzroście, wirując z prędkością 3 000 obr./min przez 15 minut.
3. Użyj zestawu Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit, aby wyekstrahować wektor pET28 z granulek bakteryjnych zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Konfiguracja trawienia enzymu restrykcyjnego wyekstrahowanego plazmidu pET28.
   1. Dodaj 2,2 μl buforu 10X BamHI i 1 μl BamHI i HindIII do 20 μl wektora pET28.
   2. Inkubować reakcję przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Oddzielny produkt trawienia na żelu.
   1. Patrz krok 2.2.10.
   2. Wytnij pasmo wektorowe z żelu i oczyść je za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu QIAquick zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Za pomocą kropli NanoDrop określ ilościowo stężenie DNA.
7. Rozcieńczyć wektor cięcia do 10 ng/μl. Przechowywać w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany.
8. Przygotuj startery vPCR.
   1. Wirówka IDT dostarczała oligonukliotydy przez 1 minutę przy 1 300 obr./min.
   2. Doprowadzić stężenie do 100 μM za pomocą wody demineralizowanej.
   3. Przygotować 10 μM rozcieńczenia starterów do przodu i do tyłu w probówce o pojemności 1,5 ml.
   4. Podkłady i rozcieńczenia podkładów należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
9. Rozmrozić Pfu Master Mix na lodzie i rozmrozić szablon i podkłady w temperaturze pokojowej.
10. Ustaw reakcje vPCR w 96-dołkowej płytce PCR:
    1. W pierwszym rzędzie 96-dołkowej płytki połącz 60 μl starterów vPCR do przodu i do tyłu oraz 24 μl przefermentowanej matrycy pET28 (10 ng / μl).
    2. Za pomocą 12-końcówkowej pipety wielokanałowej przenieś 12 μl startera i wzorca matrycy do każdego z pozostałych dołków płytki. W ten sposób powinno dojść do 12 μl podkładu i wzorca matrycowego w każdym dołku płytki.
    3. Dodaj 13 μl wody DI do każdej studzienki.
    4. Do każdego dołka dodać 25 μl Pfu Master Mix.
11. Cyklicznie przeprowadź reakcje przez warunki PCR użyte w kroku 2.2.7.
12. Zebrać wszystkie reakcje vPCR w probówce Falcon o pojemności 15 ml.
13. Sprawdzić amplifikację fragmentu, oddzielając 10 μl zbiorczego produktu PCR na żelu (oczekiwana długość strawionego wektora pET28 wynosi około 6 kb).
    1. Patrz krok 2.2.10.
14. Przygotuj płyty scalające.
    1. Porcję 3 μl produktu vPCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
    2. Przechowywać płytki w temperaturze -20 °C do czasu połączenia z produktem iPCR.

4. Połączenie produktów iPCR i vPCR

1. Rozmrozić produkty iPCR i wstępnie zaaminowaną 96-dołkową płytkę łączącą vPCR w temperaturze pokojowej.
2. Dodać 3 μl każdego produktu iPCR do odpowiedniego dołka płytki łączącej.
3. Przekształć płytkę scalającą w dziesięć najbardziej kompetentnych chemicznie komórek.
4. Dodaj 2 μl każdej reakcji łączenia do pojedynczej probówki o pojemności 50 μl z chemicznie kompetentnymi ogniwami dostarczonymi przez dostawcę i postępuj zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
5. Przygotuj kultury na noc dla każdego konstruktu z płytki transformacyjnej.
6. Podwielokrotność 5 ml bulionu TB (z 50 μg/ml kanamycyny) z 25 ml sterylnego zbiornika do każdej studzienki bloku studni głębinowej.
7. Stosując technikę sterylną, wybierz izolowaną kolonię z każdej płytki transformacyjnej i zaszczepij odpowiednią studzienkę bloku studni głębinowej.
8. Przykryj blok osłoną Airpore.
9. Wytrząsać blok przy 220 obr./min w temperaturze 37 °C przez noc.
10. Komórki peletowe poprzez odwirowanie bloku przez 30 minut przy 4,000 obr./min.
11. Odlej supernatant i osusz górną część bloku ręcznikiem papierowym.
12. Mini-przygotowanie przy użyciu 96-dołkowego aparatu próżniowego Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Przygotowanie zapasów glicerolu dla pomyślnie sklonowanych konstruktów

1. Przekształć pomyślnie sklonowane, zweryfikowane sekwencyjnie DNA w chemicznie kompetentne komórki BL21(DE3) zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Dla każdego konstruktu wybierz pojedynczą izolowaną kolonię z transformacji BL21(DE3) i zaszczepij w 1 ml bulionu 2-YT (z 50 μg/ml kanamycyny).
3. Wytrząsać kultury bakterii z prędkością 220 obr./min przez 3–4 godziny w temperaturze 37 °C.
4. Oznacz probówkę z nakrętką o pojemności 1,5 ml unikalnym numerem identyfikacyjnym konstrukcji, szczepem komórki i datą. Dodać 500 μl 50% glicerolu i 500 μl hodowli komórkowej i kilkakrotnie odwrócić. Zapas glicerolu należy natychmiast przechowywać na suchym lodzie lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

6. Testowanie wyrażeń

Bufor do lizyr Bufor do płukania Bufor elucyjny 50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0
300 mM NaCl
10 mM Imidazol
1% Animacja 20
2 mM MgCl₂
0,1 μl/ml benzonazy
1 mg/ml lizozymu 50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0
300 mM NaCl
20 mM Imidazol
0.05% Animacja 20 25 mM Tris, pH 8,0
300 mM NaCl
250 mM Imidazol
0.05% Animacja 20

* Dodaj benzonazę, lizozym i inhibitor proteazy bezpośrednio przed lizą.

1. Przenieść próbkę z wywaru glicerolu na selektywny agar z kanamycyną i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Rozpocznij nieindukującą hodowlę wstępną w 96-dołkowym bloku o okrągłym dnie; zaszczepij 1,2 ml bulionu TB (z 50 mg / ml kanamycyny) uzupełnionego 0,5% glukozy świeżo wyhodowanym izolatem E. coli. Rosnąć przez noc, wytrząsając z prędkością 220 obr./min w temperaturze 37 °C.
3. Po całonocnym wzroście należy rozpocząć hodowle indukcyjne od zaszczepienia 1,2 ml bulionu gruźlicy (z 50 mg/ml kanamycyny) uzupełnionego Novagen Overnight Express System 1 (zgodnie z protokołem producenta) 40 μl kultury wstępnej.
4. Hoduj małe kultury indukcyjne w temperaturze 20 °C przez 48 godzin, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
5. Zebrać komórki przez odwirowanie z prędkością 4 000 obr./min przez 15 minut, odlać supernatant i przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę przed przetwarzaniem.
6. W bloku 96-dołkowym ponownie zawieś granulki komórek w buforze do lizy o pojemności 300 μl.
7. Inkubować komórki w buforze do lizy w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie mechanicznie lizować energicznie wstrząsając przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Klarować surowy lizat przez odwirowanie przez 30 minut przy 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C.
9. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 μl oczyszczonego lizatu (frakcji rozpuszczalnej) do 96-dołkowej tacki z płaskim dnem (Qiagen). Do każdej studzienki zawierającej próbkę dodać 40 μl kulek magnetycznych Ni-NTA (Qiagen).
10. Delikatnie mieszaj płytkę na kołysce przez 1 godzinę w temperaturze 16 °C.
11. Umieść płytkę na magnetycznej płytce słupkowej (Qiagen) i usuń niezwiązaną frakcję rozpuszczalną. Należy uważać, aby nie odpipetować żadnych kulek Ni-NTA.
12. Zdejmij płytkę z płyty słupka i delikatnie zawieś kulki w 200 μl buforze do mycia. Pipetuj w górę i w dół przez 30 sekund, a następnie umieść płytkę z powrotem na płytce słupka.
13. Wyjmij bufor do płukania i powtórz krok 6.12.
14. Wyjąć płytkę z płytki końcowej i wymyć docelowe białko związane z Ni-NTA, przemłukując 50 μl buforu elucyjnego przez 5 minut.
15. Umieścić płaską płytkę dolną na magnetycznej płytce słupkowej i przenieść elucję na świeżą 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V.
16. Przenieść 20 μl elucji na świeżą 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i reagować z 1 μl proteazy ULP1.
17. Zgodnie z protokołem producenta, wymywaną i eluowaną frakcję + Ulp1 należy analizować za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu LabChip 90.
18. Alternatywnie, wszystkie frakcje z badania ekspresji mogą być analizowane za pomocą SDS-PAGE.

7. Fermentacja na dużą skalę

1. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby uzyskać zeskrob z wywaru glicerynowego, zaszczepić 100 ml bulionu TB (z 50 mg/ml kanamycyny) i rosnąć przez noc. Wstrząsać przy 220 obr./min i temperaturze 37 °C.
2. Po całonocnym wzroście rozbudować hodowlę wstępną, zaszczepiając 1 l bulionu gruźlicy roztworami autoindukcyjnymi EMD (patrz protokół producenta) (50 mg/ml kanamycyny) w kolbie z przegrodami o pojemności 2 l z 10 ml kultury wstępnej (rozcieńczenie 1:100).
3. Wytrząsnąć rozprężone kultury o pojemności 1 litra w temperaturze 37 °C; zmienić temperaturę inkubatora z wytrząsaniem na 20 °C, gdy zostanie osiągnięta gęstość optyczna 0,6 (OD₆₀₀).
4. Po nocnym wzroście należy pobrać reprezentatywną porcję 10 ml z każdego konstruktu do badania ekspresji.
5. Zebrać pastę komórkową przez odwirowanie z prędkością 5 000 obr./min przez 15 minut i odrzucić supernatant.
6. Zamrozić pastę komórkową w temperaturze -80 °C.

OCZYSZCZANIE BIAŁKA

:

Bufor do lizy Bufor A (równowaga) Bufor B (elucja) Określanie rozmiaru bufora kolumny 25 mM Tris, pH 8,0
200 mM NaCl
0,5 % glicerol
0.02 % CHAP
10 mM Imidazol
1 mM TCEP
50 mM Arginina
5 μl benzonazy
100 mg lizozymu
3 tabletki inhibitora proteazy (bez EDTA) 25 mM Tris, pH 8,0
200 mM NaCl
10 mM Imidazol
1 mM TCEP
50 mM Arginina
0,25% glicerolu 25 mM Tris, pH 8,0
200 mM NaCl
200 mM Imidazol
1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8,0
200 mM NaCl
1% glicerolu
1 mM TCEP

* Dodaj tabletki benzonazy, lizozymu i inhibitora proteazy do każdej próbki o pojemności 150 ml bezpośrednio przed lizą.

8. Liza komórek

1. Przygotować 2 litry buforu do lizy, nie dodawać lizozymu, tabletek inhibitora proteazy ani benzonazy (każda próbka będzie poddawana lizie osobno w 150 ml buforu do lizy).
2. Rozmrozić i ponownie zawiesić pastę komórkową w buforze do lizy w stosunku 1:5 masa do objętości, energicznie mieszając przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Oderwać kawałki od boków zlewki za pomocą czystej szpatułki. W tym czasie należy przygotować niklu i do dializy
3. Na lodzie zjonizuj ogniwa za pomocą sonikatora Misonix (70% mocy, 2 sekundy włączenia/1 sekundy wyłączenia impulsów przez 3 minuty) i delikatnie zakręć pojemnikiem, aby zapobiec przegrzaniu. Zachowaj niewielką (200 μl) porcję surowego lizatu do przyszłej analizy.
4. Sklarować surowy lizat przez odwirowanie w temperaturze 18 000 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant i zachować małą porcję (200 μl) do przyszłej analizy. Przechowywać osad w temperaturze 4 °C do czasu potwierdzenia, że białko zostało zlizowane do frakcji rozpuszczalnej.

9. Konfiguracja ekspresu białkowego przed uruchomieniem

1. Gdy ekspres do białek jest włączony, a oprogramowanie otwarte, zainicjuj urządzenie.
2. Po zainicjowaniu należy przymocować jedną kolumnę chelatową niklu (kolumna Ni) o pojemności 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF (kolumna Ni) na oddzielnej linii suwnicy dla każdej z próbek.
3. Przeprowadź 3-4 woluminy kolumn (CV) bufora równowagi przez każdą kolumnę.
4. Zalać linie buforowe równowagi i elucji.
5. Wyrównaj kolumny, jednokrotnie zasysając bufor A przez kolumnę.

10. Kolumna niklu 1 (Ni1)

1. Przemyć każdą kolumnę 20 ml wody Milli-Q w celu usunięcia buforu do przechowywania. Uruchomić 5 ml buforu B i 25 ml buforu A w celu zrównoważenia.
2. Załadować oczyszczony lizat zawierający rozpuszczone białko do kolumn z szybkością 2 ml/min, a następnie przepłukać 15 ml buforem A.
3. Eluować związane białko w stopniowym gradiencie z A i B w następujących proporcjach: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Zebrać każdą frakcję elucji oddzielnie.
4. Analiza: frakcje eluowane, lizat surowy, lizat klarowany i przepływ za pomocą SDS-PAGE. Zbierz frakcje zawierające białko i użyj Nanodrop do pomiaru A₂₈₀, aby z grubsza określić ilość obecnego białka.

11. Łupliwość ULP1

1. Zachować małą podwielokrotność (250 μl) puli kolumny Ni1 do późniejszej analizy żelu. Doprowadź resztę puli Ni1 do 10 ml i dodaj proteazę podobną do ubikwityny 1 (ULP1) w stężeniu 1 μl/5 mg białka całkowitego, aby usunąć znacznik powinowactwa His-Smt.
2. Dializować pulę Ni1 + ULP1 w stosunku do 2 litrów buforu A przez 4 godziny w temperaturze 4 °C w punkcie odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa (MWCO) na płytce mieszającej w temperaturze 4 °C.
3. Po dializie uruchom SDS-PAGE puli Ni1 i puli Ni1 + ULP1, aby określić, czy rozszczepienie ULP1 powiodło się.

12. Kolumna niklu 2 (Ni2)

1. Załadować rozszczepione białko do tej samej kolumny Ni i powtórzyć krok 9.3 ze zmniejszoną szybkością przepływu 1 ml/min. Odcięty znacznik zwiąże się z kolumną, a białko docelowe bez znacznika będzie teraz przepływać. Zebrać przepływ do nowego pojemnika.
2. Przemyć kolumnę Ni 3 ml buforu A, a następnie 5 ml buforu B w celu wymycia wszystkich białek znakowanych Hisem i niespecyficznie związanych. Zbierz każdą frakcję osobno.
3. Uruchom SDS-PAGE frakcji przepływowych, płuczących i elucyjnych Ni2, aby zweryfikować rozszczepienie ULP1 i czy białko jest obecne w przepływie. Użyj Nanodrop do zmierzenia A₂₈₀, aby z grubsza określić obecność białka.

13. Koncentracja

1. Zagęścić przepływ Ni2 (i elucję Ni2, jeśli obecne jest białko) do 5 ml za pomocą probówki wirówkowej Amicon Ultra 10 kDa MWCO. Wirować w odstępach 10-minutowych z prędkością 4 000 obr./min w temperaturze 4 °C. Mieszać pipetą między każdym wirowaniem, aby zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu białka wzdłuż błony.

14. Chromatografia wykluczająca rozmiar (SEC)

1. Ustaw kolumnę Sephacryl S-100 10/30 GL (GE healthcare), równoważąc ją z 200 ml buforem SEC przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min w systemie AKTApurifier (GE Healthcare).
2. Przygotuj superloopy o pojemności 10 ml do użycia na kolumnie SEC zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml załaduj próbki do superpętli i rozpocznij bieg SEC.
4. Monitoruj ślad absorpcji UV przy 280 nm podczas zbierania małych frakcji objętościowych.
5. Uruchom frakcje SEC za pomocą SDS-PAGE.
6. Zbierz frakcje SEC pokazujące pasma o największej intensywności.
7. Skoncentrować zbiorcze frakcje SEC. Patrz krok 13.1.
8. Podwielokrotność białka rozmieścić w 100 μl próbek, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

KRYSTALIZACJA

15. Krystalizacja białek

1. Wstępnie napełnij każdy zbiornik 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej Compact Jr (Emerald Bio) 80 μl wybranego sita krystalizacyjnego (Emerald Bio).
2. Rozcieńczyć białko buforem do 2-20 mg/ml i przechowywać na lodzie.
3. Dozować 0,4 μl białka i 0,4 μl sita krystalizacyjnego do każdej z 96 studzienek i przykryć krystalicznie czystą taśmą uszczelniającą (Manco).
4. Przechowywać płytkę w temperaturze 16 °C, sprawdzając okresowo w ciągu następnych kilku tygodni pod mikroskopem preparacyjnym, czy białka krystalizują.

16. Zbieranie kryształów

1. Stwórz krioprotektant z ługu macierzystego i glikolu etylenowego. Przeciąć przezroczystą taśmę pokrywającą studzienkę docelowym kryształem białka. Do pustej studzienki dodać 1,6 μl odpowiednich warunków krystalizacji i połączyć z 0,4 μl glikolu etylenowego, uzyskując końcowe stężenie 20% glikolu etylenowego i 80% warunki krystalizacji. Uwaga: aby zoptymalizować dyfrakcję kryształów, wypróbuj różne krioprotektanty, takie jak: glicerol, oleje, glikole polietylenowe o niskiej MW i/lub o różnej zawartości procentowej krioprotektantu.
2. Przed zbiorem schłodzić krążek w stylu ALS w dewarze wypełnionym ciekłym azotem i przykryć pokrywką.
3. Zbierz kryształ, umieszczając CryoLoop o wewnętrznej średnicy odpowiadającej rozmiarowi kryształu na magnetycznej różdżce kryształowej (Hampton Research) i zgarnij go bezpośrednio z roztworu studni.
4. Natychmiast zanurz CryoLoop z zebranym kryształem w krioprotektantze, a następnie zanurz go w krążku typu ALS, aby błyskawicznie zamrozić kryształ. Powtórz dla żądanej liczby kryształów.

17. Badanie kryształów/Zbieranie danych

1. Po zakończeniu zbioru użyj różdżki krążkowej, aby umieścić magnetyczną pokrywę krążka kriogenicznego na krążku ALS. Za pomocą wygiętych szczypiec odwróć krążek do góry nogami.
2. Przenieś krążek do Rigaku ACTOR dewar, przykręć popychacz krążka do krążka i uderz w pokrywę, pozostawiając go w dewarze ze szpilkami do góry.
3. Korzystając z oprogramowania JDirector prześwietlaj każdy kryształ pod następującymi parametrami: szczelina wiązki ustawiona na 0,5 stopnia, odległość detektora ustawiona na 50 mm, krok obrazu na 70 stopni i długość ekspozycji ustawiona na 30 sekund.
4. Uruchom Mosflm na obrazach testowych wykonanych za pomocą JDirector, aby określić, jaki jest najlepszy kryształ i strategia zbierania danych.
5. Zbierz kompletny zestaw danych na podstawie wyników z Mosflm.

18. Przetwarzanie danych/Określanie struktury

1. Uruchom program XDS/XSCALE ⁴, aby przetworzyć zestaw danych.
2. Otwórz oprogramowanie pakietu CCP4.
   1. Uruchom Phaser ⁵, aby obliczyć molekularny roztwór zastępczy przy użyciu modelu wyszukiwania o wysokiej homologii, jeśli jest dostępny. W tym przypadku użyliśmy PDBID 3CW4 jako modelu wyszukiwania ⁶.
   2. Uruchom Refmac ⁷, aby uściślić model molekularny względem obserwowanego odbicia zebranego w zestawie danych. Ostateczna rozdzielczość powinna opierać się na najwyższej powłoce i być określona przez następujące parametry: współczynnik R > 50%, I/sigma > 2 i kompletność > 90%.
3. Zbuduj trójwymiarowy model gęstości elektronów za pomocą oprogramowania do grafiki molekularnej COOT ⁸.
4. Przed zdeponowaniem struktury w PDB należy ją zweryfikować za pomocą oprogramowania MolProbity ⁹, aby sprawdzić, czy jakość struktury jest odpowiednia do osadzania.

Results

Poniższe wyniki ilustrują oczekiwane wyniki opisanego protokołu, a w przypadku PB2, obserwowane wyniki.

Za pomocą Gene Composer zaprojektowano pięć pełnowymiarowych sekwencji aminokwasów docelowych podjednostki PB2 wirusa grypy (Rysunek 2). Sekwencje PB2 zostały ponownie poddane translacji wstecznej i poddane wielu etapom inżynieryjnym ³, w wyniku czego uzyskano zharmonizowane sekwencje kodonów zoptymalizowane pod kątem ekspresji u E. coli. Z produktów iPCR (Figura 3b) w sumie trzydzieści cztery konstrukty zostały pomyślnie sklonowane do zmodyfikowanego systemu wektorów pET28 ¹⁰ z N-końcowym 6-krotnym znacznikiem fuzyjnym His-Smt przy użyciu klonowania PIPE ³, jak pokazano na rysunku 3a. Podsumowanie procesu klonowania przedstawiono na rysunku 4.

Po udanym klonowaniu, w komórkach BL21(DE3) E. coli przetestowano ekspresję białek w mikroskali każdego konstruktu. Komórki hodowano na pożywce gruźliczej uzupełnionej pożywką Novagen Overnight Express 1 (zgodnie z protokołem producenta) przez 48 godzin w temperaturze 20 °C w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 220 obr./min. Po wzroście komórki zebrano i przetestowano pod kątem ekspresji rozpuszczalnych białek za pomocą elektroforezy kapilarnej z Caliper LabChip 90. Czternaście z trzydziestu czterech konstruktów PB2 doprowadziło do powstania rozpuszczalnego białka docelowego i przeszło fermentację na dużą skalę. Wielkoskalowe kultury każdego konstruktu hodowano na pożywce gruźlicowej uzupełnionej pożywką Overnight Express 1 firmy Novagen zgodnie z protokołem producenta. Po wzroście komórki zebrano przez odwirowanie i przechowywano w temperaturze -80 °C. Ekspresję białek na dużą skalę w każdej kulturze potwierdzono za pomocą analizy SDS-PAGE (ryc. 5) przed przystąpieniem do oczyszczania na dużą skalę.

Ekspres do białek został użyty do przeprowadzenia równoległego oczyszczania czternastu konstruktów PB2. Oczyszczone lizaty wszystkich czternastu konstruktów przepuszczono przez kolumnę niklowo-chelatową. Po ustaleniu, które frakcje zawierały białko docelowe za pomocą SDS-PAGE, odpowiednie frakcje zostały połączone dla każdej próbki, a stężenie każdej z nich określono za pomocą odczytu A₂₈₀. Usunięcie znacznika 6x His-Smt przeprowadzono poprzez dodanie ULP1, a następnie nocną dializę i drugą kolumnę niklu. Potwierdzenie usunięcia znacznika His-Smt przeprowadzono za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 6), a każdą próbkę zagęszczono za pomocą probówki wirówkowej Amicon Ultra o mocy 10 kDa. Po zagęszczeniu za pomocą probówek wirówkowych Amicon Ultra, każda próbka została przepuszczona przez kolumnę zaklejającą w celu uzyskania czystości krystalograficznej. Drugie stężenie przeprowadzono w celu zwiększenia stężenia białka do poziomu niezbędnego do krystalizacji. Wszystkie czternaście konstruktów zostało pomyślnie oczyszczonych i włączonych do prób krystalizacji.

Krystalizacja została zainicjowana przez rozmrożenie wcześniej zamrożonego białka. Krystalizację przeprowadzono w klimatyzowanym pomieszczeniu w temperaturze 16 °C za pomocą specjalnie zaprojektowanych płytek (Emerald Bio) do dyfuzji pary w pozycji siedzącej (ryc. 7). Wstępne badania przesiewowe przeprowadzono za pomocą czterech ekranów z rzadką matrycą; JCSG+, Pact, Wizard Full i CryoFull (Emerald Bio), zgodnie z rozszerzoną strategią Newmana. 0,4 μl roztworu białkowego zmieszano następnie z 0,4 μl roztworu krystalicznego (lub zbiornikowego) z odpowiedniego zbiornika za pomocą 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych Compact Jr (Emerald Bio). Z czternastu oczyszczonych próbek, w dziewięciu z nich znaleziono kryształy nadające się do badań dyfrakcyjnych (ryc. 8). Własny zestaw danych dyfrakcyjnych został zebrany na pięciu z dziewięciu konstruktów skrystalizowanych na długości fali Cu Kα przy użyciu generatora promieniowania rentgenowskiego Rigaku SuperBright FR-E+ z anodą obrotową, wyposażonego w optykę Osmic VariMax HF i detektor CCD Saturn 944+ (ilustracja 9). Każdy zestaw danych został przetworzony za pomocą XDS/XSCALE⁴ i przeskalowany do ostatecznej rozdzielczości. Próby rozwiązania struktur poprzez wymianę molekularną przeprowadzono za pomocą Phaser ⁵ z zestawu CCP4 ⁷. Finalne modele uzyskano po udoskonaleniu w REFMAC ⁷ i ręcznej przebudowie za pomocą Coot ¹¹. Struktury zostały ocenione i skorygowane pod kątem geometrii i dopasowania za pomocąMolProbity ⁹. W sumie wyznaczono cztery struktury podjednostki PB2 (ryc. 10) i zdeponowano je w PDB. Na rys. 11 przedstawiono ogólny wynik na każdym etapie procesu MTPP.

Rysunek 1. Przegląd szlaku gen-struktura SSGCID do równoległego przetwarzania wielu celów w Emerald Bio.

Rysunek 2. Przeglądarka dopasowania i moduł projektowania konstruktów białkowych w oprogramowaniu Gene Composer. Konstrukt zasady aminokwasowej celu jest pokazany na zielono (środkowe okno), a obcięcia alternatywnych konstrukcji są pokazane na żółto (dolne okno). Pokazano wyrównanie wielu sekwencji PB2 wirusa grypy w porównaniu z sekwencją i elementami struktury drugorzędowej domeny C-końcowej z PDBID 3CW4. Znajomość struktury domeny i drugorzędowych elementów struktury pozwala na wybór N-końcowych obcięć w module Gene Composer Design Module poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na żądaną resztę aminokwasową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3a. Ilustruje to klonowanie PIPE, w którym syntetyczna wstawka genu (pomarańczowa) jest amplifikowana przez zaprojektowane startery do przodu (czerwono-pomarańczowe linie) i wsteczne (pomarańczowo-niebieskie linie) w celu wygenerowania materiału do wstawienia PCR. Wektor ekspresji jest amplifikowany starterami odwróconymi (czerwono-czarne linie) i naprzód (niebiesko-czarne linie) w celu wygenerowania wektorowego materiału PCR. Sekwencje końcowe produktów iPCR są komplementarne do końcowych sekwencji produktów vPCR (czerwony dla dopełniaczy iPCR, czerwony dla vPCR i niebieski dla dopełniaczy iPCR, niebieski dla vPCR). Pozwala to produktom iPCR i vPCR na wyżarzanie w celu wytworzenia plazmidów, które są replikowane po przekształceniu w chemicznie kompetentne komórki E. coli gospodarza BL21(DE3).

Rysunek 3b. Analiza produktów iPCR z podjednostki PB2 w żelu agarozowym. Niepowodzenia iPCR mogą być postrzegane jako słabe lub rozmazane prążki, podczas gdy udane produkty iPCR są reprezentowane przez wytrzymałe prążki. Jakość produktu iPCR może być ogólnie skorelowana z sukcesem klonowania. Markery masy cząsteczkowej są w kilodaltonach. Rysunek jest reprodukowany z Raymond et al., 2011 ¹².

Rysunek 4. Etapy inżynierii genetycznej docelowych białek PB2 przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Gene Composer. Po ustaleniu zmodyfikowanej sekwencji kwasu nukleinowego dla każdego celu, dla każdego z nich zaprojektowano 6-7 alternatywnych konstruktów białkowych. Równoległe przetwarzanie wielu celów na początkowych etapach projektowania genów i klonowania zaowocowało 34 konstruktami, z których 14 było żywotnymi celami, które wytwarzały rozpuszczalne białka w E. coli.

Rysunek 5. Reprezentatywna analiza SDS-PAGE fermentacji na dużą skalę wykazała solidną ekspresję białka (oczekiwana wielkość 25,76 kDa), około 50% rozpuszczalnego (ścieżka 4) i około 50% rozszczepienia 6-krotnego znacznika His-Smt z eluowanego białka (ścieżka 7).

Rysunek 6. Wyniki SDS-PAGE dla trzech konstruktów podjednostki polimerazy PB2. Pas 1, znaczniki masy cząsteczkowej (oznaczone po lewej stronie w kDa); pasy 2, 6 i 10, białko zbiorcze z kolumny niklu 1; pasy 3, 7 i 11, przepływ rozszczepionego białka w buforze A z niklu 2; pasy 4, 8 i 12, usunięcie znacznika 6x His-Smt w buforze B z Nickel 2.

Rysunek 7. Schemat dyfuzji pary wodnej metodą kropli w pozycji siedzącej. Metoda kropli siedzącej do krystalizacji białek należy do kategorii dyfuzji pary. Metoda ta polega na oczyszczeniu próbki białka i środka strącającego w celu zrównoważenia z większym zbiornikiem zawierającym podobne warunki w wyższym stężeniu. Gdy woda odparowuje z próbki białka i przenosi się do zbiornika, stężenie środka strącającego wzrasta do optymalnego poziomu dla krystalizacji białka.

Rysunek 8. Kryształ białka podjednostki polimerazy PB2 ze szczepu wirusa grypy.

Rysunek 9. Obraz dyfrakcyjny rentgenowski podjednostki polimerazy PB2 ze szczepu wirusa grypy.

Rysunek 10. Diagramy wstęgowe cząsteczek w asymetrycznej jednostce krystalograficznej 4 struktur PB2. Struktury drugorzędne pokolorowane w tęczowy wzór z odpowiednimi kodami PDB. a) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) b) 3KHW (A/Meksyk/InDRE4487/2009/H1N1) c) 3KC6 (A/Wietnam/1203/2004/H5N1) d) 3L56 (A/Wietnam/1203/2004/H5N1).

Rysunek 11. Analiza wyników dla docelowych wartości PB2 dla grypy za pomocą opisanych metod. Proces oznaczania struktury jest zilustrowany w pięciu krokach: klonowanie, rozpuszczalność, oczyszczanie, krystalizacja i określanie struktury.

Discussion

Wielodocelowe przetwarzanie równoległe

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa ważną rolę w odkrywaniu leków. SSGCID ma na celu dostarczenie społeczności naukowej trójwymiarowych struktur białkowych z patogenów kategorii A-C NIAID. Szerokie udostępnienie takich informacji strukturalnych przyczyni się w ostatecznym rozrachunku do przyspieszenia projektowania leków w oparciu o strukturę.

Pierwszym krytycznym krokiem podejścia MTPP jest projektowanie konstrukcji. Wiele konstruktów każdego białka docelowego zwiększa prawdopodobieństwo pomyślnego określenia struktury i wydłuża czas realizacji. Nieuniknione jest, że niektóre konstrukty białkowe ulegną awarii na etapach rurociągu. Implementacja metody klonowania PIPE wspiera metodę MTPP, umożliwiając generowanie wielu konstruktów w formacie 96-dołkowym bez pracochłonnych etapów oczyszczania. Połączenie klonowania PIPE z możliwością analizy ekspresji białka w tym samym formacie 96-dołkowym (Caliper LabChip 90) jeszcze bardziej przyspiesza ogólny przepływ. Połączenie tych metod pozwala na szybką identyfikację konstruktów wytwarzających rozpuszczalne białko, co zapewnia sukces produkcji i oczyszczania białek na dużą skalę.

Istotnym aspektem sukcesu wysokowydajnego MTPP jest instrument Protein Maker (patent USA nr 6818060, Emerald Bio). Protein Maker to 24-kanałowy równoległy system chromatografii cieczowej opracowany specjalnie w celu zwiększenia wydajności wysokoprzepustowej produkcji białek i powiązanych zastosowań badawczych w zakresie strukturalnego genomu. Korzystając z wcześniej opisanego protokołu dla Protein Maker, zalety są widoczne w porównaniu z jednoliniowym systemem FPLC. Jedna osoba może oczyścić do 48 celów równolegle w ciągu ośmiu godzin. W przeciwieństwie do tego, jedna osoba korzystająca z jednego liniowego systemu FPLC może oczyścić maksymalnie cztery cele w tym samym czasie. Wysoki poziom czystości dla każdego celu osiągnięty za pomocą Protein Maker jest kluczowym czynnikiem w późniejszym sukcesie hodowli kryształów białkowych do analizy struktury.

Ograniczenia i rozwiązywanie problemów

Rozwiązywanie trójwymiarowych struktur za pomocą krystalografii rentgenowskiej to wieloetapowy wysiłek z wieloma wyzwaniami, z których jednym jest brak możliwości uzyskania dużych ilości rozpuszczalnego białka docelowego. Jedną ze strategii, którą można wdrożyć w celu przezwyciężenia problemu rozpuszczalności, jest użycie alternatywnego gospodarza ekspresji, ponieważ komórki E. coli nie są w stanie przeprowadzić kilku ważnych eukariotycznych modyfikacji potranslacyjnych. Ekspresja w różnych liniach komórkowych drożdży, owadów i ssaków, które są zdolne do przeprowadzania tych modyfikacji potranslacyjnych, jest często odpowiednią alternatywą. Białka docelowe ulegają czasami ekspresji, ale są całkowicie nierozpuszczalne w standardowych warunkach lizy. Protein Maker może być cennym źródłem do szybkiego testowania alternatywnych warunków lizy komórek, jak opisano w Smith i wsp. 2011 ¹³. Ta strategia jest często konieczna, aby utrzymać cele w ruchu przez potok. W każdym potoku genomiki strukturalnej ustandaryzowane protokoły mogą nie być odpowiednie dla każdego celu, który przechodzi przez potok, a cele mogą wymagać indywidualnej optymalizacji. Na przykład zdecydowaliśmy się na użycie 20% glikolu etylenowego do każdego krioprotektoru. W przypadkach, gdy ten warunek nie jest odpowiedni, może być konieczne przetestowanie alternatywnych krioprotektantów lub stężeń.

Ze względu na unikalny charakter każdego pojedynczego białka docelowego, ograniczającym szybkość i nieprzewidywalnym krokiem w określaniu struktury jest krystalizacja. Linia MTPP kompensuje zwykle niski wskaźnik sukcesu krystalizacji białek dzięki optymalizacji na podstawie początkowych rzadkich badań przesiewowych matrycy. Każde początkowe trafienie kryształu z dostępnych na rynku rzadkich ekranów matrycowych jest dodatkowo optymalizowane za pomocą E-Screen Builder (Emerald Bio). Ekran optymalizacyjny został zaprojektowany w oparciu o stan początkowego uderzenia kryształu, zmieniając stężenia, soli i dodatków. Udane ekrany optymalizacyjne dają kryształy odpowiednie do badań dyfrakcyjnych i określania struktury.

Program genomiki strukturalnej opracowany przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) zapewnia finansowanie Emerald Bio i trzem innym instytucjom z północno-zachodniego Pacyfiku, które razem tworzą SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington i Pacific Northwest National Laboratory). Każdy z członków konsorcjum został wybrany ze względu na ich doświadczenie w stosowaniu najnowocześniejszych technologii niezbędnych do osiągnięcia celów programu genomiki strukturalnej NIAID. Do tej pory SSGCID zdeponował 461 struktur w PDB, co plasuje go na siódmym miejscu pod względem wielkości współtwórcy na świecie, a w 2011 r. pod względem produktywności. Protokoły i metodologie SSGCID zostały opracowane z myślą o przyniesieniu korzyści społeczności naukowej i utrwaleniu badań nad chorobami zakaźnymi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Startery	IDT
Geny	DNA 2.0
TE bufor	Qiagen	dostarczany w zestawie
96-dołkowe płytki półspódniczkowe PCR	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X Pomarańczowy barwnik ładujący	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9414-10G
pET28 wektor
2-YT Bulion	VWR	101446-848
Kanamycyna	Teknova	K2151
Enzymy restrykcyjne	Fermentas
QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen	28704
Top 10 komórek chemicznie comp	Jednorazowe koryta Invitrogen	C4040-06
(sterylne, 25 ml)	VWR	89094-662
Osłony Airpore (folie ze sztucznego jedwabiu do hodowli biologicznych)	VWR	60941-086
Bloki 24-dołkowe	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
BL21(DE3) chemcomp (phageR)	NEB	C2527H
50% Glicerol	VWR	100217-622
TB Media	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glicerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazol	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginina	Amresco	0877-500G
Benzonaza	EMD	70746-3
Lizozym	USB	1864525GM
10 kDa Rurka do dializy MWCO	Thermo	68100
Koncentratory Amicon Ultra 10 ka MWCO	Kolumny Millipore	UFC901024
HisTrap FF	GE	17-5255-01
HiTrap Kolumny chelatujące	GE	17/0408-01
Kompaktowe płytki krystalizacyjne Jr	Emerald Bio	EBS-XJR
Sita krystaliczne	Emerald Bio
Etylen Glikol 100%	Szmaragd Bio	EBS-250-EGLY
Kryształowa różdżka magnetyczna prosta	Hampton Research	HR4-729
Zamontowana pętla CryoLoop 0,1-0,2 mm	Hampton Research	HR4-955
Krążek
Różdżka
Wygięte szczypce Popychacz
	krążków