Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Lars G. Eckerle; Stephan B. Felix; Lars R. Herda

doi:10.3791/4237

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4237

⸱

8 marca 2013

Lars G. Eckerle¹ , Stephan B. Felix¹ , Lars R. Herda¹

¹Department of Internal Medicine B, University Medicine Greifswald

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona metoda umożliwia wykrycie funkcjonalnych, efektywnych kardiotropowych autoprzeciwciał w osoczu pacjentów z rozstrzeniowym kardiomiopatią, niezależnie od konkretnego antygenu, poprzez analizę wpływu wyizolowanych immunoglobulin pacjenta na skracanie się komórek oraz wewnątrzkomórkowe przejścia wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

Streszczenie

Kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM) jest jedną z głównych przyczyn niewydolności serca u młodszych dorosłych¹. Choć predyspozycje genetyczne i ekspozycja na substancje toksyczne są znanymi przyczynami tej choroby w przypadku około jednej trzeciej pacjentów, pochodzenie DCM pozostaje w dużej mierze niejasne. U znacznej liczby tych pacjentów wykryto autoprzeciwciała przeciwko epitopom serca, które prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w początkach i progresji choroby^2,3. Znaczenie autoprzeciwciał przeciwsercowych podkreśla poprawa hemodynamiczna obserwowana u pacjentów z DCM po usunięciu autoprzeciwciał za pomocą immunoadsorpcji^3-5. Zidentyfikowano już szereg specyficznych antygenów^2,3, a przeciwciała przeciwko tym celom można wykryć za pomocą testów immunoanalitycznych. Jednak testy te nie pozwalają odróżnić autoprzeciwciał stymulujących (a zatem funkcjonalnie aktywnych) od blokujących. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że rozróżnienie to jest kluczowe^6,7. Można również założyć, że cele dla wielu przeciwciał kardiotropowych nie zostały jeszcze zidentyfikowane, przez co nie mogą być wykrywane za pomocą testów immunoanalitycznych. W związku z tym opracowaliśmy metodę wykrywania funkcjonalnie aktywnych przeciwciał kardiotropowych, niezależnie od ich odpowiedniego antygenu. Podstawą tej metody jest wysoka homologia zazwyczaj obserwowana dla regionów funkcjonalnych białek serca u ssaków^8,9. Sugeruje to, że przeciwciała sercowe skierowane przeciwko antygenom ludzkim będą wykazywać reakcję krzyżową z nie-ludzkimi komórkami docelowymi, co umożliwia testowanie IgG od pacjentów z DCM na kardiomiocytach dorosłego szczura. Nasza metoda składa się z 3 etapów: po pierwsze, IgG jest izolowane z osocza pacjenta przy użyciu przeciwciał przeciw-IgG sprzężonych z sefarozą, pochodzących z kolumn do immunoadsorpcji (PlasmaSelect, Teterow, Niemcy). Po drugie, kardiomiocyty dorosłych osobników są izolowane poprzez perfuzję kolagenazą w aparacie perfuzyjnym Langendorffa, stosując protokół zmodyfikowany na podstawie wcześniejszych prac^10,11. Uzyskane kardiomiocyty są przytwierdzone do szkiełek nakrywkowych z komorami pokrytymi lamininą i barwione Fura-2, fluorescencyjnym barwnikiem selektywnym dla wapnia, który może być łatwo wprowadzony do komórki w celu obserwacji wewnątrzkomórkowej zawartości wapnia (Ca²⁺)¹². W ostatnim kroku efekt IgG pacjenta na skróceniu komórki i przejściowych zmianach poziomu Ca²⁺ w kardiomiocytach stymulowanych polem elektrycznym jest monitorowany online przy użyciu komercyjnego systemu monitorowania wapnia i kurczliwości miocytów (IonOptix, Milton, MA, USA) podłączonego do standardowego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Protokół

1. Izolacja IgG z próbek pacjentów

Przygotować minikolumny do immunoadsorpcji, wypełniając pustą kolumnę Econo Pac sepharosem anty-IgG w proporcji 3 ml na każde 2 ml osocza pacjenta pobranego w EDTA. Izolacja IgG wymaga co najmniej 2 ml osocza pacjenta.
Na wierzchu sepharosu anty-IgG umieścić filtr, odciąć dolną końcówkę kolumny i docisnąć filtr tak, aby uzyskać szybkość przepływu wynoszącą około 1 kropli/s. Pozwolić na całkowite wypłukanie roztworu konserwującego z kolumny.
Przemyć kolumnę 0,9% NaCl w ilości 3 objętości roztworu na każdą objętość osocza.
Napepipetować osocze na kolumnę. Po całkowitym wniknięciu osocza w sepharose anty-IgG przemyć kolumnę taką samą objętością 0,9% NaCl.
Napepipetować na kolumnę jedną objętość osocza 0,2 M glicyny HCl o pH 2,8 i pozwolić jej wniknąć w sepharose. Dodać kolejną objętość glicyny HCl na kolumnę. Zebrać filtrat do probówki 15 ml i dostosować pH do 7,3 za pomocą 0,5 M Tris-HCl o pH 8,0.
W celu regeneracji kolumny przemyć ją 3 objętościami osocza glicyną HCl. Po końcowym przemyciu 2 objętościami 0,9% NaCl kolumna może być użyta do następnej próbki osocza. Alternatywnie kolumnę można wypełnić roztworem konserwującym i przechowywać w temperaturze 4 – 8 °C do 4 tygodni.
Do zastosowania na kardiomiocytach zebrana frakcja IgG musi zostać poddana dializie przeciwko buforowi eksperymentalnemu (EB). Aby przygotować EB, do 1 L wody destylowanej na mieszadle magnetycznym dodać 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES oraz 20 mM glukozy i dostosować pH do 7,3.
Frakcję IgG przelać do probówki z membraną dializacyjną z octanu celulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 100 kDa. Umieścić probówkę w 1 L EB i powoli mieszać mieszadłem magnetycznym w temperaturze 4 °C. Po 8 h przenieść probówkę dializacyjną do 3 L świeżego EB i dializować przez kolejne 20 h w temperaturze 4 °C.
Po dializie podgrzewać próbkę przez 30 min w temperaturze 57 °C w kąpieli wodnej w celu inaktywacji czynników dopełniacza. Wyznaczyć całkowite stężenie IgG i przygotować aliquoty zawierające po 330 μg IgG. Przy dodawaniu próbki do kardiomiocytów w celu pomiaru (krok 4.3), dopełnić aliquoty do 1 ml za pomocą EB. Niediluowane aliquoty można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

2. Izolacja kardiomiocytów szczura

W celu przygotowania buforu do izolacji (IB) pozbawionego Ca²⁺, do 1 L wody destylowanej dodać 110 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 1.2 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 20 mM HEPES oraz 11 mM glukozy, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosować pH do 7.4 w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez filtr nakrętkowy 0.2 μm w celu sterylizacji.
Wypełnić górny zbiornik termostatowanego systemu perfuzji Langendorffa 80 ml buforu IB. Ustawić parametry termostatu tak, aby utrzymać temperaturę buforu na poziomie 37 °C, i napowietrzać bufor mieszaniną 95% O₂/5% CO₂ przez 30 min.
Odważyć około 10 000 - 12 000 U kolagenazy typu II oraz 175 mg BSA wolnej od kwasów tłuszczowych i rozpuścić w 20 ml IB zawierającego 22.5 μl roztworu stokowego 100 mM CaCl₂. Skontrolować pH buforu izolacyjnego w górnym zbiorniku i w razie potrzeby je skorygować.
Zanestetyzować szczura szczepu Wistar o masie 175 - 200 g za pomocą tiopentalu w dawce 375 μg/kg masy ciała. Do roztworu tiopentalu dodać 2500 IU heparyny. Po torakotomii ostrożnie wyciąć serce wraz z nienaruszonym łukiem aorty i przenieść je do lodowatego 0.9% NaCl. Oczyścić serce z krwi i tkanek otaczających, a następnie przenieść do świeżego 0.9% NaCl. Odsłonić aortę, otworzyć reduktor przepływu systemu Langendorffa, aby uzyskać szybkość kapania 2-3/sek, i przymocować serce do kaniuli.
Przeprowadzić perfuzję serca przez maksymalnie 3 min przy szybkości przepływu 1 kropla/sek w celu wypłukania pozostałej krwi. Rozpocząć cyrkulację buforu IB w systemie Langendorffa. Odlać 20 ml buforu z górnego zbiornika, wlać roztwór kolagenazy i uzupełnić bufor do objętości 80 ml. Cyrkulować roztwór kolagenazy przez kolejne 27 min. Szybkość przepływu należy okresowo kontrolować i utrzymywać na poziomie 1 kropla/sek za pomocą reduktora przepływu.
Odłączyć serce od kaniuli, usunąć przedsionki oraz aortę i posiekać na małe kawałki. Pozwolić roztworowi kolagenazy spłynąć do dolnego zbiornika, zredukować jego objętość do maksymalnie 40 ml i kontynuować trawienie posiekanych komór przez 10 - 15 min przy ciągłym napowietrzaniu mieszaniną 95% O₂/5% CO₂. Następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez gazę o rozmiarze oczek 200 μm do probówki 50 ml.
Przywrócić zawartość Ca²⁺ w komórkach w 3 etapach: odwirować zawiesinę komórkową przy 43 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej i resuspenderć komórki w 10 ml IB zawierającego 200 μM CaCl₂. Ponownie odwirować i resuspenderć komórki w 10 ml IB z 500 μM CaCl₂. Po końcowym wirowaniu resuspenderć kardiomiocyty w sterylnie przefiltrowanym EB (patrz 1.8) do gęstości 50 000 komórek/ml.

3. Barwienie kardiomiocytów barwnikiem Fura-2

Pokryć szkiełko podstawowe z 4 komorami lamininą w ilości 10 μg na komorę i odczekać do całkowitego wyschnięcia.
Do każdej komory wprowadzić 1 ml zawiesiny kardiomiocytów za pomocą mikropipety z odciętym końcem. Pozostawić komórki do przyczepienia na 1 hr w temperaturze pokojowej.
Rozcieńczyć 10 μl roztworu stokowego Fura-2 AM o stężeniu 1 mg/ml w 5 ml EB. Roztwór barwiący przechowywać w ciemności.
Usunąć bufor i nieprzyczepione komórki ze szkiełka, a następnie do każdej komory nanieść 0,5 ml roztworu barwiącego. Inkubować komórki przez 10 min przy umiarkowanym wstrząsaniu. Następnie usunąć roztwór barwiący, przepłukać komórki raz 1 ml EB i na koniec wprowadzić 0,5 ml EB do każdej komory. Podczas procesu barwienia unikać bezpośredniego naświetlania, a zabarwione komórki zawsze przechowywać w ciemności.

4. Rejestracja skracania się komórek i przejściowych zmian stężenia Ca²⁺

Umieść szkiełko nakrywkowe z komorami na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym połączonym z systemem zapisu wapnia i kurczliwości miocytów. Umieść wykonaną na zamówienie elektrodę z rurką doprowadzającą i odprowadzającą w pierwszej komorze. Przepłukuj kardiomiocyty EB z prędkością 1 ml/min i rozpocznij stymulację elektryczną (20 V, 1 Hz, czas trwania 5 msec). Pozostaw komórki do adaptacji do stymulacji przez około 2 min.
Wybierz nienaruszonego, pręcikowatego kardiomiocyta z wyraźnymi prążkowaniami i stałym skurczem. Ustaw komórkę w centrum pola widzenia i otwórz kanał kamery. Zorientuj komórkę poziomo w obszarze wideo, obracając adapter kadrowania komórek i przesuwając stolik mikroskopu.
Dostrój elementy sterujące detekcją krawędzi obszaru wideo (Rysunek 2), otwórz kanał fluorescencyjny i zarejestruj 10–15 skurczów, aby uzyskać początkowe skrócenie komórki i przejściowy wzrost Ca²⁺.
Zamknij kanał świetlny mikroskopu, aby uniknąć blaknięcia barwnika fluorescencyjnego. Przełącz przepływ z EB na obejście próbki za pomocą zaworu trójdrożnego i przepłucz kardiomiocyty 1 ml IgG pacjenta. Zatrzymaj pompę tuż przed dotarciem powietrza do komory.
Otwórz kanał świetlny i zarejestruj kolejne 10–15 skurczów, aby uzyskać ostrą odpowiedź komórki. Wstrzymaj zapis i ponownie zamknij kanał świetlny. Powtórz rejestrację po 2 i 5 min.
Wyjmij elektrodę z komory. Dokładnie oczyść rurki za pomocą EB i przejdź do następnej komory szkiełka nakrywkowe.
Przeanalizuj skrócenie komórki i przejściowy wzrost Ca²⁺ za pomocą oprogramowania IonWizard, korzystając odpowiednio z okien „Edge-Length/Length” oraz „fura 2-Numeric subtracted/Ratio”. Oblicz procentową zmianę wysokości szczytu w stosunku do linii bazowej (bl%peak h) względem początkowego skrócenia komórki i przejściowego wzrostu Ca²⁺ dla odpowiedzi ostrej, po 2 min i po 5 min.