Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Podsumowanie

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Streszczenie

Pandemiczne ogniska wysoce zjadliwych szczepów grypy mogą powodować powszechną zachorowalność i śmiertelność w populacjach ludzkich na całym świecie. W samych Stanach Zjednoczonych infekcje wirusem grypy powodują średnio 41 400 zgonów i 1,86 miliona hospitalizacji rocznie ¹. Mutacje punktowe w podjednostce białka polimerazy podstawowej 2 (PB2) powiązano z adaptacją infekcji wirusowej u ludzi ². Wyniki takich badań ujawniły biologiczne znaczenie PB2 jako czynnika wirulencji, podkreślając tym samym jego potencjał jako celu dla leków przeciwwirusowych.

Program genomiki strukturalnej realizowany przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) zapewnia finansowanie firmie Emerald Bio oraz trzem innym instytucjom z regionu Pacyficznego Północnego Zachodu, które wspólnie tworzą Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). SSGCID zajmuje się dostarczaniem społeczności naukowej trójwymiarowych struktur białkowych patogenów kategorii A-C według klasyfikacji NIAID. Udostępnianie takich informacji strukturalnych środowisku naukowemu służy przyspieszeniu projektowania leków w oparciu o strukturę białek.

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do osiągnięcia wielu celów znacząco zwiększa szansę na sukces w odkrywaniu nowych związków wiodących poprzez celowanie w konkretną ścieżkę sygnałową lub całą rodzinę białek. Firma Emerald Bio opracowała wysokoprzepustowy potok przetwarzania równoległego dla wielu celów (MTPP) do wyznaczania struktur na podstawie genów, aby wesprzeć konsorcjum. W niniejszym materiale opisujemy protokoły wykorzystane do wyznaczenia struktury podjednostki PB2 z czterech różnych szczepów grypy A.

Protokół

Przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1.

Biologia molekularna

1. Projekt konstrukcji

Użyj oprogramowania Gene Composer do zaprojektowania konstruktu białkowego i syntetycznych sekwencji genów z optymalizacją kodonów. Szczegółowe informacje na temat korzystania z oprogramowania Gene Composer zostały przedstawione w innym opracowaniu ³.

1. Użyć modułu Alignment Viewer oraz modułu Construct Design w celu porównania dopasowań sekwencji białkowych i zdefiniowania konstruktu białkowego. Dopasować docelową sekwencję aminokwasową zarówno do elementów struktury pierwotnej, jak i 3D homologów z Protein Data Bank (PDB), jeśli są dostępne (Rycina 2).
2. Wykorzystać informacje o dopasowaniu do zaprojektowania konstruktu w oparciu o strukturę, wybierając nowe końce na podstawie konserwacji struktury pierwotnej i struktur 3D homologów.
3. Zaprojektować amplikony do PCR wkładu (iPCR) i PCR wektora (vPCR) (startery terminalne).
4. Używając algorytmu białko-DNA w programie Gene Composer, przeprowadzić odwrotną translację sekwencji aminokwasowej konstruktu na engineered sekwencję nukleotydową z optymalizacją kodonów.
5. Użyć odpowiedniej tabeli użycia kodonów (CUT), aby zoptymalizować sekwencję pod kątem ekspresji w E. coli.
6. Przeprowadzić wirtualne klonowanie wkładu do wektora pET28 zmodyfikowanego w celu wprowadzenia N-terminalnego znacznika 6x Histydyna oraz białka fuzyjnego Smt3/SUMO, co umożliwia łatwe oczyszczanie.
7. Złożyć zamówienie na syntetyczny gen w firmie DNA 2.0 oraz zamówić startery w Integrated DNA Technologies.

2. Klonowanie metodą niepełnego przedłużania starterów przez polimerazę (PIPE)

1. Przygotowanie starterów i genów
   1. Odwiruj dostarczone przez dostawcę płytki zawierające startery przy 1 000 rpm przez 1 min.
   2. Doprowadź stężenie starterów do 100 μM, dodając 50 μl buforu TE.
   3. Rozcieńcz startery do stężenia 10 μM wodą dejonizowaną (DI) w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V.
   4. Odwiruj dostarczony przez dostawcę gen w probówce 1,5 ml przy 1 300 rpm przez 1 min.
   5. Za pomocą buforu TE doprowadź stężenie DNA w każdej probówce do 50 ng/μl.
   6. W probówkach 1,5 ml wykonaj rozcieńczenia każdego startera do stężenia 10 ng/μl.
   7. Przechowuj startery i geny w temperaturze -20 °C, gdy nie są używane.
2. Przygotowanie PCR wstawki (iPCR)
   1. Rozmroź fiolkę Pfu Master Mix na lodzie; geny i startery pozostaw w temperaturze pokojowej.
   2. Stwórz mapę płytki, przypisując dołki do zestawu starterów i konstruktu.
   3. Dodaj 13 μl wody DI do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR.
   4. Dodaj 5 μl startera forward i 5 μl startera reverse do każdej reakcji w 96-dołkowej płytce zgodnie z mapą płytki, pamiętając o zmianie końcówek między każdym dołkiem.
   5. Dodaj 2 μl każdego genu o pełnej długości do odpowiedniego dołka zgodnie z mapą płytki.
   6. Dodaj 25 μl Pfu master mix do każdego dołka, pamiętając o zmianie końcówek między każdym dołkiem.
   7. Przeprowadź cykle reakcji, stosując następujące warunki PCR:
      1. 95 °C 2 min
      2. 95 °C 30 sec
      3. 50 °C 45 sec
      4. 68 °C 3 min
      5. 4 °C ∞
   8. Powtórz kroki b-d przez 25 cykli.
   9. Przenieś 10 μl każdej reakcji iPCR do nowej 96-dołkowej płytki PCR.
   10. Dodaj 3 μl barwnika do nakładania 6X load dye do każdej próbki.
   11. Rozdziel każdą próbkę na 1% żelu agarozowym TAE EtBr przy 110 V obok drabinki DNA 100-500 bps, aby potwierdzić amplifikację fragmentu.
   12. Przechowuj produkt iPCR w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany (unikaj zamrażania i rozmrażania w miarę możliwości).

3. Przygotowanie reakcji vPCR (Vector PCR)

1. Rozpocznij nocną hodowlę przetransformowanych E. coli z plazmidem wektorem pET28.
   1. Zaszczep dwie probówki o pojemności 5 ml z pożywką 2-YT zawierającą 50 μg/ml kanamycyny.
   2. Hoduj kultury przez noc w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przy 220 rpm.
2. Odwiruj kultury po nocnym wzroście, centrugując je przy 3,000 rpm przez 15 min.
3. Użyj zestawu Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit do wyizolowania wektora pET28 z osadów bakteryjnych zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Przygotuj trawienie enzymami restrykcyjnymi wyizolowanego plazmidu pET28.
   1. Dodaj 2,2 μl buforu BamHI 10X oraz 1 μl enzymów BamHI i HindIII do 20 μl wektora pET28.
   2. Inkubuj reakcję przez 1 h w temperaturze 37 °C.
5. Rozdziel produkt trawienia na żelu.
   1. Patrz krok 2.2.10.
   2. Wytnij prążek wektora z żelu i oczyść go za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Oznacz stężenie DNA za pomocą NanoDrop.
7. Rozcieńcz wycięty wektor do stężenia 10 ng/μl. Przechowuj w temperaturze -20 °C, gdy nie jest używany.
8. Przygotuj primery do vPCR.
   1. Centryguj dostarczone przez IDT oligonukleotydy przez 1 min przy 1,300 rpm.
   2. Doprowadź stężenie do 100 μM za pomocą wody destylowanej.
   3. Przygotuj rozcieńczenie 10 μM dla obu primerów (forward i reverse) w probówce 1,5 ml.
   4. Przechowuj primery oraz ich rozcieńczenia w temperaturze -20 °C.
9. Rozmroź Pfu Master Mix na lodzie, a matrycę i primery w temperaturze pokojowej.
10. Przygotuj reakcje vPCR w 96-dołkowej płytce PCR:
    1. W pierwszym rzędzie 96-dołkowej płytki połącz 60 μl obu primerów vPCR (forward i reverse) oraz 24 μl strawionej matrycy pET28 (10 ng/μl).
    2. Za pomocą wielokanałowej pipety 12-koncentrycznej przenieś 12 μl mieszaniny master mix primerów i matrycy do każdego z pozostałych dołków płytki. Powinno to skutkować obecnością 12 μl mieszaniny master mix primerów i matrycy w każdym dołku.
    3. Dodaj 13 μl wody destylowanej do każdego dołka.
    4. Dodaj 25 μl Pfu Master Mix do każdego dołka.
11. Przeprowadź reakcje zgodnie z warunkami PCR opisanymi w kroku 2.2.7.
12. Złącz wszystkie reakcje vPCR w probówce Falcon 15 ml.
13. Zweryfikuj amplifikację fragmentu, rozdzielając 10 μl połączonego produktu PCR na żelu (oczekiwana długość strawionego wektora pET28 wynosi około 6 kb).
    1. Patrz krok 2.2.10.
14. Przygotuj płytki do łączenia.
    1. Aliquotuj 3 μl produktu vPCR do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
    2. Przechowuj płytki w temperaturze -20 °C do czasu połączenia z produktem iPCR.

4. Łączenie produktów iPCR i vPCR

1. Od thawing produktów iPCR oraz wcześniej przygotowanej 96-dołkowej płyty do łączenia vPCR w temperaturze pokojowej.
2. Dodaj 3 μl każdego produktu iPCR do odpowiedniego dołka płyty do łączenia.
3. Przeprowadź transformację płyty do łączenia do chemicznie kompetentnych komórek Top Ten.
4. Dodaj 2 μl każdej reakcji łączenia do pojedynczej probówki o pojemności 50 μl zawierającej chemicznie kompetentne komórki dostarczone przez producenta i postępuj zgodnie z protokołem producenta.
5. Przygotuj nocne hodowle dla każdego konstruktu z płyty transformacyjnej.
6. Odlej 5 ml pożywki TB (z 50 μg/ml kanamycyną) z 25 ml sterylnego zbiornika do każdego dołka bloku z głębokimi dołkami.
7. Stosując technikę sterylną, pobierz pojedynczą kolonię z każdej płyty transformacyjnej i zaszczep odpowiedni dołek bloku z głębokimi dołkami.
8. Przykryj blok pokrywą Airpore.
9. Inkubuj blok z wytrząsaniem przy 220 rpm w temperaturze 37 °C przez noc.
10. Ulgreguj komórki poprzez wirowanie bloku przez 30 min przy 4,000 rpm.
11. Zlej supernatant i osusz górną część bloku ręcznikiem papierowym.
12. Wykonaj mini-prep za pomocą 96-dołkowego aparatu próżniowego Qiagen zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Przygotowanie zapasów glicerynowych pomyślnie sklonowanych konstruktów

1. Przenieś zwalidowany DNA z pomyślnie sklonowanej sekwencji do chemicznie kompetentnych komórek BL21(DE3) zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Dla każdego konstruktu wybierz pojedynczą odizolowaną kolonię z transformacji BL21(DE3) i zaszczep do 1 ml pożywki 2-YT (z dodatkiem 50 μg/ml kanamycyny).
3. Kultury inkubuj z wytrząsaniem przy 220 rpm przez 3-4 hr w temperaturze 37 °C.
4. Oznacz probówkę z nakrętką o pojemności 1,5 ml unikalnym numerem identyfikacyjnym konstruktu, szczepem komórkowym i datą. Dodaj 500 μl 50% glicerolu oraz 500 μl kultury komórkowej i odwróć probówkę kilka razy. Przechowuj zapas glicerolowy natychmiast na suchym lodzie lub w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

6. Testowanie ekspresji

Bufor lizującyr	Bufor płuczący	Bufor elucyjny
50 mM NaH2PO4, pH 8,0 300 mM NaCl 10 mM imidazolu 1% Tween 20 2 mM MgCl22 0,1 μl/ml Benzonazy 1 mg/ml lizozymu	50 mM NaH2PO4, pH 8,0 300 mM NaCl 20 mM imidazolu 0,05% Tween 20	25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazolu 0,05% Tween 20

* Bezpośrednio przed lizą dodać Benzonazę, lizozym oraz inhibitor proteaz.

1. Wysiać próbkę z banku glicerolu na agar selekcyjny z kanamycyną i inkubować przez noc w 37 °C.
2. Przygotować nieindukującą prekulturę w 96-dołkowym bloku z dnem okrągłym; zaszczepić 1,2 ml pożywki TB (z 50 mg/ml kanamycyny) uzupełnionej o 0,5% glukozy świeżo wyhodowanym izolatem E. coli. Hodować przez noc przy wytrząsaniu 220 rpm w 37 °C.
3. Po nocnej hodowli przygotować kultury indukcyjne, szczepiąc 1,2 ml pożywki TB (z 50 mg/ml kanamycyny) uzupełnionej systemem Novagen Overnight Express System 1 (zgodnie z protokołem producenta) za pomocą 40 μl prekultury.
4. Hodować małoscale kultury indukcyjne w 20 °C przez 48 hr, wytrząsając przy 220 rpm.
5. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 4,000 rpm przez 15 min, odlać nadsącz i przechowywać w -20 °C przez co najmniej 1 hr przed dalszą obróbką.
6. W bloku 96-dołkowym resuspender osady komórkowe w 300 μl buforu do lizy.
7. Inkubować komórki w buforze do lizy w temperaturze pokojowej przez 30 min, a następnie przeprowadzić lizę mechaniczną poprzez energiczne wytrząsanie przez 30 min w temperaturze pokojowej.
8. Klarować surowy lizat poprzez wirowanie przez 30 min przy 4,000 rpm w 4 °C.
9. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 200 μl sklarowanego lizatu (frakcja rozpuszczalna) do 96-dołkowej płytki z dnem płaskim (Qiagen). Do każdego dołka zawierającego próbkę dodać 40 μl magnetycznych kulek Ni-NTA (Qiagen).
10. Delikatnie agitować płytkę na kołysarce przez 1 hr w 16 °C.
11. Umieścić płytkę na magnetycznym stojaku do płytek (Qiagen) i usunąć niezwiązaną frakcję rozpuszczalną. Należy uważać, aby nie odpipetować żadnych kulek Ni-NTA.
12. Zdjąć płytkę ze stojaka i delikatnie resuspender kulki w 200 μl buforu piorącego. Pipetować w górę i w dół przez 30 sec, a następnie ponownie umieścić płytkę na stojaku.
13. Usunąć bufor piorący i powtórzyć krok 6.12.
14. Zdjąć płytkę ze stojaka i eluować związane z Ni-NTA białko docelowe, płucząc 50 μl buforem eluującym przez 5 min.
15. Ponownie umieścić płytkę z dnem płaskim na magnetycznym stojaku i przenieść eluat do nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V.
16. Przenieść 20 μl eluatu do nowej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i przeprowadzić reakcję z 1 μl proteazy ULP1.
17. Zgodnie z protokołem producenta przeanalizować frakcję eluowaną oraz frakcję eluowaną z Ulp1 za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu urządzenia LabChip 90.
18. Alternatywnie, wszystkie frakcje z testów ekspresji można przeanalizować za pomocą SDS-PAGE.

7. Fermentacja na dużą skalę

1. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety pobrać próbkę z zapasu w glicerolu, zaszczepić 100 ml bulionu TB (z dodatkiem 50 mg/ml kanamycyny) i inkubować przez noc. Inkubować w wytrząsarce przy 220 rpm i 37 °C.
2. Po nocnej inkubacji powiększyć kulturę wstępną, szczepiąc 1 L bulionu TB z roztworami do autoindukcji EMD (zgodnie z protokołem producenta) (z dodatkiem 50 mg/ml kanamycyny) w kolbie z przegrodami o pojemności 2 L, dodając 10 ml kultury wstępnej (rozcieńczenie 1:100).
3. Kultury o objętości 1 L inkubować w wytrząsarce przy 37 °C; po osiągnięciu gęstości optycznej 0,6 (OD₆₀₀) zmienić temperaturę w inkubatorze wytrząsającym na 20 °C.
4. Po nocnej inkubacji pobrać reprezentatywną alikwot 10 ml z każdego konstruktu do testów ekspresji.
5. Zebrać osad komórkowy przez wirowanie przy 5 000 rpm przez 15 min i odrzucić nadsącz.
6. Zamrozić osad komórkowy w temperaturze -80 °C.

OCZYSZCZANIE BIAŁEK

Bufory:

Bufor lizujący	Bufor A (Równoważenie)	Bufor B (eluujący)	Bufor kolumny do frakcjonowania według wielkości
25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 0,5% glicerolu 0,02% CHAPS 10 mM imidazolu 1 mM TCEP 50 mM argininy 5 μl Benzonazy 100 mg lizozymu 3 tabletki inhibitora proteaz (bez EDTA)	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 10 mM imidazolu 1 mM TCEP 50 mM argininy 0,25% glicerolu	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 200 mM imidazolu 1 mM TCEP	25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 1% glicerol 1 mM TCEP

* Bezpośrednio przed lizą do każdej 150 ml próbki dodać Benzonazę, lizozym oraz tabletki z inhibitorem proteazy.

8. Lizą komórek

1. Przygotować 2 L buforu do lizy; nie dodawać lizozymu, tabletek inhibitorów proteaz ani benzonukleazy (każda próbka będzie lizowana oddzielnie w 150 ml buforu do lizy).
2. Rozmrozić i resuspender pastę komórkową w buforze do lizy w stosunku masy do objętości 1:5, energicznie mieszając przez 30 min w temperaturze 4 °C. Odrywać grudki od ścianek zlewki, używając czystej szpatułki. W tym czasie przygotować bufory Ni oraz do dializy.
3. W warunkach chłodzenia na lodzie przeprowadzić lizę komórek za pomocą sonikatora Misonix (moc 70%, impulsy 2 s włączone/1 s wyłączone przez 3 min), delikatnie obracając naczyniem, aby zapobiec przegrzaniu. Odłożyć niewielką (200 μl) alikwotę surowego lizatu do późniejszej analizy.
4. Oczyścić surowy lizat poprzez wirowanie przy 18,000 x g przez 35 min w temperaturze 4 °C, zebrać naddatek i odłożyć niewielką (200 μl) alikotę do późniejszej analizy. Przechowywać osad w temperaturze 4 °C do momentu potwierdzenia, że białko zostało poddane lizie do frakcji rozpuszczalnej.

9. Konfiguracja Protein Maker przed uruchomieniem

1. Przy włączonym urządzeniu do oczyszczania białek i uruchomionym oprogramowaniu, przeprowadź inicjalizację instrumentu.
2. Po inicjalizacji podłącz jedną kolumnę Ni-chelatową 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF (kolumna Ni) do oddzielnej linii statywu dla każdej z próbek.
3. Przepuść przez każdą kolumnę 3-4 objętości kolumny (CV) buforu równoważącego.
4. Odpowietrz linie buforu równoważącego i buforu elucyjnego.
5. Zrównoważ kolumny, aspirując bufor A przez kolumnę raz.

10. Kolumna z niklem 1 (Ni1)

1. Przemyj każdą kolumnę 20 ml wody Milli-Q, aby usunąć bufor do przechowywania. Przepuść 5 ml buforu B oraz 25 ml buforu A w celu równoważenia.
2. Nałóż oczyszczony lizat zawierający rozpuszczone białko na kolumny z prędkością 2 ml/min, a następnie przemyj kolumny 15 ml buforu A.
3. Eluuj związane białko w gradiencie skokowym za pomocą buforów A i B w następujących proporcjach odpowiednio: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Zbieraj każdą frakcję elucji osobno.
4. Przeanalizuj za pomocą SDS-PAGE: frakcje elucyjne, surowy lizat, oczyszczony lizat oraz przelew. Połącz frakcje zawierające białko i użyj Nanodrop do pomiaru A₂₈₀ w celu przybliżonego określenia ilości obecnego białka.

11. Rozszczepianie ULP1

1. Zachowaj niewielką aliquotę (250 μl) puli z kolumny Ni1 do późniejszej analizy żelowej. Pozostałą część puli Ni1 doprowadź do objętości 10 ml i dodaj proteazę 1 podobną do ubikwityny (ULP1) w ilości 1 μl/5 mg całkowitego białka, aby usunąć znacznik powinowactwa His-Smt.
2. Dializuj pulę Ni1 + ULP1 przeciwko 2 L buforu A przez 4 hr w temperaturze 4 °C, używając membrany z progiem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 10 kDa na mieszalniku magnetycznym w temperaturze 4 °C.
3. Po dializie przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE puli Ni1 oraz puli Ni1 + ULP1, aby sprawdzić, czy cięcie przez ULP1 przebiegło pomyślnie.

12. Kolumna niklowa 2 (Ni2)

1. Nałóż cięte białko na tę samą kolumnę Ni i powtórz krok 9.3 przy zmniejszonej prędkości przepływu 1 ml/min. Odcięty znacznik zwiąże się z kolumną, a docelowe białko bez znacznika przejdzie w części przepływowej. Zbierz frakcję przepływową do nowego pojemnika.
2. Przemyj kolumnę Ni 3 ml buforu A, a następnie 5 ml buforu B, aby eluować wszystkie białka zTagged His oraz białka związane nieswoiście. Zbieraj każdą frakcję oddzielnie.
3. Wykonaj elektroforezę SDS-PAGE frakcji przepływowej Ni2, frakcji płukania oraz frakcji elucji Ni2, aby potwierdzić cięcie przez ULP1 i obecność białka w części przepływowej. Użyj spektrofotometru Nanodrop do pomiaru A₂₈₀ w celu przybliżonego określenia obecności białka.

13. Koncentrowanie

1. Skoncentrować frakcję przepływową Ni2 (oraz eluat Ni2, jeśli obecne jest białko) do objętości 5 ml, używając probówki do wirowania Amicon Ultra 10 kDa MWCO. Wirować w odstępach 10 min przy 4 000 rpm w temperaturze 4 °C. Po każdym wirowaniu wymieszać zawartość za pomocą pipety, aby zapobiec nadmiernej koncentracji białka wzdłuż membrany.

14. Chromatografia żelowa (SEC)

1. Przygotować kolumnę Sephacryl S-100 10/30 GL (GE healthcare), równoważąc ją 200 ml buforu SEC przy szybkości przepływu 0,5 ml/min w systemie AKTApurifier (GE Healthcare).
2. Przygotować superloopy o pojemności 10 ml do użycia w kolumnie SEC zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml nanieść próbki na superloopy i rozpocząć rozdział SEC.
4. Monitorować przebieg absorbancji UV przy 280 nm podczas zbierania frakcji o małej objętości.
5. Przeprowadzić analizę frakcji SEC za pomocą SDS-PAGE.
6. Połączyć frakcje SEC wykazujące najwyższą intensywność prążków.
7. Skoncentrować połączone frakcje SEC. Patrz krok 13.1.
8. Rozdzielić białko na próbki po 100 μl, zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

KRYSTALIZACJA

15. Krystalizacja białek

1. Napełnij uprzednio każdy dołek 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej Compact Jr (Emerald Bio) 80 μl wybranego roztworu warunków krystalizacji (Emerald Bio).
2. Rozcieńcz białko w buforze do określonej wielkości do stężenia 2-20 mg/ml i przechowuj na lodzie.
3. Nanieś 0,4 μl białka oraz 0,4 μl roztworu warunków krystalizacji do każdego z 96 dołków, a następnie zaklej płytkę przezroczystą taśmą uszczelniającą (Manco).
4. Przechowuj płytkę w temperaturze 16 °C, okresowo sprawdzając w ciągu następnych kilku tygodni pod mikroskopem stereoskopowym, czy doszło do krystalizacji białka.

16. Zbieranie kryształów

1. Przygotuj krioprotektant z ługu macierzystego i glikolu etylenowego. Odetnij przezroczystą taśmę pokrywającą dołek z kryształem docelowego białka. Do pustego dołka dodaj 1,6 μl odpowiedniego warunku krystalizacji i połącz z 0,4 μl glikolu etylenowego, aby uzyskać końcowe stężenie 20% glikolu etylenowego i 80% warunku krystalizacji. Uwaga: aby zoptymalizować dyfrakcję kryształów, należy wypróbować różne krioprotektanty, takie jak: glicerol, oleje, glikole polietylenowe o niskiej masie cząsteczkowej i/lub zastosować różne stężenia krioprotektanta.
2. Przed pobieraniem schłodź puck typu ALS w naczyniu typu dewar wypełnionym ciekłym azotem i przykryj go pokrywką.
3. Pobierz kryształ, umieszczając CryoLoop o średnicy wewnętrznej odpowiadającej rozmiarowi kryształu na Magnetycznej Różdżce do Kryształów (Hampton Research), a następnie wybierz go bezpośrednio z roztworu w dołku.
4. Natychmiast zanurz CryoLoop z pobranym kryształem w krioprotektancie, a następnie przenieś do pucka typu ALS, aby gwałtownie zamrozić kryształ. Powtórz czynność dla pożądanej liczby kryształów.

17. Przesiewanie kryształów/zbieranie danych

1. Po zakończeniu zbioru kryształów należy użyć pręta do pucków, aby nałożyć magnetyczną pokrywkę cryo-puck na puck ALS. Następnie, za pomocą wygiętych pincet, należy odwrócić puck do góry dnem.
2. Przenieść puck do naczynia Rigaku ACTOR dewar, przykręcić do niego wypychacz (Puck Pusher) i odbić pokrywkę, pozostawiając ją w naczyniu dewar z pinami skierowanymi do góry.
3. Za pomocą oprogramowania JDirector należy prześwietlić każdy kryształ przy następujących parametrach: szczelina wiązki ustawiona na 0,5 stopnia, odległość detektora ustawiona na 50 mm, krok obrazu na 70 stopni oraz czas ekspozycji ustawiony na 30 s.
4. Uruchomić program Mosflm dla obrazów testowych wykonanych w JDirector, aby określić najlepszy kryształ oraz strategię zbierania danych.
5. Zebrać pełny zestaw danych na podstawie wyników uzyskanych z programu Mosflm.

18. Przetwarzanie danych/Wyznaczanie struktury

1. Uruchom program XDS/XSCALE ⁴ w celu przetworzenia zestawu danych.
2. Otwórz pakiet oprogramowania CCP4.
   1. Uruchom program Phaser ⁵, aby obliczyć rozwiązanie metodą wymiany molekularnej, wykorzystując model wyszukiwania o wysokiej homologii, jeśli jest dostępny. W tym przypadku jako model wyszukiwania zastosowano PDBID 3CW4 ⁶.
   2. Uruchom program Refmac ⁷, aby doprecyzować model molekularny w odniesieniu do obserwowanych refleksów zebranych w zestawie danych. Rozdzielczość końcowa powinna opierać się na najwyższej powłoce i być określona przez następujące parametry: czynnik R > 50%, I/sigma > 2 oraz kompletność > 90%.
3. Zbuduj trójwymiarowy model gęstości elektronowej przy użyciu oprogramowania do grafiki molekularnej COOT ⁸.
4. Przed zdeponowaniem struktury w PDB zweryfikuj ją za pomocą oprogramowania MolProbity ⁹, aby upewnić się, że jakość struktury jest odpowiednia do depozycji.

Wyniki

Poniższe wyniki ilustrują spodziewane rezultaty opisanego protokołu, a w przypadku PB2 – wyniki zaobserwowane.

Za pomocą programu Gene Composer zaprojektowano pięć pełnowymiarowych sekwencji aminokwasowych docelowych dla podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy (Rysunek 2). Sekwencje PB2 poddano odwrotnej translacji oraz licznym etapom inżynierii genetycznej ³, co pozwoliło na uzyskanie sekwencji o zharmonizowanych kodonach, zoptymalizowanych pod kątem ekspresji w E. coli. Z produktów iPCR (Rysunek 3b) łącznie trzydzieści cztery konstrukty zostały pomyślnie sklonowane do zmodyfikowanego systemu wektorów pET28 ¹⁰ z N-końcowym tagiem fuzyjnym 6x His-Smt przy użyciu metody klonowania PIPE ³, jak pokazano na Rysunku 3a. Podsumowanie schematu klonowania przedstawiono na Rysunku 4.

Po pomyślnym klonowaniu przetestowano mikro-skalową ekspresję białka dla każdego konstruktu w komórkach E. coli BL21(DE3). Komórki hodowano w pożywce TB uzupełnionej o medium Novagen Overnight Express 1 (zgodnie z protokołem producenta) przez 48 hr w temperaturze 20 °C w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 220 rpm. Po wzroście komórki zebrano i sprawdzono ekspresję rozpuszczalnego białka za pomocą elektroforezy kapilarnej z użyciem systemu Caliper LabChip 90. Czternaście z trzydziestu czterech konstruktów PB2 doprowadziło do powstania rozpuszczalnego białka docelowego i zakwalifikowano je do fermentacji w dużej skali. Kultury każdego konstruktu w dużej skali hodowano w pożywce TB uzupełnionej o medium Novagen Overnight Express 1 zgodnie z protokołem producenta. Po wzroście komórki zebrano poprzez wirowanie i przechowywano w temperaturze -80 °C. Ekspresję białka w dużej skali dla każdej kultury potwierdzono za pomocą analizy SDS-PAGE (Rysunek 5) przed przystąpieniem do oczyszczania w dużej skali.

Do równoległego oczyszczania czternastu konstruktów PB2 wykorzystano Protein Maker. Klarowne lizaty wszystkich czternastu konstruktów przepuszczono przez kolumnę z chelatem niklu. Po określeniu za pomocą SDS-PAGE, które frakcje zawierają białko docelowe, odpowiednie frakcje dla każdej próbki zostały połączone, a ich stężenie określono poprzez pomiar A₂₈₀. Usunięcie znacznika 6x His-Smt przeprowadzono poprzez dodanie ULP1, a następnie dializę przez noc i ponowne przepuszczenie przez kolumnę niklową. Potwierdzenie usunięcia znacznika His-Smt wykonano za pomocą SDS-PAGE (Rycina 6), a każdą próbkę zagęszczono w probówkach wirówkowych Amicon Ultra 10 kDa. Po zagęszczeniu w probówkach Amicon Ultra każdą próbkę przepuszczono przez kolumnę do wykluczania cząsteczkowego, aby uzyskać czystość krystalograficzną. Przeprowadzono drugie zagęszczenie, aby zwiększyć stężenie białka do poziomu niezbędnego do krystalizacji. Wszystkie czternaście konstruktów zostało pomyślnie oczyszczonych i wprowadzonych do prób krystalizacji.

Krystalizację rozpoczęto od rozmrożenia wcześniej zamrożonego białka. Krystalizacja była przeprowadzana w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze 16 °C przy użyciu specjalnie zaprojektowanych płytek (Emerald Bio) do dyfuzji pary w metodzie siedzącej kropli (Rysunek 7). Wstępny screening przeprowadzono z wykorzystaniem czterech ekranów rzadkiej macierzy: JCSG+, Pact, Wizard Full oraz CryoFull (Emerald Bio), zgodnie z rozszerzoną strategią Newmana. Następnie 0,4 μl roztworu białka zmieszano z 0,4 μl krystalizatora (lub roztworu z rezerwuaru) z odpowiadającego rezerwuaru, używając 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych Compact Jr (Emerald Bio). Z czternastu oczyszczonych próbek dziewięć dało kryształy nadające się do badań dyfrakcyjnych (Rysunek 8). Wewnętrzny zestaw danych dyfrakcyjnych zebrano dla pięciu z dziewięciu skrystalizowanych konstruktów przy długości fali Cu Kα, używając generatora promieni rentgenowskich z anodą obrotową Rigaku SuperBright FR-E+ wyposażonego w optykę Osmic VariMax HF i detektor CCD Saturn 944+ (Rysunek 9). Każdy zestaw danych został przetworzony programem XDS/XSCALE⁴ i przeskalowany do końcowej rozdzielczości. Próby rozwiązania struktur metodą zamiany molekularnej przeprowadzono za pomocą programu Phaser ⁵ z pakietu CCP4 ⁷. Modele końcowe uzyskano po rafinacji w programie REFMAC ⁷ i ręcznej przebudowie w programie Coot ¹¹. Struktury oceniono i skorygowano pod kątem geometrii i dopasowania za pomocą programu MolProbity ⁹. W sumie wyznaczono cztery struktury podjednostki PB2 (Rysunek 10) i zdeponowano je w PDB. Rysunek 11 ilustruje ogólny wynik każdego etapu w potoku MTPP.

Rysunek 1. Przegląd ścieżki od genu do struktury SSGCID dla równoległego przetwarzania wielu celów w Emerald Bio.

Rysunek 2. Przeglądarka dopasowań i moduł projektowania konstruktów białkowych w oprogramowaniu Gene Composer. Bazowy konstrukt aminokwasowy celu pokazany jest na zielono (środkowe okno), a skrócenia alternatywnych konstruktów prowadzone zgodnie ze strukturą pokazane są na złoto (dolne okno). Przedstawiono dopasowanie wielu sekwencji PB2 wirusa grypy w porównaniu z sekwencją i elementami struktury drugorzędowej domeny C-końcowej z PDBID 3CW4. Znajomość struktury domeny i elementów struktury drugorzędowej pozwala na wybór skrócenia N-końcowego w module projektowania Gene Composer poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na pożądany resztę aminokwasu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Rycina 3a. Przedstawiono klonowanie metodą PIPE, w której syntetyczny insert genowy (pomarańczowy) jest amplifikowany za pomocą zaprojektowanych starterów forward (linie czerwono-pomarańczowe) i reverse (linie pomarańczowo-niebieskie) w celu otrzymania materiału PCR insertu. Wektor ekspresyjny jest amplifikowany za pomocą starterów reverse (linie czerwono-czarne) i forward (linie niebiesko-czarne) w celu otrzymania materiału PCR wektora. Sekwencje końcowe produktów iPCR są komplementarne do sekwencji końcowych produktów vPCR (czerwony fragment iPCR jest komplementarny do czerwonego fragmentu vPCR, a niebieski fragment iPCR do niebieskiego fragmentu vPCR). Pozwala to produktom iPCR i vPCR na hybrydyzację i utworzenie plazmidów, które są replikowane po transformacji do chemicznie kompetentnych komórek E. coli szczepu BL21(DE3).

Rysunek 3b. Analiza żelu agarozy produktów iPCR z podjednostki PB2. Niepowodzenia iPCR mogą objawiać się jako słabe lub rozmazane prążki, podczas gdy udane produkty iPCR są reprezentowane przez wyraźne prążki. Jakość produktu iPCR można zazwyczaj powiązać z sukcesem klonowania. Markery masy cząsteczkowej podano w kiloDaltons. Rysunek powielony z Raymond et al., 2011 ¹².

Rysunek 4. Etapy inżynierii genetycznej docelowych białek PB2 zostały wykonane przy użyciu oprogramowania Gene Composer. Po ustaleniu zmodyfikowanej sekwencji kwasu nukleinowego dla każdego celu, zaprojektowano po 6-7 alternatywnych konstruktów białkowych dla każdego z nich. Równoległe przetwarzanie wielu celów w początkowych etapach projektowania genów i klonowania zaowocowało 34 konstruktami, z których 14 okazało się celami zdolnymi do produkcji rozpuszczalnych białek w E. coli.

Rycina 5. Reprezentatywna analiza SDS-PAGE fermentacji w dużej skali, wykazująca silną ekspresję białka (oczekiwana wielkość 25,76 kDa), z czego około 50% jest rozpuszczalne (ścieżka 4) i około 50% stanowi produkt odszczepienia znacznika 6x His-Smt z eluowanego białka (ścieżka 7).

Rycina 6. Wyniki SDS-PAGE dla trzech konstruktów podjednostki PB2 polimerazy. Ścieżka 1, markery masy cząsteczkowej (oznaczone po lewej stronie w kDa); ścieżki 2, 6 i 10, połączone białka z kolumny niklowej 1; ścieżki 3, 7 i 11, przeływ odszczepionego białka w buforze A z kolumny niklowej 2; ścieżki 4, 8 i 12, usuwanie znacznika 6x His-Smt w buforze B z kolumny niklowej 2.

Rycina 7. Schemat dyfuzji pary metodą wiszącej kropli. Metoda siedzącej kropli w krystalizacji białek należy do kategorii dyfuzji pary. Metoda ta polega na równoważeniu oczyszczonej próbki białka i precypitantu z większym rezerwuarem zawierającym podobne warunki przy wyższym stężeniu. W miarę jak woda odparowuje z próbki białka i przechodzi do rezerwuaru, stężenie precypitantu wzrasta do poziomu optymalnego dla krystalizacji białek.

Rycina 8. Kryształ białkowy podjednostki PB2 polimerazy z szczepu wirusa grypy.

Rycina 9. Obraz dyfrakcji rentgenowskiej podjednostki PB2 polimerazy szczepu wirusa grypy.

Rycina 10. Schematy wstążkowe cząsteczek w krystalograficznej jednostce asymetrycznej 4 struktur PB2. Struktury drugorzędowe zaznaczone kolorami tęczy z odpowiadającymi im kodami PDB. (a) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A/Mexico/InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1).

Rysunek 11. Analiza wyników dla celów PB2 wirusa grypy przy użyciu opisanych metod. Proces wyznaczania struktury przedstawiono w pięciu etapach: klonowanie, rozpuszczalność, oczyszczanie, krystalizacja i wyznaczenie struktury.

Dyskusja

Równoległe przetwarzanie wielu celów

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w odkrywaniu nowych substancji leczniczych. Baza SSGCID jest dedykowana dostarczaniu społeczności naukowej trójwymiarowych struktur białek patogenów z kategorii A-C NIAID. Uczynienie takich informacji strukturalnych powszechnie dostępnymi będzie ostatecznie służyć przyspieszeniu projektowania leków w oparciu o strukturę.

Pierwszym krytycznym krokiem podejścia MTPP jest projektowanie konstruktów. Stosowanie wielu konstruktów każdego białka docelowego zwiększa prawdopodobieństwo pomyślnego wyznaczenia struktury i przyspiesza cały proces. Nieuniknione jest, że niektóre konstrukty białek nie przyniosą oczekiwanych rezultatów na poszczególnych etapach procedury. Wdrożenie metody klonowania PIPE wspiera metodę MTPP, umożliwiając generowanie wielu konstruktów w formacie 96-dołkowym bez czasochłonnych etapów oczyszczania. Połączenie klonowania PIPE z możliwością analizy ekspresji białek w tym samym formacie 96-dołkowym (Caliper LabChip 90) dodatkowo przyspiesza cały przepływ pracy. Połączenie tych metod pozwala na szybką identyfikację konstruktów produkujących rozpuszczalne białka, co zapewnia sukces w wielkoskalowej produkcji i oczyszczaniu białek.

Kluczowym elementem sukcesu wysokoprzepustowości MTPP jest instrument Protein Maker (US Patent No. 6818060, Emerald Bio). Protein Maker to 24-kanałowy równoległy system chromatografii cieczowej opracowany specjalnie w celu zwiększenia wydajności wysokoprzepustowej produkcji białek i powiązanych z nią zastosowań w badaniach nad genomiką strukturalną. Stosując wcześniej opisany protokół dla Protein Maker, zalety stają się oczywiste w porównaniu z jednokanałowym systemem FPLC. Jedna osoba może w ciągu ośmiu godzin oczyścić równolegle do 48 docelowych białek. W przeciwieństwie do tego, jedna osoba korzystająca z jednokanałowego systemu FPLC może oczyścić maksymalnie cztery białka w tym samym czasie. Wysoki stopień czystości każdego białka uzyskiwany za pomocą Protein Maker jest krytycznym czynnikiem dla późniejszego sukcesu w hodowli kryształów białek do analizy strukturalnej.

Ograniczenia i rozwiązywanie problemów

Rozwiązywanie struktur trójwymiarowych za pomocą krystalografii rentgenowskiej jest wieloetapowym procesem wiążącym się z wieloma wyzwaniami, jednym z których jest niemożność uzyskania dużych ilości rozpuszczalnego białka docelowego. Strategią, którą można wdrożyć w celu przezwyciężenia problemu rozpuszczalności, jest zastosowanie alternatywnego gospodarza ekspresyjnego, ponieważ komórki E. coli nie są w stanie przeprowadzić kilku ważnych eukariotycznych modyfikacji potranslacyjnych. Odpowiednią alternatywą jest często ekspresja w różnych liniach komórkowych drożdży, owadów i ssaków, które są zdolne do przeprowadzania tych modyfikacji potranslacyjnych. Białka docelowe są czasami ekspresowane, lecz całkowicie nierozpuszczalne w standardowych warunkach lizy. Protein Maker może być cennym zasobem do szybkiego testowania alternatywnych warunków lizy komórek, jak opisano w pracy Smith et al. 2011 ¹³. Strategia ta jest często niezbędna, aby białka docelowe mogły przechodzić przez kolejne etapy analizy. W każdym procesie genomiki strukturalnej zstandaryzowane protokoły mogą nie być odpowiednie dla każdego białka docelowego i mogą one wymagać indywidualnej optymalizacji. Na przykład zdecydowaliśmy się na zastosowanie 20% glikolu etylenowego jako krioprotektanta w każdym przypadku. W sytuacjach, gdy warunek ten jest nieodpowiedni, konieczne może być przetestowanie alternatywnych krioprotektantów lub innych stężeń.

Ze względu na unikalny charakter każdego białkowego celu, etapem ograniczającym tempo i nieprzewidywalnym krokiem w wyznaczaniu struktury jest krystalizacja. Procedura MTPP niweluje zazwyczaj niski odsetek sukcesów krystalizacji białek poprzez optymalizację wyników wstępnych przesiewów macierzy rzadkich (sparse matrix screens). Każdy wstępny kryształ uzyskany w komercyjnie dostępnych przesiewach macierzy rzadkich jest dalej optymalizowany za pomocą E-Screen Builder (Emerald Bio). Przesiew optymalizacyjny jest projektowany w oparciu o warunki, w których powstał pierwotny kryształ, poprzez zmianę stężeń buforów, soli i dodatków. Pomyślne przesiewy optymalizacyjne pozwalają uzyskać kryształy odpowiednie do badań dyfrakcyjnych i wyznaczania struktury.

Program genomiki strukturalnej realizowany przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) zapewnia finansowanie dla firmy Emerald Bio oraz trzech innych instytucji z regionu Północno-Zachodniego Pacyfiku, które wspólnie tworzą konsorcjum SSGCID (Emerald Bio, SeattleBiomed, University of Washington oraz Pacific Northwest National Laboratory). Każdego członka konsorcjum wybrano ze względu na doświadczenie w zastosowaniu najnowocześniejszych technologii niezbędnych do osiągnięcia celów programu genomiki strukturalnej NIAID. Do chwili obecnej SSGCID zdeponowało w bazie PDB 461 struktur, co plasuje konsorcjum jako siódmego największego kontrybutora na świecie, a w 2011 roku jako najbardziej produktywnego. Protokoły i metodologie SSGCID są udostępniane z zamiarem wsparcia społeczności naukowej oraz kontynuowania badań nad chorobami zakaźnymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Primery	IDT
Geny	DNA 2.0
Bufor TE	Qiagen	dołączony do zestawu
Płytki PCR 96-dołkowe z połową obwódki	VWR	10011-248
PFU Master Mix
6X pomarańczowy barwnik do ładowania	Fermentas	R0631
10X TAE	Teknova	T0280
Agaroza	Sigma-Aldrich	A9414-10G
Wektor pET28
Pożywka 2-YT	VWR	101446-848
Kanamycyna	Teknova	K2151
Enzymy restrykcyjne	Fermentas
Zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick	Qiagen	28704
Komórki kompetentne chemicznie Top 10	Invitrogen	C4040-06
Jednorazowe korytka (sterylne, 25 ml)	VWR	89094-662
Przykrywy Airpore (filmy rayonowe do hodowli biologicznych)	VWR	60941-086
Bloki 24-dołkowe	VWR	13503-188
QIAvac 96	Qiagen	19504
Komórki BL21(DE3) kompetentne chemicznie (phageR)	NEB	C2527H
50% glicerolu	VWR	100217-622
Pożywka TB	Teknova	T7060
IPTG	Sigma-Aldrich
1 M Tris pH 8.0	Mediatech	46-031-CM
5 M NaCl	Teknova	S0251
Glicerol	Aldrich	G7893-4L
CHAPS	JT Baker	4145-01
Imidazol	Sigma	56749-1KG
TCEP	Amresco	K831-10G
L-arginina	Amresco	0877-500G
Benzonukleaza	EMD	70746-3
Lizozym	USB	1864525GM
Membrana dializacyjna 10 kDa MWCO	Thermo	68100
Koncentratory Amicon Ultra 10 ka MWCO	Millipore	UFC901024
Kolumny HisTrap FF	GE	17-5255-01
Kolumny HiTrap Chelating	GE	17/0408-01
Płytki do krystalizacji Compact Jr	Emerald Bio	EBS-XJR
Ekran krystalizacyjny	Emerald Bio
Glikol etylenowy 100%	Emerald Bio	EBS-250-EGLY
Magnetyczna prosta pęseta Crystal Wand	Hampton Research	HR4-729
Montowana pętla kriogeniczna CryoLoop 0.1-0.2 mm	Hampton Research	HR4-955
Podkładka typu ALS
Pęseta do podkładek
Wygięte pęsety
Wypychacz do podkładek