Pomiar wpływu przeciwciał na funkcję komórkową izolowanych kardiomiocytów

Summary

Przedstawiona metoda oferuje sposób na wykrycie funkcjonalnych, skutecznych autoprzeciwciał kardiotropowych w osoczu pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową, niezależnie od specyficznego antygenu, poprzez analizę wpływu izolowanej immunoglobuliny pacjenta na skracanie komórek i wewnątrzkomórkowe stany przejściowe wapnia w izolowanych kardiomiocytach szczurów.

Abstract

Kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM) jest jedną z głównych przyczyn niewydolności serca u młodszych dorosłych¹. Chociaż predyspozycje genetyczne i narażenie na substancje toksyczne są znanymi przyczynami tej choroby u około jednej trzeciej pacjentów, pochodzenie DCM pozostaje w dużej mierze niejasne. U znacznej liczby tych pacjentów wykryto autoprzeciwciała przeciwko epitopom sercowym i podejrzewa się, że odgrywają kluczową rolę w wystąpieniu i progresji choroby^2,3. Znaczenie autoprzeciwciał sercowych podkreśla poprawa hemodynamiczna obserwowana u pacjentów z DCM po eliminacji autoprzeciwciał przez immunoadsorpcję^3-5. Zidentyfikowano już różne specyficzne antygeny^2,3, a przeciwciała przeciwko tym celom mogą być wykrywane za pomocą testów immunologicznych. Jednak testy te nie są w stanie odróżnić autoprzeciwciał stymulujących (a zatem funkcjonalnie skutecznych) i blokujących. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że to rozróżnienie ma kluczowe znaczenie^6,7. Można również założyć, że cele dla wielu przeciwciał kardiotropowych są nadal niezidentyfikowane i dlatego nie mogą być wykryte za pomocą testów immunologicznych. W związku z tym opracowaliśmy metodę wykrywania funkcjonalnie aktywnych przeciwciał kardiotropowych, niezależnie od ich odpowiedniego antygenu. Podstawą tej metody jest wysoka homologia obserwowana zwykle dla funkcjonalnych regionów białek serca pomiędzy ssakami^8,9. Sugeruje to, że przeciwciała sercowe skierowane przeciwko ludzkim antygenom będą reagować krzyżowo z komórkami docelowymi innymi niż ludzkie, co umożliwia testowanie IgG od pacjentów z DCM na kardiomiocytach dorosłych szczurów. Nasza metoda składa się z 3 etapów: po pierwsze, IgG izoluje się z osocza pacjenta za pomocą przeciwciał anty-IgG sprzężonych z sefarozą uzyskanych z kolumn immunoadsorpcyjnych (PlasmaSelect, Teterow, Niemcy). Po drugie, dorosłe kardiomiocyty są izolowane przez perfuzję kolagenazy w aparacie perfuzyjnym Langendorffa przy użyciu protokołu zmodyfikowanego w stosunku do poprzednich prac^10,11. Otrzymane kardiomiocyty są umieszczane w komorowych szkiełkach pokrytych lamininą i barwione Fura-2, selektywnym barwnikiem fluorescencyjnym o selektywnym wapniu, który można łatwo wprowadzić do komórki w celu obserwacji wewnątrzkomórkowej zawartości wapnia (^Ca2+)¹². W ostatnim etapie wpływ IgG pacjenta na skrócenie komórek i stany przejściowe Ca^{2 +} kardiomiocytów stymulowanych polem jest monitorowany online za pomocą komercyjnego systemu monitorowania wapnia i kurczliwości miocytów (IonOptix, Milton, MA, USA) podłączonego do standardowego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Protocol

1. Izolacja IgG od próbek pobranych od pacjentów

1. Przygotować kolumny mini-immunoadsorpcji, wypełniając 3 ml sefarozy anty-IgG na 2 ml osocza EDTA pacjenta do pustej kolumny Econo Pac. Izolacja IgG wymaga co najmniej 2 ml osocza pacjenta.
2. Umieść filtr na wierzchu sefarozy anty-IgG, rozetnij dolną końcówkę kolumny i dociśnij filtr, aby osiągnąć natężenie przepływu około 1 kropli / s. Pozwól, aby roztwór konserwujący wyczerpał się z kolumny.
3. Przemyć kolumnę 3 objętościami 0,9% NaCl na objętość osocza.
4. Odpipetować osocze znajdujące się na kolumnie. Gdy osocze całkowicie zanurzy się w sefarozie anty-IgG, przemyć tą samą objętością 0,9% NaCl.
5. Pobrać pipetę do jednej objętości osocza 0,2 M chlorowodorku glicyny o pH 2,8 na kolumnę i pozostawić do zanurzenia w sefarozie. Dodać kolejną objętość chlorowodorku glicyny do kolumny. Zebrać przepływ do probówki o pojemności 15 ml i dostosować pH do 7,3 za pomocą 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
6. W celu regeneracji kolumny należy przemyć 3 objętościami osocza chlorowodorek glicyny. Po końcowym przepłukaniu 2 objętościami 0,9% NaCl, kolumna może być użyta do następnej próbki osocza. Alternatywnie, kolumnę można napełnić roztworem konserwującym i przechowywać w temperaturze 4 - 8 °C przez okres do 4 tygodni.
7. Do stosowania na kardiomiocytach pobrana frakcja IgG musi być dializowana z eksperymentalnym buforem (EB). Do przygotowania EB dodać 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM CaCl 2,10 mM HEPES i 20 mM glukozy do 1 l wody destylowanej na mieszadle magnetycznym i dostosować pH do 7,3.
8. Napełnić frakcję IgG do probówki z membraną dializacyjną z estru celulozy o masie cząsteczkowej odciętej 100 kDa. Umieścić probówkę w 1 l EB i powoli mieszać mieszadłem magnetycznym w temperaturze 4 °C. Po 8 godzinach przenieść rurkę dializacyjną do 3 l świeżego EB i dializować przez kolejne 20 godzin w temperaturze 4 °C.
9. Po dializie podgrzewać próbkę przez 30 minut w temperaturze 57 °C w łaźni wodnej w celu dezaktywacji czynników dopełniacza. Oznaczyć całkowite stężenie IgG i przygotować podwielokrotności zawierające 330 μg IgG każdy. Dodając próbkę do kardiomiocytów w celu pomiaru (krok 4.3), należy wypełnić podwielokrotności do 1 ml EB. Nierozcieńczone podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

2. Izolacja kardiomiocytów szczurów

1. W celu przygotowania buforu izolacyjnego (IB) wolnego od Ca²⁺ należy dodać 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM_MgSO4, 1,2 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES i 11 mM glukozy do 1 l wody destylowanej za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosuj pH do 7,4 w temperaturze pokojowej i przefiltruj przez filtr butelkowy 0,2 μm w celu sterylizacji.
2. Napełnij 80 ml IB w górnym zbiorniku termostatowanego systemu perfuzyjnego Langendorffa. Dostosuj ustawienia termostatu, aby utrzymać temperaturę bufora 37 °C i napowietrzać bufor 95% O₂/5% CO_{2 przez} 30 minut.
3. Odważyć około 10 000 - 12 000 j. kolagenazy typu II, 175 mg BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i rozpuścić w 20 ml IB zawierającym 22,5 μl 100 mM roztworu podstawowego CaCl₂. Kontrolować pH buforu izolacyjnego w górnym zbiorniku i w razie potrzeby wyregulować.
4. Znieczulić szczura rasy Wistar o wadze 175 - 200 g tiopentalem o stężeniu 375 μg/kg masy ciała. Dodać 2500 j.m. heparyny do roztworu tiopentalu. Po torakotomii ostrożnie wyciąć serce z nienaruszonym łukiem aorty i przenieść je do lodowatego 0,9% NaCl. Oczyść serce z krwi i otaczających tkanek i przenieś do świeżego 0,9% NaCl. Odsłoń aortę, otwórz reduktor przepływu systemu Langendorffa, aby uzyskać prędkość opadania 2-3/s i przymocuj serce do kaniuli.
5. Wykonuj fuzję serca przez maksymalnie 3 minuty z szybkością przepływu 1 kropli/s, aby wypłukać pozostałą krew. Zacznij wprowadzać IB do obiegu w systemie Langendorffa. Usunąć 20 ml buforu z górnego zbiornika, napełnić roztworem kolagenazy i ponownie napełnić tyle buforu, ile jest potrzebne, aby osiągnąć 80 ml. Cyrkuluj roztwór kolagenazy przez kolejne 27 minut. Natężenie przepływu powinno być okresowo kontrolowane i utrzymywane na poziomie 1 kropli/s za pomocą reduktora przepływu.
6. Odłącz serce od kaniuli, oczyść z przedsionków i aorty i pokrój na małe kawałki. Pozwolić, aby roztwór kolagenazy spłynął do dolnego zbiornika, zmniejszyć objętość do maksymalnie 40 ml i dalej trawić posiekane komory przez 10 - 15 minut pod ciągłym napowietrzaniem 95% O₂/5% CO_{2 .} Następnie przefiltrować zawiesinę komórek przez gazę o rozmiarze oczek 200 μm do probówki o pojemności 50 ml.
7. Przywróć zawartość Ca²⁺ w komórkach w 3 etapach: odwirować zawiesinę komórek przy 43 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w 10 ml IB zawierającym 200 μM CaCl₂. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w 10 ml IB z 500 μM CaCl₂. Po końcowym odwirowaniu zawiesić kardiomiocyty w sterylnym, przefiltrowanym EB (patrz 1.8) do gęstości 50 000 komórek/ml.

3. Barwienie kardiomiocytów Fura-2

1. Pokryj 4-komorowe szkło nakrywkowe 10 μg lamininy na studzienkę i poczekaj, aż całkowicie wyschnie.
2. Wlać 1 ml zawiesiny kardiomiocytów do każdej studzienki za pomocą mikropipety z odciętą końcówką. Pozwól komórkom przylegać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Rozcieńczyć 10 μl roztworu podstawowego Fura-2 AM o stężeniu 1 mg/ml w 5 ml EB. Roztwór barwiący należy przechowywać w ciemności.
4. Zdjąć bufor i nieprzyłączone komórki ze szkła nakrywkowego i odpipetować 0,5 ml roztworu barwiącego do każdej studzienki. Inkubować komórki przez 10 minut pod umiarkowanym wstrząsaniem. Następnie zdjąć roztwór barwiący, przemyć komórki raz 1 ml EB, a na koniec wlać 0,5 ml EB do każdej studzienki. Unikaj bezpośredniego światła podczas procesu barwienia i zawsze trzymaj poplamione komórki w ciemności.

4. Rejestracja skrócenia komórek i stanów przejściowych Ca²⁺

1. Umieść szkło nakrywkowe z komorą na mikroskopie fluorescencyjnym podłączonym do systemu rejestracji wapnia i kurczliwości miocytów. Umieść specjalnie wykonaną elektrodę z rurką dopływową i odpływową w pierwszej studzience. Superfuzja kardiomiocytów z 1 ml/min EB i rozpoczęcie stymulacji elektrycznej (20 V, 1 Hz, czas trwania 5 ms). Pozwól komórkom przystosować się do stymulacji przez około 2 minuty.
2. Wybierz nienaruszony kardiomiocyt w kształcie pręta z wyraźnym prążkiem i ciągłym skurczem. Umieść komórkę na środku pola widzenia i otwórz kanał kamery. Ustaw komórkę poziomo w obszarze wideo, obracając adapter ramki do komórek i przesuwając stolik mikroskopu.
3. Wyreguluj elementy sterujące wykrywaniem krawędzi w obszarze wideo (rysunek 2), otwórz kanał fluorescencyjny i zarejestruj 10 - 15 skurczów, aby uzyskać początkowe skrócenie komórek i stan przejściowy Ca²⁺.
4. Zamknij kanał świetlny mikroskopu, aby uniknąć blaknięcia plamy fluorescencyjnej. Przełączyć przepływ z EB na obejście próbki za pomocą zaworu 3-drogowego i superfuzję kardiomiocytów za pomocą 1 ml IgG pacjenta. Zatrzymaj pompę tuż przed tym, jak powietrze dotrze do studni.
5. Otwórz kanał świetlny i zarejestruj kolejne 10-15 skurczów, aby uzyskać ostrą odpowiedź komórkową. Wstrzymaj nagrywanie i ponownie zamknij kanał świetlny. Powtórz nagrywanie po 2 i 5 minutach.
6. Wyjmij elektrodę ze studni. Dokładnie wyczyść probówki za pomocą EB i kontynuuj z następnym dołkiem komorowego szkła nakrywkowego.
7. Analizuj skrócenie komórek i stan nieustalony Ca²⁺ za pomocą oprogramowania IonWizard, używając odpowiednio okna "Edge-Length/Length" i "fura 2-Numeric subtracted/Ratio". Obliczyć procentową zmianę w stosunku do początkowego skrócenia komórek i stanu przejściowego Ca²⁺ wysokości piku w odniesieniu do linii podstawowej (bl% szczyt h) dla odpowiedzi ostrej, 2 min i 5 min.

Results

Dwa przykłady pomiaru inotropii komórkowej w stymulowanych polem dorosłych kardiomiocytach (Rysunek 2) przy użyciu miocytów Ca²⁺ i systemu rejestracji kurczliwości są podane poniżej. Rycina 3 sprawia wrażenie pomiaru kontrolnego, natomiast na rycinie 4 pokazano wpływ przeciwciał kardiodepresyjnych u pacjenta z DCM.

W obu przykładach, początkowe skrócenie komórek i przejściowe Ca²⁺ podczas superfuzji z EB wykazują wyraźne ...

Discussion

Przedstawiona metoda stanowi odpowiedni sposób wykrywania funkcjonalnie skutecznych autoprzeciwciał sercowych u pacjentów z DCM o niejasnym pochodzeniu. W porównaniu z innymi metodami, np. wykrywaniem funkcjonalnych aktywnych przeciwciał przeciwko β1-adrenergicznemu na podstawie ich wpływu na poziomy cAMP⁶, nasza metoda jest niezależna od określonego epitopu. Oczywiście istnieją inne testy niezależne od epitopów opisane w literaturze, tj. liczenie szybkości bicia kardiomiocytów noworodków

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwór konserwujący Immunosorba	Fresenius Medical Care	903609211
System komórkowy	kolagenazy typu 2	LS004176
BSA, bez kwasów tłuszczowych	Sigma-Aldrich	A6003
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-2 AM	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg/ml w DMSO
Econo Pac Kolumny chromatograficzne	BioRad	732-1010
Spectra/Por Biotech Membrana do dializy z estrów celulozy	Spectrumlabs	131417
4-dołkowa komorowa szklana osłona	Nunc	155383
System rejestracji wapnia i kurczliwości	IonOptix
Oprogramowanie analityczne IonWizard 6.0	IonOptix