Artykuł metodologiczny

Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

17.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4236

⸱

9 października 2012

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Emory University, 2Department of Chemistry, Georgia Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych cząsteczek. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, nanocząstki te mają rozmiar zbliżony do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczych cząsteczek, stabilności przeciwko fotodegradacji oraz odporności na nieswoiste wiązanie z białkami i komórkami.

Streszczenie

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek jest ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów funkcji biomolekularnych oraz wizualizacji przestrzennej i czasowej heterogeniczności zachowań molekularnych, które leżą u podstaw biologii komórki 1-4. Aby obrazować pojedynczą cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, zazwyczaj sprzęga się ją z markerem fluorescencyjnym (barwnikiem, białkiem, koralikiem lub kropką kwantową) i obserwuje za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Choć barwniki i białka fluorescencyjne od dekad stanowią podstawę obrazowania fluorescencyjnego, ich fluorescencja jest niestabilna przy wysokich strumieniach fotonów niezbędnych do obserwacji pojedynczych cząsteczek, co pozwala na zaledwie kilka sekund obserwacji przed całkowitą utratą sygnału. Koraliki lateksowe i koraliki znakowane barwnikiem zapewniają lepszą stabilność sygnału, ale odbywa się to kosztem drastycznie większego rozmiaru hydrodynamicznego, co może niekorzystnie wpływać na dyfuzję i zachowanie badanej cząsteczki.

Kropki kwantowe (QDs) stanowią kompromis pomiędzy tymi dwoma problematycznymi obszarami. Nanocząsteczki te składają się z materiałów półprzewodnikowych i mogą być projektowane tak, aby posiadały kompaktowy rozmiar hydrodynamiczny oraz wyjątkową odporność na fotodegradację 5. Dzięki temu w ostatnich latach QDs odegrały kluczową rolę w umożliwieniu długoterminowej obserwacji złożonych zachowań makromolekularnych na poziomie pojedynczych cząsteczek. Stwierdzono jednak, że cząsteczki te nadal wykazują upośledzoną dyfuzję w zatłoczonych środowiskach molekularnych, takich jak cytoplazma komórkowa czy neuronalna szczelina synaptyczna, gdzie ich rozmiary są wciąż zbyt duże 4,6,7.

Opracowaliśmy niedawno rdzenie i powłoki powierzchniowe kropek kwantowych (QD) w celu zminimalizowania ich rozmiaru hydrodynamicznego, równoważąc jednocześnie wpływ na stabilność koloidalną, fotostabilność, jasność oraz wiązanie nieswoiste, które w przeszłości ograniczały użyteczność kompaktowych QD 8,9. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie syntezy, modyfikacji i charakterystyki tych zoptymalizowanych nanokryształów, składających się ze stopowego rdzenia HgxCd1-xSe pokrytego izolującą powłoką CdyZn1-yS, a następnie wielodentatowym ligandem polimerowym zmodyfikowanym krótkimi łańcuchami glikolu polietylenowego (PEG) (Rycina 1). W porównaniu z konwencjonalnymi nanokryształami CdSe, stopy HgxCd1-xSe oferują wyższe wydajności kwantowe fluorescencji, emisję w zakresie czerwieni i bliskiej podczerwieni dla lepszego stosunku sygnału do szumu w komórkach oraz wzbudzanie przy nietoksycznych dla komórek długościach fal widzialnych. Wielodentatowe powłoki polimerowe wiążą się z powierzchnią nanokryształu w zamkniętej i płaskiej konformacji, aby zminimalizować rozmiar hydrodynamiczny, a PEG neutralizuje ładunek powierzchniowy, minimalizując nieswoiste wiązanie z komórkami i biomolekułami. Końcowym wynikiem jest silnie fluorescencyjny nanokryształ z emisją w zakresie 550-800 nm i całkowitym rozmiarem hydrodynamicznym wynoszącym około 12 nm. Jest to zakres wielkości zbliżony do wielu rozpuszczalnych białek globularnych w komórkach i znacznie mniejszy niż w przypadku konwencjonalnych pegylowanych QD (25-35 nm).

Protokół

Poniższe procedury syntezy wymagają zastosowania standardowych technik bezdostępnych dla powietrza oraz użycia linii próżniowo-gazowej; szczegółową metodologię można znaleźć w referencjach 10 i 11. Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki (MSDS) wszystkich potencjalnie toksycznych i łatwopalnych substancji, a wszystkie związki łatwopalne i/lub wrażliwe na działanie powietrza powinny zostać podzielone na alikwoty w fiolkach z septami w komorze rękawicowej lub worku rękawicowym.

1. Synteza rdzeni kropek kwantowych selenku rtęci i kadru (HgxCd1-xSe)

  1. Przygotować 0,4 M roztwór selenu w trioktylofosfinie (TOP). Dodać selen (0,316 g, 4 mmol) do kolby trójszyjnej o pojemności 50 ml, następnie odessać powietrze i napełnić argonem za pomocą linii Schlenka. W warunkach beztlenowych (atmosfera suchego azotu lub argonu) dodać 10 ml TOP i podgrzewać do 100 °C przy mieszaniu przez 1 h, aż powstanie klarowny, bezbarwny roztwór. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i odstawić kolbę.
  2. Do kolby trójszyjnej o pojemności 250 ml dodać tlenek kadmu (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), kwas tetradecylfosfonowy (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) oraz oktadecen (ODE, 27,6 ml), a następnie odessać powietrze z roztworu za pomocą linii Schlenka podczas mieszania. Podnieść temperaturę do 100 °C i odsysać powietrze przez kolejne 15 min w celu usunięcia zanieczyszczeń o niskiej temperaturze wrzenia.
  3. W atmosferze argonu lub azotu podgrzewać mieszaninę do 300 °C przez 1 h, aby całkowicie rozpuścić CdO. Roztwór zmieni kolor z czerwonawo-brązowego na klarowny i bezbarwny. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.
  4. Do roztworu kadmu dodać heksadecylaminę (HDA, 7,0 g), podgrzać do 70 °C i odessać powietrze. Po osiągnięciu stałego ciśnienia podnieść temperaturę do 100-110 °C i gotować roztwór z chłodnicą zwrotną przez 30 min. Przełączyć zawór linii Schlenka na gaz obojętny i wprowadzić termoparę bezpośrednio do roztworu.
  5. W warunkach beztlenowych dodać do roztworu difenylofosfinę (DPP, 100 μl) i zwiększyć temperaturę do 310 °C. Pobrać 7,5 ml 0,4 M roztworu TOP-Se (3 mmol selenu) do jednorazowej plastikowej strzykawki z igłą o rozmiarze 16 gauge.
  6. Po ustabilizowaniu temperatury na poziomie 310 °C ustawić kontroler temperatury na 0 °C i szybko wstrzyknąć roztwór TOP-Se bezpośrednio do roztworu kadmu. Roztwór zmieni kolor z bezbarwnego na żółto-pomarańczowy, a temperatura gwałtownie spadnie, a następnie wzrośnie ponownie do ok. 280 °C. Po 1 min reakcji wyjąć kolbę z płaszcza grzejnego i szybko schłodzić strumieniem powietrza, aż temperatura spadnie poniżej 200 °C.
  7. Gdy temperatura osiągnie ok. 40 °C, rozcieńczyć roztwór 30 ml heksanu; większość pozostałego prekursora kadmu wytrąci się z roztworu. Usunąć ten osad poprzez wirowanie (5 000 x g, 10 min).
  8. W każdej z sześciu stożkowych probówek wirówkowych z polipropylenu o pojemności 50 ml rozcieńczyć 12 ml surowego roztworu nanokryształów 40 ml acetonu, wirować (5 000 x g przez 10 min), a następnie ostrożnie zdekantować i usunąć nadsącz.
  9. Rozpuścić osady nanokryształów w heksanie (całkowita objętość 25 ml). Ekstrahować ten roztwór 3 razy równą objętością metanolu, zachowując górną fazę. Przy trzeciej ekstrakcji objętość metanolu można dostosować do ok. 15 ml, aby uzyskać stężony heksanowy roztwór czystych kropek kwantowych (QD) CdSe o stężeniu około 200 μM. Typowa wydajność tej reakcji to 3 μmol nanokryształów CdSe o średnicy 2,3 nm (wydajność reakcji 50-60%).
  10. Wyznaczyć średnicę i stężenie nanokryształów poprzez pomiar widma absorpcji UV-Vis i skorzystanie z wykresu dopasowania rozmiaru opracowanego przez Mulvaneya i współpracowników 12 oraz korelacji ekstynkcji Bawendiego i współpracowników 13. Szczegóły znajdują się w aneksie.
  11. Wymiana kationów na rtęć: nanokryształy mogą zostać częściowo poddane wymianie na rtęć w celu przesunięcia absorpcji i emisji fluorescencji w stronę czerwieni. Wymieszać następujące składniki w podanej kolejności w szklanej fiolce o pojemności 20 ml z mieszadłem magnetycznym (skalę tej reakcji można dowolnie zmieniać): 3 ml heksanu, 2 ml chloroformu, 1 ml 200 μM roztworu QD CdSe (200 nmol), 15 μl oleylaminy (OLA) oraz 500 μl 0,1 M roztworu Hg(OT)2 w chloroformie. Oktanotiolet rtęci (HgOT2) można przygotować poprzez reakcję octanu rtęci i oktanotiolu w metanolu (patrz aneks). W miarę postępu reakcji wymiany kationów stopień przesunięcia w stronę czerwieni można monitorować za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej UV-Vis. Po osiągnięciu pożądanego pasma absorpcji zmierzyć absorpcję roztworu nanokryształów przy 350 nm i wyznaczyć nowy współczynnik ekstynkcji, zakładając, że stężenie nanokryształów nie uległo zmianie (30,7 μM w tym przykładzie). Przerwać reakcję poprzez usunięcie nieprzereagowanej rtęci: dodać 5 ml dekanu, 10 ml heksanu i 7 ml metanolu, a następnie przeprowadzić ekstrakcję roztworu, zachowując górną fazę zawierającą nanokryształy. Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie za pomocą heksanu i metanolu, dostosowując objętość metanolu tak, aby górna faza miała ok. 7 ml. Jeśli fazy rozdzielają się powoli, roztwór można wirować (5 000 x g, 10 min). Do nanokryształów dodać 100 μl TOP, 100 μl OLA oraz 100 μl kwasu oleinowego, a następnie 40 ml acetonu w celu wywołania wytrącenia. Zebrać nanokryształy poprzez wirowanie i zdyspergować w 3 ml heksanu. Wirować ponownie, aby usunąć nierozpuszczalne składniki i ponownie wyznaczyć stężenie nanokryształów, korzystając z nowego współczynnika ekstynkcji przy 350 nm. Pozostawić roztwór nanokryształów do dojrzewania przez co najmniej 24 h w temperaturze pokojowej przed przejściem do następnego kroku.

2. Wzrost powłoki z siarczku kadmu i cynku (CdyZn1-yS)

  1. Przygotować 0,1 M roztwory prekursorów otoczki w 50 ml kolbach trójszyjnych. Prekursor kadru: wodny octan kadru (230,5 mg, 1 mmol) i 10 ml oleilaminy (OLA). Prekursor cynku: octan cynku (183,5 mg, 1 mmol) i 10 ml OLA. Prekursor siarki: siarka (32,1 mg, 1 mmol) i 10 ml ODE. W próżni podgrzewać każdy roztwór do temperatury wrzenia przez 1 h, aż powstaną klarowne roztwory, a następnie napełnić argonem. Roztwór siarki można schłodzić do temperatury pokojowej, natomiast prekursory kadru i cynku należy utrzymać w temperaturze około 50 °C. Obliczenia ilości prekursorów otoczki znajdują się w odniesieniu 14.
  2. Do kolby trójszyjnej dodać: kropki kwantowe (QDs) HgxCd1-xSe (120 nmol, średnica 2,3 nm), ODE (2 ml) oraz tlenek trioktylofosfiny (TOPO, 250 mg). Usunąć heksan w temperaturze pokojowej za pomocą linii Schlenka. Podnieść temperaturę do 100 °C i gotować z powrotem przez 15 min. Przełączyć zawór linii Schlenka na gaz argon lub azot i umieścić termoparę w roztworze nanokryształów.
  3. Podnieść temperaturę do 120 °C, dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora siarki (140 μl) i pozostawić reakcję na 15 min. Małe alikwoty (<50 μl) można pobierać za pomocą szklanej strzykawki, aby monitorować postęp reakcji za pomocą spektrometrii fluorescencyjnej i/lub absorpcyjnej UV-Vis. Podnieść temperaturę do 140 °C, dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora kadru (140 μl) i pozostawić reakcję na 15 min. Do roztworu reakcyjnego dodać 500 μl bezwodnej OLA.
  4. W temperaturze 160 °C dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora siarki (220 μl), a następnie taką samą ilość roztworu prekursora cynku w 170 °C, z odstępem 15 min między kolejnymi dodaniami. Następnie w 180 °C dodać 0,25 monowarstwy roztworu prekursora siarki (150 μl) oraz roztwór prekursora cynku w odstępach 15 min.
  5. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i ponownie obliczyć nowy współczynnik ekstynkcji dla tych cząstek za pomocą widma UV-Vis, zakładając, że liczba nanokryształów nie uległa zmianie (120 nmol w 3,8 ml roztworu reakcyjnego). Przechowywać roztwór reakcyjny jako surową mieszaninę w zamrażarce; nanokryształy można rozmrażać i oczyszczać w razie potrzeby, stosując metodę opisaną w sekcjach 1.8 i 1.9.
  6. Nanokryształy można scharakteryzować za pomocą mikroskopii elektronowej, spektroskopii absorpcyjnej UV-Vis oraz spektroskopii fluorescencyjnej. Wydajność kwantową można obliczyć absolutnie przy użyciu sfery całkującej lub względnie w porównaniu do znanego wzorca, stosując metody z odniesienia 15.

3. Transfer fazowy

  1. Do kolby trójszyjnej o pojemności 50 ml dodać oczyszczone kropki kwantowe (QDs) typu rdzeń/powłoka HgxCd1-xSe/CdyZn1-yS (5 ml, 20 μM) i odparować heksan w wysokiej próżni do uzyskania suchego filmu. Napełnić kolbę argonem, dodać do filmu z nanocząsteczek bezwodną pirydynę (3 ml) i podgrzać zawiesinę do 80 °C. W ciągu 1-2 h nanocząsteczki ulegną całkowitemu rozpuszczeniu.
  2. Do roztworu dodać 1-tioglicerynę (1 ml) i mieszać w temperaturze 80 °C przez 2 h. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i dodać trietyloaminę (0,5 ml), aby zdeprotonować tioglicerynę. Mieszać przez 30 min. Po dodaniu trietyloaminy roztwór może stać się mętny ze względu na słabą rozpuszczalność polarnych nanokryształów w tej mieszaninie rozpuszczalników.
  3. Przenieść roztwór QDs do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej mieszaninę 20 ml heksanu i 20 ml acetonu, a następnie dokładnie wymieszać. Wyizolować wytrącone nanokryształy poprzez wirowanie (5 000 x g, 10 min) i przemyć osad acetonem.
  4. Osad QDs rozpuścić w DMSO (5 ml) w kąpieli ultradźwiękowej, a następnie wirować (7 000 x g, 10 min) w celu usunięcia ewentualnych agregatów. Stężenie nanocząsteczek określić na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis. Ten roztwór czystych QDs należy wykorzystać w ciągu 3 h, ponieważ tiole powierzchniowe mogą powoli utleniać się w warunkach otoczenia w powietrzu.
  5. Rozcieńczyć roztwór QDs do stężenia 10 μM lub mniejszego za pomocą DMSO i przenieść do kolby o pojemności 50 ml. Przygotować roztwór tiolowanego kwasu poliakrylowego (synteza opisana w aneksie) w DMSO o stężeniu 5 mg/ml. Roztwór polimeru (0,15 mg polimeru na nmol QDs) dodawać kroplami do roztworu QDs podczas mieszania, a następnie odgazować roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  6. Przepłukać roztwór QDs/polimer argonem i podgrzewać do 80 °C przez 90 min. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i kroplami dodać taką samą objętość 50 mM boranu sodu, pH 8. Mieszać przez 10 min.
  7. Oczyścić QDs poprzez dializę (cutoff 20 kDa) w 50 mM boranie sodu, pH 8, a następnie zagęścić cząsteczki za pomocą filtra wirówkowego (cutoff 10 kDa). Stężenie określić na podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis.

4. Powlekanie PEG

  1. W szklanej fiolce o pojemności 4 ml z mieszadłem magnetycznym wymieszać 1 nmol QDs w buforze boranowym z 40 000-krotną nadwyżką molową monoamino-glikolu polietylenowego o masie 750 Da (30 mg, 40 μmol). Jeśli do nanokryształów ma zostać dodana konkretna funkcjonalność chemiczna (np. hydrazyd lub maleimid), można ją wprowadzić, zastępując część amino-PEG heterobifunkcyjnym amino-PEG (zazwyczaj dobrze sprawdza się 30% ułamka molowego). Rozcieńczyć roztwór nanokryształów buforem boranowym do stężenia 1 μM. Reakcję tę można skalować według uznania.
  2. Przygotować świeży roztwór DMTMM (20 mg, 72 μmol) w DMSO (144 μl). Roztwór ten można krótko podgrzać pod strumieniem ciepłej wody z kranu lub umieścić w myjce ultradźwiękowej, aby całkowicie rozpuścić DMTMM. Szybko dodać 25 000-krotną nadwyżkę molową tego 0,5 M roztworu DMTMM (50 μl) do roztworu QD i mieszać w temperaturze pokojowej przez 30 min.
  3. Powtórzyć krok 4.2 jeszcze cztery razy, aby nasycić powierzchnię nanokryształów PEG. Na koniec dodać 200 μl 1 M buforu Tris, aby zatrzymać reakcję, a następnie oczyścić nanokryształy za pomocą dializy, filtrów wirowych lub ultrawirowania.
  4. Nanokryształy można analizować pod kątem monodyspersyjności, rozmiaru hydrodynamicznego i ładunku powierzchniowego przy użyciu chromatografii cieczowej, elektroforezy w żelu agarozowym oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Aby określić rozmiar hydrodynamiczny i rozkład rozmiarów za pomocą zautomatyzowanego systemu chromatografii cieczowej (GE AKTAprime Plus), należy użyć kolumny Superose 6, przepływu 0,5 ml/min z eluentem w postaci buforu PBS oraz detekcji absorbancji przy 260 lub 280 nm. Czasy elucji nanocząsteczek należy porównać z czasami elucji wzorców masy cząsteczkowej. W przypadku elektroforezy w żelu agarozowym przygotować 0,5% żel agarozowy w 50 mM buforze boranu sodu (pH 8,5) lub 50 mM buforze fosforanowym sodu (pH 7,4), wymieszać próbki o stężeniu 1 μM z 10% glicerolem, nanieść do studzienek i prowadzić prąd o napięciu 100 V przez 30 min. Nanokryształy w żelu należy obrazować za pomocą lampy UV lub transiluminatora UV w celu wzbudzenia fluorescencji. Aby obrazować nanokryształy na poziomie pojedynczych cząsteczek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, rozcieńczyć cząstki do stężenia 0,2 nM w 10 mM buforze fosforanowym, nanieść 2,5 μl roztworu na szklaną laminkę i ostrożnie położyć drugą laminkę na kropli cieczy, aby stworzyć film między laminkami. Cząstki związane z powierzchnią należy obrazować przy użyciu obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (idealnie co najmniej 1,40) w trybie epifluorescencji lub TIRF, przy wzbudzeniu długościami falami między 400-580 nm i z użyciem kamery CCD z mnożeniem elektronów. Dokładne parametry obrazowania będą się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne widma absorpcyjne i fluorescencyjne nanokryształów CdSe, nanokryształów HgxCd1-xSe po wymianie kationów oraz nanokryształów HgxCd1-xSe/CdyZn1-yS po wzroście powłoki. Nanokryształy rdzenia CdSe mają wydajność kwantową fluorescencji bliską 15% (wliczając emisję z głębokich pułapek przy długich falach), lecz sprawność ta spada do poniżej 1% po wymianie rtęci, co prawdopodobnie wynika z wprowadzenia pułape...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu do konwencjonalnych kropek kwantowych CdSe, nanokryształy trójskładnikowego stopu HgxCd1-xSe mogą być dostrajane pod względem rozmiaru i długości fali fluorescencji niezależnie od siebie. Rozmiar jest wybierany w pierwszej kolejności podczas syntezy rdzeni nanokryształów CdSe, natomiast długość fali fluorescencji jest ustalana w drugim etapie wymiany kationów rtęci, który nie zmienia znacząco rozmiaru nanokryształów 9. Ważne jest, aby oczyszczone nanokryształy HgxC...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr. Hong Yi z Emory University Integrated Microscopy Core za wykonanie obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej. Praca ta była sponsorowana z grantów NIH (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 oraz 1K99CA154006-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SelenSigma-Aldrich229865
Tri-n-octylofosfinaStrem15-6655czystość 97%, niestabilny w powietrzu
Tlenek kadmuSigma-Aldrich202894Wysoce toksyczne: zachować ostrożność
Kwas tetradecylfosfonowySynteza PCI4671-75-4
OktadecenAlfa AesarL11004Klasa techniczna
HeksadecyloaminaSigma-AldrichH7408
DyfenylofosfinaSigma-Aldrich252964Piroforyczny
Octan rtęciSigma-Aldrich456012Wysoko toksyczne: zachować ostrożność
1-oktanotiolSigma-Aldrich471836Silny zapach
Kwas oleinowySigma-AldrichW281506
Octan cynku Alfa Aesar35792
Octan kadru uwodnionySigma-Aldrich229490Wysoka toksyczność: zachować ostrożność
oleilaminaFisher ScientificAC12954Niestabilny w powietrzu
SiarkaSigma-Aldrich344621
Tlenek trioktylofosfinyStrem15-666199%
PyridynaVWREM-PX2012-6Bezwodny
TioglicerolSigma-AldrichM1753Silny zapach
TrietyloaminaSigma-Aldrich471283Bezwodny
Membrana dializacyjnaSpectrum Labs131342próg odcięcia 20 kDa
Filtr wirówkowyMilliporeUFC801024próg odcięcia 10 kDa
Monoamino-PEGPolimery Rapp12 750-2750 Da
DMTMM, hydrat chlorku 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyn-2-ylo)-4-metylmorfoliniumAlfa AesarH26333
System chromatograficzny AKTAprime PlusGE HealthCare
kolumna chromatograficzna Superose 6 10/300 GLGE HealthCare17-5172-01
Agaroza, OmniPurVWREM-2120

Aneks

Synteza oktanotiolanu rtęciPowoli dodaj do mieszanego roztworu 1-oktanotiolu (3 eq.) i wodorotlenku potasu (3 eq.) w metanolu, w temperaturze pokojowej, roztwór octanu rtęci w metanolu (1 eq.). Wyizoluj osad oktanotiolanu rtęci(II) poprzez filtrację, przemyj go dwukrotnie metanolem i raz eterem, a następnie wysusz w próżni.

Synteza polimeru wielodentatnegoRozpuścić kwas poliakrylowy (1 g, 1,773 Da) w 25 ml dimetyloformamidu (DMF) w kolbie trójszyjnej o pojemności 150 ml i przepłukiwać argonem przez 30 min. Dodać bezwodny roztwór cysteaminy (374 mg, 4,87 mmol) w 10 ml DMF. W temperaturze pokojowej, przy intensywnym mieszaniu, powoli dodawać bezwodny diizopropylokarbodiimid (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) w ciągu 30 min, a następnie trietyloaminę (170 μl, 1,22 mmol) i pozostawić reakcję na 72 h w temperaturze 60 °C. Dodaj merkaptan–metanol (501 mg, 6,41 mmol) w celu zatrzymania reakcji, a następnie mieszać przez 2 h w temperaturze pokojowej. DMF usunąć za pomocą odparowania rotacyjnego, a polimer wyizolować poprzez dodanie mieszaniny lodowatego acetonu i chloroformu w stosunku 2:1, a następnie zastosować wirowanie. Polimer rozpuścić w ok. 5 ml bezwodnego DMF, przefiltrować, ponownie wytrącić za pomocą eteru dietylowego i powtórzyć czynność. Produkt wysuszyć w próżni i przechowywać w atmosferze argonu.

Oznaczanie średnicy rdzenia CdSeNa podstawie widma absorpcyjnego UV-Vis wyznacz długość fali pierwszego piku ekscytonowego (λ, w nm), który jest pikiem o najdłuższej długości fali (np. około 498 nm dla CdSe w Rycina 2a), a następnie należy zastosować krzywą kalibracji rozmiaru opracowaną przez Mulvaneya i współpracowników 12:

figure-materials-1

Oznaczanie stężenia nanokryształów CdSeNa podstawie widma UV-Vis z odjętym tłem dla optycznie klarownego roztworu nanokryształów CdSe wyznacz absorbancję przy długości fali 350 nm. W celu ustalenia, czy absorbancja optyczna mieści się w zakresie liniowym prawa Lamberta-Beera, można zastosować rozcieńczenia seryjne. Stężenie nanokryształów (kropka kwantowa, w M) można wyznaczyć, podstawiając średnicę nanokryształu (D, w nm), wartość absorpcji optycznej (A3sa), oraz długość drogi optycznej kuwety (l, w cm) do następującego równania wynikającego z korelacji empirycznej Bawendiego i współpracowników 13:

figure-materials-2

Bibliografia

  1. Toprak, E., Selvin, P. R. New fluorescent tools for watching nanometer-scale conformational changes of single molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 349-369 (2007).
  2. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. J. Advances in single molecule fluorescence methods for molecular biology. Annu. Rev. Biochem. 77, 51-76 (2008).
  3. Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nat. Method. 7, 275-285 (2010).
  4. Smith, A. M., Wen, M. M., Nie, S. M. Imaging dynamic cellular events with quantum dots. Biochemist. 32, 12-17 (2010).
  5. Smith, A. M., Duan, H. W., Mohs, A. M., Nie, S. M. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 1226-1240 (2008).
  6. Smith, A. M., Nie, S. M. Next-generation quantum dots. Nature Biotech. 27, 732-733 (2009).
  7. Groc, L., Lafourcade, M., Heine, M., Renner, M., Racine, V., Sibarita, J. -B., Lounis, B., Choquet, D., Cognet, L. Single trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. J. Neurosci. 27, 12433-12437 (2007).
  8. Smith, A. M., Nie, S. M. Minimizing the hydrodynamic size of quantum dots with multifunctional multidentate polymer ligands. J. Am. Chem. Soc. 130, 11278-11279 (2008).
  9. Smith, A. M., Nie, S. M. Bright and compact alloyed quantum dots with broadly tunable near-infrared absorption and fluorescence spectra through mercury cation exchange. J. Am. Chem. Soc. 133, 24-26 (2011).
  10. Shriver, D. F., Drezdzon, M. A. The Manipulation of Air-Sensitive Compounds. , 2nd edn, Wiley-Interscience. (1986).
  11. Errington, R. J. Advanced Practical Inorganic and Metalorganic Chemistry. , Blackie. (1997).
  12. Jasieniak, J., Smith, L., van Embden, J., Mulvaney, P., Califano, M. Re-examination of the size-dependent absorption properties of CdSe quantum dots. J. Phys. Chem. C. 113, 19468-19474 (2009).
  13. Leatherdale, C. A., Woo, W. K., Mikulec, F. V., Bawendi, M. G. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. J. Phys. Chem. B. 106, 7619-7622 (2002).
  14. Smith, A. M., Mohs, A. M., Nie, S. M. Tuning the optical and electronic properties of colloidal nanocrystals by lattice strain. Nature Nanotech. 4, 56-63 (2009).
  15. Demas, J. N., Crosby, G. A. The measurement of photoluminescence quantum yields. A review. J. Phys. Chem. 75, 991-1024 (1971).
  16. Van Embden, J., Jasieniak, J., Mulvaney, P. Mapping the optical properties of CdSe/CdS heterostructure nanocrystals: the effects of core size and shell thickness. J. Am. Chem. Soc. 131, 14299-14309 (2009).
  17. Smith, A. M., Duan, H. W., Rhyner, M. N., Ruan, G., Nie, S. M. A systematic examination of surface coatings on the optical and chemical properties of semiconductor quantum dots. Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3895-3903 (2006).
  18. Zhang, X., Mohandessi, S., Miller, L. W., Snee, P. T. Efficient functionalization of aqueous CdSe/ZnS nanocrystals using small-molecule chemical activators. Chem. Comm. 47, 3532-3534 (2011).
  19. Bucio, L., Souza, V., Albores, A., Sierra, A., Chavez, E., Carabez, A., Guiterrez-Ruiz, M. C. Cadmium and mercury toxicity in a human fetal hepatic cell line (WRL-68 cells). Toxicol. 102, 285-299 (1995).
  20. Han, S. G., Castranova, V., Vallyathan, V. J. Comparative cytotoxicity of cadmium and mercury in a human bronchial epithelial cell line (BEAS-2B) and its role in oxidative stress and induction of heat shock protein 70. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 70, 852-860 (2007).
  21. Strubelt, O., Kremer, J., Tilse, A., Keogh, J., Pentz, R. J. Comparative studies on the toxicity of mercury, cadmium, and copper toward the isolated perfused rat liver. J. Toxicol. Environ. Health Part A. 47, 267-283 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozmiar hydrodynamicznyspektroskopia fluorescencjichromatografia elowaelektroforeza elowastopowanie rt cimodulacja PEGnanokryszta y rdze pow okazwi kszanie fotostabilno ci

Powiązane artykuły