Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu różnych szczepów

Summary

Prezentujemy prostą metodę produkcji urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do zastosowania podobnych warunków dynamicznych do wielu różnych szczepów, bez potrzeby stosowania czystego pomieszczenia lub miękkiej litografii.

Abstract

Badanie reakcji komórek na zmiany środowiskowe stawia wiele wyzwań eksperymentalnych: komórki muszą być obrazowane w zmieniających się warunkach, często w sposób porównawczy. Płytki wielodołkowe są rutynowo używane do porównywania wielu różnych szczepów lub linii komórkowych, ale pozwalają na ograniczoną kontrolę nad dynamiką środowiska. Z drugiej strony urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na znakomitą dynamiczną kontrolę nad warunkami otoczenia, ale trudno jest zobrazować i rozróżnić w nich więcej niż kilka szczepów. W tym miejscu opisujemy metodę łatwego i szybkiego wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego zdolnego do stosowania dynamicznie zmieniających się warunków do wielu różnych szczepów drożdży w jednym kanale. Urządzenie zostało zaprojektowane i wyprodukowane w prosty sposób, bez konieczności miękkiej litografii. Składa się z kanału przepływowego w kształcie litery Y przymocowanego do drugiej warstwy, w której znajdują się mikrostudzienki. Szczepy są umieszczane w oddzielnych mikrostudzienkach i obrazowane w dokładnie tych samych warunkach dynamicznych. Demonstrujemy zastosowanie urządzenia do pomiaru odpowiedzi lokalizacji białek na impulsy zmian składników odżywczych w różnych szczepach drożdży.

Introduction

Komórki nieustannie reagują na dynamicznie zmieniające się środowisko, zmieniając swój metabolizm, profil transkrypcyjny i funkcje komórkowe. Aby zbadać te zjawiska, potrzebne są metody, które mogą określić ilościowo takie zmiany. Jednym z rodzajów odczytu takich reakcji jest zmiana lokalizacji czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w odpowiedzi na stres żywieniowy.

Urządzenia mikroprzepływowe¹ zostały użyte do dynamicznego manipulowania warunkami środowiskowymi w komórkach^2-4. Mają one kilka zalet w obrazowaniu żywych komórek: środowisko komórek może być precyzyjnie kontrolowane i dynamicznie zmieniane; Kom....

Protocol

1. Tworzenie mistrza taśmy klejącej⁵

1. Narysuj lub wydrukuj żądany układ mikrokanałów w skali na papierze. W naszym przypadku konstrukcja składa się z dwóch kanałów w kształcie litery Y, każdy o szerokości 3 mm (ilustracja 2).
2. Przykryj szkiełko warstwami taśmy klejącej. Liczba warstw określi wysokość kanału (około 60 μm na warstwę). Użyliśmy 3 warstw taśmy klejącej.
3. Umieść projekt układu na płaskiej powierzchni. Wyrównaj slajd do wzorca projektowego. Ostrożnie przeciąć taśmę na szkiełku skalpelem zgodnie z układem.
4. Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka ze wszystkich obszarów szkiełka z wy....

Results

Aby zademonstrować separację między różnymi szczepami, zobrazowaliśmy dwa rozróżnialne szczepy drożdży w naprzemiennych studzienkach. Obrazowanie pełnych studzienek nie wykazuje wycieku komórek między studzienkami (ryc. 5a,b). Oba szczepy mają czynnik transkrypcyjny MSN2 oznaczony YFP. Aby przetestować jednoczesny efekt dynamicznie zmieniających się warunków, zamieniliśmy natężenia przepływu w dwóch kanałach wejściowych, tworząc krok pożywki bez glukozy, co spowodowało lokalizację Msn2-YFP w jądrze (

Discussion

W artykule przedstawiono prostą metodę laboratoryjną tworzenia urządzenia mikroprzepływowego, które pozwala na jednoczesne śledzenie kilku szczepów drożdży w warunkach dynamicznych. Śledzenie kilku szczepów w jednym kanale zapewnia wiarygodne narzędzie do porównywania dynamiki odpowiedzi pojedynczych komórek w wielu szczepach. Jedną z zalet naszego podejścia jest możliwość wytworzenia urządzenia prostymi technikami bez konieczności posiadania czystego pomieszczenia. W rzeczywistości przeprowadziliśmy również protokół z p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA
Eksykator próżniowy	Nalgene	5310-0250
Dziurkacze do biopsji	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1,2 mm)
Pompy strzykawkowe	Chemyx	Fusion 200
Obróbka koronowa	Produkty elektrotechniczne	Rurka BD-20
Tygon Tygon	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-A	Sigma	C7275
Taśma klejąca	3M Taśma	klejąca przezroczysta 1/2"