Kompaktowe kropki kwantowe do obrazowania pojedynczych cząsteczek

Summary

Opisujemy przygotowanie koloidalnych kropek kwantowych o zminimalizowanym rozmiarze hydrodynamicznym do obrazowania fluorescencji pojedynczej cząsteczki. W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi, te nanocząstki mają rozmiar podobny do białek globularnych i są zoptymalizowane pod kątem jasności pojedynczej cząsteczki, stabilności przed fotodegradacją i odporności na niespecyficzne wiązanie z białkami i komórkami.

Abstract

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek jest ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów funkcji biomolekularnych oraz do wizualizacji przestrzennej i czasowej heterogeniczności zachowań molekularnych, które leżą u podstaw biologii komórkowej ^1-4. Aby zobrazować pojedynczą cząsteczkę będącą przedmiotem zainteresowania, zwykle jest ona sprzężona ze znacznikiem fluorescencyjnym (barwnikiem, białkiem, kulką lub kropką kwantową) i obserwowana za pomocą mikroskopii epifluorescencji lub fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Podczas gdy barwniki i białka fluorescencyjne są podstawą obrazowania fluorescencyjnego od dziesięcioleci, ich fluorescencja jest niestabilna pod wpływem wysokich strumieni fotonów niezbędnych do obserwacji pojedynczych cząsteczek, co daje tylko kilka sekund obserwacji przed całkowitą utratą sygnału. Koraliki lateksowe i kulki znakowane barwnikiem zapewniają lepszą stabilność sygnału, ale kosztem drastycznie większego rozmiaru hydrodynamicznego, który może szkodliwie zmienić dyfuzję i zachowanie badanej cząsteczki.

Kropki kwantowe (QD) oferują równowagę między tymi dwoma problematycznymi reżimami. Te nanocząstki składają się z materiałów półprzewodnikowych i mogą być zaprojektowane z hydrodynamicznie kompaktowymi rozmiarami i wyjątkową odpornością na fotodegradację ⁵. W związku z tym w ostatnich latach mięśnie czasu stałego odegrały zasadniczą rolę w umożliwieniu długoterminowej obserwacji złożonych zachowań makromolekularnych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Jednak nadal stwierdzono, że cząstki te wykazują upośledzoną dyfuzję w zatłoczonych środowiskach molekularnych, takich jak cytoplazma komórkowa i szczelina synaptyczna neuronów, gdzie ich rozmiary są nadal zbyt duże ^4,6,7.

Ostatnio zaprojektowaliśmy rdzenie i powłoki powierzchniowe QD w celu zminimalizowania rozmiaru hydrodynamicznego, jednocześnie równoważąc kompensacje stabilności koloidalnej, fotostabilności, jasności i niespecyficznego wiązania, które utrudniały użyteczność kompaktowych QD w ostatnich ^8,9. Celem tego artykułu jest zademonstrowanie syntezy, modyfikacji i charakterystyki tych zoptymalizowanych nanokryształów, składających się ze stopowego rdzenia Hg_xCd_1-xSe pokrytego izolacyjną powłoką Cd_yZn_1-yS, dodatkowo pokrytego wielozębnym ligandem polimerowym modyfikowanym krótkimi łańcuchami glikolu polietylenowego (PEG) (rysunek 1). W porównaniu z konwencjonalnymi nanokryształami CdSe, stopy Hg_xCd_1-xSe oferują większą wydajność kwantową fluorescencji, fluorescencji na długościach fal czerwonych i bliskiej podczerwieni w celu zwiększenia sygnału do szumu w komórkach oraz wzbudzenia na niecytotoksycznych długościach fal widzialnych. Wielozębne powłoki polimerowe wiążą się z powierzchnią nanokryształu w zamkniętej i płaskiej konformacji, aby zminimalizować rozmiar hydrodynamiczny, a PEG neutralizuje ładunek powierzchniowy, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie z komórkami i biomolekułami. Efektem końcowym jest jasno fluorescencyjny nanokryształ o emisji w zakresie 550-800 nm i całkowitym rozmiarze hydrodynamicznym bliskim 12 nm. Jest to ten sam zakres wielkości, co wiele rozpuszczalnych białek globularnych w komórkach i znacznie mniejszy niż konwencjonalne pegylowane QD (25-35 nm).

Protocol

Następujące procedury syntezy obejmują standardowe techniki bezpowietrzne i użycie kolektora próżniowego/gazu obojętnego; szczegółową metodologię można znaleźć w odnośnikach 10 i 11. Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki wszystkich potencjalnie toksycznych i łatwopalnych substancji, a wszystkie łatwopalne i/lub nietrwałe powietrznie związki należy umieścić w fiolkach z zapieczętowaną przegrodą w schowku na rękawiczki lub w torbie na rękawice.

1. Synteza rdzeni kwantowych z kropkami kwantowymi (Hg_xCd_1-xSe)

1. Przygotować 0,4 M roztwór selenu w trioktylofosfinie (TOP). Dodać selen (0,316 g, 4 mmol) do 50 ml kolby z 3 szyjkami, następnie opróżnić i napełnić argonem za pomocą linii Schlenka. W warunkach bezpowietrznych (sucha atmosfera azotu lub argonu) dodać 10 ml TOP i podgrzewać do 100 °C, mieszając przez 1 godzinę, aby uzyskać klarowny, bezbarwny roztwór. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i odłożyć kolbę na bok.
2. Do kolby 3-szyjkowej o pojemności 250 ml dodać tlenek kadmu (CdO 0,0770 g, 0,6 mmol), kwas tetradecylofosfonowy (TDPA, 0,3674 g, 1,32 mmol) i oktadecen (ODE, 27,6 ml) i opróżnić roztwór za pomocą linii Schlenka, mieszając. Zwiększyć temperaturę do 100 °C i opróżnić na dodatkowe 15 minut, aby usunąć zanieczyszczenia o niskiej temperaturze wrzenia.
3. Pod wpływem argonu lub azotu gazowego podgrzewać mieszaninę do temperatury 300 °C przez 1 godzinę, aby całkowicie rozpuścić CdO. Roztwór zmieni kolor z czerwonawego na przezroczysty i bezbarwny. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.
4. Dodać heksadecyloaminę (HDA, 7,0 g) do roztworu kadmu, podgrzać do temperatury 70 °C i opróżnić. Po osiągnięciu stałego ciśnienia zwiększyć temperaturę do 100-110 °C i przepłukać roztwór przez 30 minut. Przełącz zawór przewodowy Schlenk na gaz obojętny i włóż termoparę bezpośrednio do roztworu.
5. W warunkach pozbawionych powietrza dodać difenylofosfinę (DPP, 100 μl) do roztworu i zwiększyć temperaturę do 310 °C. Pobrać 7,5 ml 0,4 M roztworu TOP-Se (3 mmol selenu) do jednorazowej plastikowej strzykawki przymocowanej do igły o rozmiarze 16.
6. Gdy temperatura zrównoważy się na poziomie 310 °C, ustaw regulator temperatury na 0 °C i szybko wstrzyknij roztwór TOP-Se bezpośrednio do roztworu kadmu. Roztwór zmieni się z bezbarwnego na żółto-pomarańczowy, a temperatura szybko spadnie i ponownie wzrośnie do ~280 °C. Po 1 minucie reakcji zdjąć kolbę z płaszcza grzewczego i szybko schłodzić strumieniem powietrza do momentu, gdy temperatura spadnie poniżej 200 °C.
7. Gdy temperatura osiągnie ~40 °C, rozcieńczyć 30 ml heksanu; większość pozostałego prekursora kadmu osiada z roztworu. Usunąć ten osad przez odwirowanie (5 000 x g, 10 min).
8. W każdej z sześciu stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml z polipropylenu rozcieńczyć 12 ml surowego roztworu nanokrystalicznego w 40 ml acetonu, odwirować (5 000 x g przez 10 minut), a następnie ostrożnie zdekantować i odrzucić supernatant.
9. Rozpuść granulki nanokryształów w heksanie (całkowita objętość 25 ml). Ekstrahuj ten roztwór 3 razy z równą objętością metanolu, zachowując górną fazę. W przypadku trzeciej ekstrakcji objętość metanolu można dostosować do ~15 ml w celu otrzymania stężonego roztworu heksanu o czystości CdSe QD o stężeniu około 200 μM. Typowa wydajność tej reakcji to 3 μmol nanokryształów CdSe o średnicy 2,3 nm (50-60% wydajności reakcji).
10. Określ średnicę i stężenie nanokryształów, mierząc widmo absorpcyjne UV-Vis i zapoznając się z tabelą dopasowania rozmiaru Mulvaneya i współpracowników ¹² oraz korelacjami wymierania Bawendi i współpracowników ¹³. Szczegółowe informacje można znaleźć w załączniku.
11. Wymiana kationów rtęci: nanokryształy mogą być częściowo wymieniane z rtęcią w celu przesunięcia ku czerwieni absorpcji i emisji fluorescencji. W szklanej fiolce o pojemności 20 ml z mieszadłem należy wymieszać kolejno: 3 ml heksanu, 2 ml chloroformu, 1 ml 200 μM roztworu CdSe QD (200 nmol), 15 μl oleiloaminy (OLA) i 500 μl 0,1 M roztworu Hg(OT)₂ w chloroformie. Oktanotioesan rtęci (HgOT₂) może być otrzymywany w reakcji octanu rtęci i oktanetiolu z metanolem (patrz dodatek). W miarę postępu reakcji wymiany kationowej zakres przesunięcia ku czerwieni może być monitorowany za pomocą spektrofotometrii absorpcyjnej UV-Vis. Po osiągnięciu pożądanego pasma absorpcji zmierz absorpcję roztworu nanokryształu przy 350 nm i wyznacz nowy współczynnik ekstynkcji, zakładając, że stężenie nanokryształów nie uległo zmianie (w tym przykładzie 30,7 μM). Ugasić reakcję, usuwając nieprzereagowaną rtęć: dodać 5 ml dekanu, 10 ml heksanu i 7 ml metanolu i wyekstrahować roztwór, zachowując górną fazę zawierającą nanokryształy. Ekstrahuj jeszcze dwukrotnie heksanem i metanolem i dostosuj objętość metanolu tak, aby górna faza wynosiła ~7 ml. Jeśli rozdzielanie faz jest powolne, roztwór można odwirować (5 000 x g, 10 min). Dodać 100 μl TOP, 100 μl OLA i 100 μl kwasu oleinowego do nanokryształów, a następnie 40 ml acetonu w celu wywołania wytrącenia. Zebrać nanokryształy przez odwirowanie i rozproszyć w 3 ml heksanu. Ponownie odwirować w celu usunięcia nierozpuszczalnych składników i ponownie określić stężenie nanokryształów, stosując nowy współczynnik ekstynkcji przy 350 nm. Pozwól roztworowi nanokryształu leżakować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej przed przejściem do następnego kroku.

2. Wzrost siarczku kadmu i (Cd_yZn_1-yS) Powłoka

1. Przygotować roztwory prekursorowe o pojemności 0,1 M w kolbach 3-szyjkowych o pojemności 50 ml. Prekursor kadmu: octan kadmu hydrat (230,5 mg, 1 mmol) i 10 ml oleiloaminy (OLA). Prekursor: octan (183,5 mg, 1 mmol) i 10 ml OLA. Prekursor siarki: siarka (32,1 mg, 1 mmol) i 10 ml ODE. Pod próżnią podgrzej każdy roztwór do refluksu przez 1 godzinę, aby uzyskać klarowne roztwory, a następnie naładuj argonem. Roztwór siarki może być schładzany do temperatury pokojowej, ale prekursory kadmu i są utrzymywane w temperaturze około 50 °C. Obliczenia ilości prekursorów otoczki znajdują się w pozycji bibliograficznej 14.
2. Dodać do kolby z 3 szyjkami: Hg_xCd_1-xSe QDs (120 nmol, średnica 2,3 nm), ODE (2 ml) i tlenek trioktylofosfiny (TOPO, 250 mg). Opróżnij heksan w temperaturze pokojowej za pomocą linii Schlenka. Zwiększyć temperaturę do 100 °C i odwrócić przez 15 minut. Zmień zawór przewodowy Schlenka na argon lub azot i włóż termoparę do roztworu nanokryształów.
3. Zwiększyć temperaturę do 120 °C, dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora siarki (140 μl) i pozostawić reakcję do przebiegu przez 15 minut. Małe podwielokrotności (<50 μl) można usunąć za pomocą szklanej strzykawki w celu monitorowania postępu reakcji za pomocą spektrofotometrii fluorescencyjnej i/lub absorpcyjnej UV-Vis. Zwiększyć temperaturę do 140 °C, dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora kadmu (140 μl) i pozostawić reakcję do przebiegu przez 15 minut. Do roztworu reakcyjnego dodać 500 μl bezwodnego OLA.
4. W temperaturze 160 °C dodać 0,5 monowarstwy roztworu prekursora siarki (220 μl), a następnie równą ilość roztworu prekursora w temperaturze 170 °C, zachowując 15 minut między każdym dodawaniem. Następnie w temperaturze 180 °C dodać 0,25 monowarstwy roztworu prekursora siarki (150 μl) i roztworu prekursora w odstępach 15-minutowych.
5. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i ponownie obliczyć nowy współczynnik ekstynkcji dla tych cząstek, korzystając z widma UV-Vis, zakładając, że liczba nanokryształów nie uległa zmianie (120 nmol w 3,8 ml roztworu reakcyjnego). Roztwór reakcyjny należy przechowywać w postaci surowej mieszaniny w zamrażarce; Nanokryształy mogą być rozmrażane i oczyszczane w zależności od potrzeb przy użyciu tej samej metody opisanej w sekcjach 1.8 i 1.9.
6. Nanokryształy można scharakteryzować za pomocą mikroskopii elektronowej, spektroskopii absorpcyjnej UV-Vis i spektroskopii fluorescencyjnej. Wydajność kwantowa może być obliczana bezwzględnie przy użyciu kuli całkującej lub względnie w porównaniu ze znanym wzorcem przy użyciu metod odniesienia 15.

3. Przeniesienie fazy

1. Dodać oczyszczony rdzeń/otoczkę Hg_xCd_1-xSe/Cd_yZn_1-yS QDs (5 ml, 20 μM) do kolby 3-szyjkowej o pojemności 50 ml i usunąć heksan pod wysokim podciśnieniem, aby uzyskać suchy film. Napełnić kolbę argonem, dodać bezwodną pirydynę (3 ml) do warstwy nanocząstek i podgrzać zawiesinę do temperatury 80 °C. W ciągu 1-2 godzin nanocząstki całkowicie się rozpuszczą.
2. Dodać 1-tioglicerol (1 ml) do roztworu i mieszać w temperaturze 80 °C przez 2 godziny. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i dodać trietyloaminę (0,5 ml) w celu deprotonowania tioglicerolu. Mieszaj przez 30 minut. Roztwór może stać się mętny po dodaniu trietyloaminy ze względu na słabą rozpuszczalność polarnych nanokryształów w tej mieszaninie rozpuszczalników.
3. Przenieść roztwór QD do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej mieszaninę 20 ml heksanu i 20 ml acetonu i dobrze wymieszać. Wyizolować wytrącone nanokryształy przez odwirowanie (5 000 x g, 10 min) i przemyć osad acetonem.
4. Rozpuść osad QD w DMSO (5 ml) za pomocą sonikacji kąpielowej, a następnie odwiruj (7 000 x g, 10 min) w celu usunięcia ewentualnych agregatów. Określić stężenie nanocząstek z widma absorpcyjnego UV-Vis. Ten roztwór czystych QD należy zużyć w ciągu 3 godzin, ponieważ tiole powierzchniowe mogą powoli utleniać się w warunkach otoczenia w powietrzu.
5. Rozcieńczyć roztwór QD do 10 μM lub mniej za pomocą DMSO i przenieść do kolby o pojemności 50 ml. Przygotować 5 mg/ml roztwór tiolowanego kwasu poliakrylowego (synteza opisana w dodatku) w DMSO. Roztwór polimeru (0,15 mg polimeru na nmol QD) dodawać kroplami do roztworu QD, mieszając i odgazowując roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
6. Przedmuchnąć roztwór QD/polimeru argonem i podgrzewać do temperatury 80 °C przez 90 minut. Następnie schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i kroplami dodać równą objętość 50 mM boranu sodu o pH 8. Mieszaj przez 10 minut.
7. Oczyścić QD przez dializę (odcięcie 20 kDa) w 50 mM boranu sodu, pH 8, a następnie zagęścić cząstki za pomocą filtra odśrodkowego (odcięcie 10 kDa). Oznaczyć stężenie na podstawie widma absorpcyjnego UV-VIS.

4. Powłoka PEG

1. W szklanej fiolce o pojemności 4 ml z mieszadłem wymieszać 1 nmol QD w buforze boranowym z 40 000 x nadmiarem molowym 750 Da glikolu monoaminopolietylenowego (30 mg, 40 μmol). Jeśli do nanokryształów ma zostać dodana określona funkcja chemiczna (np. hydrazyd lub maleimid), można ją wprowadzić poprzez zastąpienie frakcji amino-PEG heterobifunkcyjnym amino-PEG (zwykle dobrze sprawdza się frakcja molowa 30%). Rozcieńczyć roztwór nanokryształów do objętości 1 μM buforem boranowym. Ta reakcja może być skalowana zgodnie z potrzebami.
2. Przygotować świeży roztwór DMTMM (20 mg, 72 μmol) w DMSO (144 μl). Roztwór ten można krótko podgrzać pod strumieniem ciepłej wody z kranu lub zanurzyć w sonikatorze kąpielowym, aby całkowicie rozpuścić DMTMM. Szybko dodaj 25 000 x molowy nadmiar tego 0,5 M roztworu DMTMM (50 μl) do roztworu QD i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
3. Powtórz krok 4.2 jeszcze cztery razy, aby nasycić powierzchnię nanokryształu PEG. Na koniec dodaj 200 μl 1 M buforu Tris, aby wygasić reakcję i oczyścić nanokryształy za pomocą dializy, filtrów odśrodkowych lub ultrawirowania.
4. Nanokryształy można analizować pod kątem monodyspersyjności, wielkości hydrodynamicznej i ładunku powierzchniowego za pomocą chromatografii cieczowej, elektroforezy w żelu agarozowym i mikroskopii fluorescencyjnej. Aby określić wielkość hydrodynamiczną i rozkład wielkości za pomocą zautomatyzowanego systemu chromatografii cieczowej (GE AKTAprime Plus), należy użyć kolumny Superose 6, natężenia przepływu 0,5 ml/min z eluentem buforowym PBS i detekcji absorpcji przy 260 lub 280 nm. Porównaj czasy elucji nanocząstek z czasami wymywania wzorców masy cząsteczkowej. Do elektroforezy w żelu agarozowym należy przygotować 0,5% żel agarozowy w 50 mM buforze boranowym sodu (pH 8,5) lub 50 mM buforze fosforanu sodu (pH 7,4), wymieszać 1 μM sample z 10% glicerolem i załadować do studzienek, a następnie pracować pod napięciem 100 V przez 30 min. Zobrazuj nanokryształy w żelu za pomocą różdżki ręcznej UV lub transiluminatora UV oraz do wzbudzenia fluorescencji. Aby zobrazować nanokryształy na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, rozcieńczyć cząstki do 0,2 nM w buforze fosforanowym 10 mM, upuść 2,5 μl roztworu na szklane szkiełko nakrywkowe i ostrożnie umieść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu płynnej kulki, aby rozprowadzić film między szkiełkami nakrywkowymi. Zobrazuj cząstki związane z powierzchnią za pomocą obiektywu o dużej aperturze numerycznej (najlepiej co najmniej 1,40) w trybie epifluorescencji lub TIRF ze wzbudzeniem na długościach fal w zakresie 400-580 nm i kamery CCD zwielokrotniającej elektrony. Dokładne parametry obrazowania będą się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopowej.

Results

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne widma absorpcji i fluorescencji dla nanokryształów CdSe, Hg_xCd_1-xSe nanokryształów po wymianie kationów oraz Hg_xCd_1-xSe/Cd_yZn_1-yS nanokryształów po wzroście powłoki. Nanokryształy rdzenia CdSe mają kwantową wydajność fluorescencji bliską 15% (w tym emisję głębokich pułapek na długich falach), ale wydajność ta spada do mniej niż 1% po wymianie rtęci, prawdopodobnie z powodu pułapek nośników ładunku wpro...

Discussion

W porównaniu z konwencjonalnymi kropkami kwantowymi CdSe, nanokryształy trójskładnikowego stopu Hg_xCd_1-xSe można dostrajać niezależnie pod względem wielkości i długości fali fluorescencji. Rozmiar jest najpierw wybierany podczas syntezy rdzeni nanokrystalicznych CdSe, a długość fali fluorescencji jest wybierana w etapie wtórnej wymiany kationów rtęci, co nie zmienia zasadniczo rozmiaru nanokryształu ⁹. Ważne jest, aby oczyszczone nanokryształy Hg_xCd_1-xSe inkubować ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Selen	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-oktylofosfina	Strem	15-6655	97% czysty, niestabilny w powietrzu
Tlenek kadmu	Sigma-Aldrich	202894	Wysoce toksyczny: zachowaj ostrożność
Kwas tetradecylofosfonowy	Synteza PCI	4671-75-4
Oktadecen	Alfa Aesar	L11004	Klasa techniczna
Heksadecyloamina	Sigma-Aldrich	H7408
Difenylofosfina	Sigma-Aldrich	252964	Piroforyczny
octan rtęci	Sigma-Aldrich	456012	Wysoce toksyczny: zachowaj ostrożność
1-oktanotiol	Sigma-Aldrich	471836	Silny zapach
Kwas oleinowy	Sigma-Aldrich	W281506
Octan	Alfa Aesar	35792
Octan kadmu hydrat	Sigma-Aldrich	229490	Wysoce toksyczny: należy zachować ostrożność
Oleylamine	Fisher Scientific	AC12954	Niestabilny w powietrzu
Siarka	Sigma-Aldrich	344621
Tlenek trioktylofosfiny	Strem	15-6661	99%
Pirydyna	VWR	EM-PX2012-6	Bezwodny
tioglicerol	Sigma-Aldrich	M1753	Silny zapach
Trietyloamina	Sigma-Aldrich	471283	Rurki do dializy bezwodnej
	Spectrum Labs	131342	odcięcie 20 kDa
Filtr odśrodkowy	Millipore	UFC801024	odcięcie 10 kDa
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4-(4,6-dimetoksy-1,3,5-triazyno-2-ylo)-4-metylomorfoliniowy hydrat chlorku	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus System chromatograficzny	GE HealthCare
Superose 6 10/300 GL kolumna chromatograficzna	GE HealthCare	17-5172-01
Agaroza, OmniPur	VWR	EM-2120
Dodatek Synteza oktanotiolanu rtęci: Powoli dodawaj roztwór metanolu octanu rtęci (1 eq.) do roztworu mieszającego 1-oktanetiolu (3 eq.) i wodorotlenku potasu (3 eq.) w metanolu w temperaturze pokojowej. Wyizolować osad oktanotiolanu rtęci(II) przez filtrację, przemyć dwa razy metanolem i raz eterem, a następnie wysuszyć w próżni. Synteza polimeru wielozębowego: Rozpuścić kwas poliakrylowy (1 g, 1,773 Da) w 25 ml dimetyloformamidu (DMF) w 150 ml kolbie trójszyjkowej i bańkować argonem przez 30 min. Dodać bezwodny roztwór cysteaminy (374 mg, 4,87 mmol) w 10 ml DMF. W temperaturze pokojowej, energicznie mieszając, powoli dodawać bezwodny diizopropylokarbodimid (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) przez 30 minut, a następnie trietyloaminę (170 μ l, 1,22 mmol) i pozwól reakcji postępować przez 72 godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Dodać mercapt– tanol (501 mg, 6,41 mmol) w celu wygaszenia reakcji i mieszać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Usunąć DMF poprzez odparowanie rotacyjne i wyizolować polimer z dodatkiem mieszaniny 2:1 lodowatego acetonu:chloroformu, a następnie odwirować. Rozpuść polimer w ~5 ml bezwodnego DMF, przefiltruj, ponownie wytrącić eterem dietylowym i powtórzyć. Wysuszyć produkt w próżni i przechowywać w argonie. Oznaczanie średnicy rdzenia CdSe: Z widma absorpcyjnego UV-Vis wyznacz długość fali pierwszego piku ekscytonu (λ, w nm), który jest najdłuższym szczytem długości fali (np. około 498 nm dla CdSe w Rysunek 2a), i użyj krzywej rozmiarów Mulvaneya i współpracowników 12: Oznaczanie stężenia nanokryształów CdSe: Z odjętego tła widma UV-Vis optycznie przezroczystego roztworu nanokryształów CdSe określić absorpcję przy długości fali 350 nm. Seryjne rozcieńczenia można wykorzystać do określenia, czy absorpcja optyczna mieści się w liniowym zakresie prawa Beera. Stężenie nanokryształów (QD, w M) można określić poprzez wprowadzenie średnicy nanokryształu (D, w nm), wartości absorpcji optycznej (A3sa) oraz długości drogi kuwety (l, w cm) do następującego równania z empirycznej korelacji Bawendi i współpracowników 13: