Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.
Artykuł metodologiczny
Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Krążące komórki nowotworowe (CTC) to komórki, które odrywają się od guza pierwotnego i rozprzestrzeniają w układzie krwionośnym, co w konsekwencji może prowadzić do powstania przerzutów w odległych miejscach. Liczbę CTC można wykorzystać do monitorowania postępu choroby na podstawie korelacji między stężeniem CTC we krwi a stopniem zaawansowania schorzenia1. Jako narzędzie terapeutyczne, CTC mogą być badane w laboratorium w celu opracowania terapii spersonalizowanych. W tym celu izolacja CTC nie może powodować uszkodzeń komórkowych, a zanieczyszczenie innymi typami komórek, zwłaszcza leukocytami, musi być w maksymalnym stopniu ograniczone2. Wiele z obecnych technik, w tym jedyne zatwierdzone przez FDA urządzenie do enumeracji CTC, niszczy komórki CTC w procesie izolacji (szczegółowe informacje znajdują się w Ref. 2). Opisano urządzenie mikrofluidyczne do wychwytywania żywych CTC, składające się z powierzchni funkcjonalizowanej glikoproteiną E-selektyną oraz przeciwciałami przeciwko markerom nabłonkowym3. Aby poprawić wydajność urządzenia, zastosowano powłokę z nanocząsteczek składającą się z nanorurek halloysite, które są krzemianowo-glinowymi nanocząsteczkami pozyskiwanymi z glinki4. Cząsteczki E-selektyny umożliwiają wychwytywanie szybko poruszających się CTC przepompowywanych przez urządzenie, co stanowi przewagę nad alternatywnymi urządzeniami mikrofluidycznymi, w których konieczny jest dłuższy czas przetwarzania, aby zapewnić komórkom docelowym wystarczająco dużo czasu na interakcję z powierzchnią. Przeciwciała przeciwko celom nabłonkowym nadają urządzeniu specyficzność wobec CTC, a także stanowią łatwo regulowany parametr pozwalający dostroić proces izolacji. Wreszcie, powłoka z nanorurek halloysite pozwala na znacznie zwiększoną efektywność izolacji w porównaniu z innymi technikami, pomagając w wychwytywaniu szybko poruszających się komórek, zwiększając powierzchnię adsorpcji białek i odpychając zanieczyszczające leukocyty3,4. Urządzenie to jest produkowane za pomocą prostej techniki z wykorzystaniem ogólnodostępnych materiałów i zostało z sukcesem użyte do wychwytywania komórek nowotworowych z krwi pacjentów z rakiem z przerzutami. Wychwycone komórki są utrzymywane w hodowli do 15 dni po izolacji, a próbki te zazwyczaj składają się w >50% z żywych pierwotnych komórek nowotworowych od każdego pacjenta. Urządzenie to było wykorzystywane do wychwytywania żywych CTC zarówno z rozcieńczonej krwi pełnej, jak i z próbek warstwy leukocytarnej (buffy coat). W rezultacie prezentujemy technikę o funkcjonalności w warunkach klinicznych, służącą do opracowywania spersonalizowanych terapii nowotworowych.
Protokół
Poniższy protokół dotyczy wytworzenia pojedynczego urządzenia w formie mikroprobówki.
1. Przygotowanie roztworu nanorurek haloyzytowych
- Poddać sonikacji (10-13 W (rms)) 250 μL roztworu nanorurek haloysytowych (6,6% masowych w wodzie) przez 30 s. Schłodzić roztwór zimną wodą i powtórzyć sonikację jednokrotnie. Ponownie schłodzić.
- Naciągnąć sonikowany roztwór do strzykawki, założyć filtr strzykawkowy 0,45 μm i przefiltrować roztwór do czystej probówki do mikrocentryfugi. Od czasu do czasu mieszać roztwór na wortexie, aby zachować jednorodność.
2. Powlekanie wewnętrznej powierzchni mikrorurki nanorurkami halloysitu
- Przygotować odcinek mikrorurki Micro-Renathane o długości 50 cm (średnica wewnętrzna 300 μm, objętość wewnętrzna 35,3 μL). Jeden koniec mikrorurki odciąć pod skosem i włożyć do małego adaptera IDEX. Igłę strzykawki 3/10 cc 29G włożyć w drugi koniec mikrorurki.
- Aby oczyścić mikrorurkę, zanurzyć jej otwarty koniec (ten z adapterem) w 70% etanolu i pobrać do strzykawki ok. 50 μL etanolu, aby wypełnić mikrorurkę.
- Wypłukać etanol z mikrorurki, pobierając do strzykawki większą objętość wody destylowanej.
- Odłączyć strzykawkę od mikrorurki, opróżnić ją, a następnie ponownie przyłączyć do mikrorurki.
- Przygotować roztwór poli-L-lizyny o stężeniu 0,02% w/v w wodzie. Pobrać 50 μL do mikrorurki i pozostawić na 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
- Pobrać 100 μL przefiltrowanego roztworu nanorurek do mikrorurki i inkubować przez 3 min w RT.
- Przepłukać mikrorurkę, pobierając przez nią 100 μL wody, aby usunąć roztwór nanorurek. Pozostawić powleczoną mikrorurkę wypełnioną wodą na całą noc w RT.
3. Przygotowanie mikroprobówek do izolacji komórek
- Przygotować roztwór białka G o stężeniu 10 μg/mL w 1X soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (PBS, pH 7,0 - 7,2). Do mikroprobówki wciągnąć 50 μL PBS, a następnie wciągnąć 50 μL roztworu białka G i inkubować przez 1,5 h w temperaturze pokojowej (RT).
- Przygotować w PBS roztwór zawierający 5 μg/mL E-selectin-IgG oraz 50 μg/mL przeciwciał (anty-EpCAM dla większości próbek nowotworowych, anty-PSMA dla próbek raka prostaty). Do mikroprobówki wciągnąć 50 μL roztworu E-selectyny i przeciwciał, a następnie inkubować przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT).
- Nieswoiste przyleganie komórek blokuje się za pomocą 5% białka mleka. Przygotować roztwór 5% (m/v) białka mleka w PBS. Do mikroprobówki wciągnąć 50 μL roztworu białka mleka i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).
- Do probówki wciągnąć 50 μL PBS i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) do momentu, aż próbki krwi lub warstwy leukocytarnej (buffy coat) będą gotowe do obróbki.
- Na 10 min przed użyciem mikroprobówki do izolacji, wciągnąć 50 μL PBS nasyconego jonami Ca2+ („PBS+”), aby aktywować cząsteczki selektyny.
4. Przygotowanie próbek do izolacji komórek
- Pobrać 10 mL krwi pacjenta do probówki z heparyną.
- Do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL wlać 10 mL roztworu do izolacji limfocytów Ficoll-Paque. Ostrożnie nanieść 10 mL pełnej krwi na warstwę Ficollu, aby nie zmieszać krwi z roztworem.
- Wirować przy 2000x g przez 15 min w temperaturze 4 °C z minimalnym hamowaniem.
- Zdjąć warstwę leukocytów (buffy coat) i przenieść do nowej probówki.
- Przemyć warstwę leukocytów buforem PBS (wirować przy 230x g przez 10 min, odrzucić nadsącz).
- Ostrożnie resuspendować komórki w 1 mL buforu do lizy RBC i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT) w celu lizy erytrocytów.
- Dodać 10 mL PBS, delikatnie wymieszać i wirować przy 230x g przez 10 min. Odrzucić nadsącz i ostrożnie resuspendować osad w 3 do 4 mL PBS+.
5. Izolacja komórek
- Przyczep jeden koniec funkcjonalizowanej mikrorurki do strzykawki 5 mL, używając adapterów IDEX.
- Umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej.
- Zanurz otwarty koniec funkcjonalizowanej mikrorurki w zawiesinie komórkowej.
- Przepuść zawiesinę komórkową przez mikrorurkę z prędkością od 1 do 4 mL/h.
- Przenieś otwarty koniec mikrorurki do probówki zawierającej PBS+ i pobierz 300 μL PBS+ do strzykawki z prędkością 0,016 mL/min, aby usunąć z mikrorurki komórki nieprzywiązane i słabo związane.
- Umieść otwarty koniec mikrorurki w czystej probówce. Odłącz strzykawkę od mikrorurki i podłącz strzykawkę wypełnioną Accutase. Delikatnie przepłucz mikrorurkę wystarczającą ilością Accutase, aby ją wypełnić (~50 μL), i inkubuj w temperaturze RT przez 10 min.
- Podłącz strzykawkę wypełnioną 1 mL pożywki wzrostowej (79% RPMI, 20% FBS, 1% penicyliny i streptomycyny) i przepłucz mikrorurkę, zbierając effluent do płytki wielodołkowej przeznaczonej do hodowli tkanek.
- Hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w warunkach zwiększonej wilgotności.
6. Reprezentatywne wyniki
Celem tej techniki jest wyizolowanie żywych komórek nowotworowych z krwi pacjentów onkologicznych. Istnieje kilka metod identyfikacji komórek nowotworowych w hodowli, co stanowi niezbędną weryfikację skuteczności urządzenia. Wybraliśmy barwienie komórek w hodowli przeciwciałami przeciwko elementom nabłonkowym, takim jak EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonkowych) lub PSMA (antygen swoisty dla prostaty), a także DAPI w celu zidentyfikowania nienaruszonych jąder komórkowych (Rys. 2 i 3). Liczba komórek nowotworowych wychwyconych za pomocą tej techniki jest bezpośrednią funkcją liczby CTC w próbce wyjściowej, a zmienność między pacjentami może być wysoka. Przetwarzając próbki pobrane od pacjentów z diagnozą nowotworów w stadium IV, rutynowo wychwytujemy od 100 do 500 komórek nowotworowych na probówkę krwi, przy czystości >50%. Bezpośrednio po izolacji może występować większa liczba zanieczyszczających leukocytów. Liczba ta ulegnie jednak zmniejszeniu po inkubacji w pożywce hodowlanej przez okres do 5 dni.
Rysunek 1. Schemat funkcjonalizowanej mikrorurki do izolacji CTC, przedstawiający toczenie zależne od selektyn, a następnie statyczną adhezję zależną od przeciwciał.
Rycina 2. Reprezentatywne dane dotyczące izolacji CTC z próbek krwi pobranych od pacjenta z rakiem piersi i pacjenta z rakiem płuc. Liczba żywych komórek zidentyfikowanych jako CTC na podstawie barwienia EpCAM jest przedstawiona przez słupki pełne i odnosi się do lewej osi rzędnych; procent komórek zidentyfikowanych jako CTC w stosunku do całkowitej liczby wychwyconych komórek jest przedstawiony przez słupki puste i odczytywany z prawej osi rzędnych. Wyniki uzyskano po pięciu dniach hodowli.
Rysunek 3. Reprezentatywne mikrofotografie od osobnych dawców (A i B) CTC w hodowli 5 dni po izolacji z próbki krwi pacjenta z nowotworem. Komórki zostały zabarwione fluorescencyjnie na EpCAM z użyciem AlexaFluor 488 (zielony) oraz 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w celu wizualizacji jądra (niebieski).
Dyskusja
Często zdarza się, że wczesne etapy odkrywania nowych metod leczenia nowotworów opierają się na liniach komórkowych raka, które wykazują wątpliwe podobieństwo do pierwotnych komórek nowotworowych, lecz są nadal stosowane ze względu na łatwość użycia w laboratorium. Badania nad opracowaniem nowych terapii antynowotworowych zostałyby przyspieszone, gdyby pierwotne ludzkie komórki nowotworowe były wykorzystywane na wczesnych etapach nowatorskich badań. CTC są najłatwiej dostępnym typem komórek nowotworowych ze względu na ich obecność we krwi oraz łatwość wykonania standardowego pobrania krwi. Ponadto krążące komórki nowotworowe stanowią niezbędny etap w procesie przerzutowania5,6, zatem ich znaczenie dla choroby oraz użyteczność w celowaniu w nowe leki są oczywiste. Izolacja CTC z krwi in vitro jest utrudniona przez ich niskie stężenia: rzędu jednej na milion leukocytów lub jednej na miliard erytrocytów7. Większość obecnych metod wykrywania CTC we krwi, w tym jedyna technika zatwierdzona przez FDA, CellSearch(Veridex), uszkadza lub niszczy komórki w procesie detekcji, co wyklucza ich zastosowanie poza samym liczeniem. Opisana powyżej metoda nie narusza żywotności komórek, co tym samym otwiera drogę do przyszłych badań klinicznych nad rakiem. Ponieważ celem tej techniki jest odzyskanie nienaruszonych komórek, niezbędne jest obchodzenie się z nimi z najwyższą ostrożnością, zwłaszcza podczas etapów rozdzielania krwi.
W systemie tym istnieje szereg parametrów regulowanych, które można zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności, w zależności od kluczowych cech, takich jak rodzaj nowotworu. W opisanych powyżej etapach zdecydowaliśmy się na użycie EpCAM jako przeciwciała specyficznego dla CTC dla wszystkich typów nowotworów, z wyjątkiem próbek raka prostaty, w których zastosowano anty-PSMA. Dalsze zastępowanie przeciwciał specyficznych dla danego nowotworu może z pewnością pomóc w poprawie wyników u poszczególnych pacjentów. Ponadto można zmieniać stężenia selektyn i przeciwciał, aby zwiększyć efektywność wychwytu8.
Kluczową cechą urządzenia jest wprowadzenie cząsteczek E-selektyny na jego powierzchnię. E-selektyna jest zazwyczaj eksprymowana na powierzchni luminalnej komórek śródbłonka i odpowiada za rekrutację szybko poruszających się leukocytów do miejsc stanu zapalnego. Przepływające leukocyty wiążą się przejściowo z cząsteczkami selektyny, co skutkuje spowolnionym ruchem toczącym, który ułatwia wolniejsze i silniejsze wiązanie komórek z śródbłonkiem za pomocą integryn. Istnieją przekonujące dowody eksperymentalne potwierdzające, że CTC mogą extravasować za pomocą podobnego mechanizmu9,10. Wprowadzenie selektyny pozwala również na pracę urządzenia przy większych przepływach, które w przeciwnym razie uniemożliwiłyby wiązanie komórek z przeciwciałami11. W ten sposób nasze urządzenie fizjologicznie naśladuje żyłę, aby biomimetycznie wychwytywać przepływające CTC bez powodowania uszkodzeń komórkowych.
Poprawę wydajności urządzenia można przypisać naniesieniu powłoki z nanorurek haloysytowych na powierzchnię wewnętrzną urządzenia. Poprzednie badania wykazały, że powłoka z nanorurek składa się z trzech głównych komponentów, które umożliwiają poprawę funkcjonalności. Po pierwsze, powłoka z nanorurek zapewnia zwiększoną powierzchnię, co pozwala na większe osadzanie białek na powierzchni4. Po drugie, podczas przeprowadzania mikroskopii sił atomowych powłoki z nanorurek ustalono, że poszczególne nanorurki wystają z powierzchni w kierunku przepływu. Pozwala to na prezentację cząsteczek selektyny nawet na wysokości jednego mikrona nad powierzchnią, dzięki czemu komórki mogą być wychwytywane i rekrutowane na powierzchnię wcześniej w trakcie ich trajektorii przez rurkę4. Wreszcie powłoka z nanorurek haloysytowych jest w stanie zapobiegać adhezji i rozprzestrzenianiu się leukocytów na powierzchni, co pozwala na ograniczenie liczby leukocytów wychwytywanych wraz z CTC, a tym samym uzyskanie większej późniejszej czystości CTC3.
Oświadczenia
M.R.K. jest doradcą naukowym firmy CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).
Podziękowania
Opisana praca była wspierana przez Cornell Center on the Microenvironment & Metastasis w ramach grantu numer U54CA143876 z National Cancer Institute. Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnych poglądów National Cancer Institute ani National Institutes of Health. Praca ta była dodatkowo częściowo finansowana przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship (A.D.H.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| przewód o średnicy wewnętrznej 300 $\mu$m | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Większa rurka do połączenia ze strzykawką | IDEX Health Science | 1507L | |
| strzykawka 5 ml do pompy | BD Biosciences | 309603 | |
| Łącznik rurki małej do rurki dużej | IDEX Health Science | P-770 | |
| Podłączenie szerokiej rurki do strzykawki | IDEX Health Science | F-120 i P-659 | |
| Strzykawka do mikroprobówki (strzykawka insulinowa 3/10 cm³ U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Bufor do lizy RBC (Bufor EL, 1000 ml) | Qiagen | 1014614 | |
| Białko G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiemu EpCAM/TROP-1 | R&D Systems | MAB960 | |
| Przeciwciało anty-PSMA (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| płytki 96-dołkowe (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Ododtłuszczone mleko w proszku do blokowania w analizie blotting, 300 g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Nanorurki haloysytowe | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Węglan wapnia, 5 g | Chemia Aldrich | 481807 | |
| chimera rhE-Selectiny/Fc, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| pożywka RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L-lizyna 0,1% m/v w wodzie | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonikator do homogenizacji próbek | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| penicylina streptomycyna | Sigma Life Sciences | P0781 |
Bibliografia
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
Przedruki i uprawnienia
