Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie odpowiedzi komórkowych na zmiany środowiskowe wiąże się z wieloma wyzwaniami eksperymentalnymi: komórki muszą być obrazowane w zmieniających się warunkach, często w sposób porównawczy. Płytki wielodołkowe są rutynowo wykorzystywane do porównywania wielu różnych szczepów lub linii komórkowych, jednak zapewniają ograniczoną kontrolę nad dynamiką środowiska. Z kolei urządzenia mikrofluidyczne pozwalają na precyzyjną dynamiczną kontrolę warunków otoczenia, lecz obrazowanie i rozróżnianie w nich więcej niż kilku szczepów jest trudne. W niniejszej pracy opisujemy metodę łatwego i szybkiego wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego zdolnego do stosowania dynamicznie zmieniających się warunków dla wielu różnych szczepów drożdży w jednym kanale. Urządzenie jest projektowane i produkowane prostymi metodami, bez konieczności stosowania miękkiej litografii. Składa się ono z kanału przepływowego w kształcie litery Y, połączonego z drugą warstwą zawierającą mikrodółki. Szczepy są umieszczane w osobnych mikrodółkach i obrazowane w dokładnie tych samych warunkach dynamicznych. Demonstrujemy zastosowanie urządzenia do pomiaru odpowiedzi lokalizacji białek na impulsy zmian składników odżywczych w różnych szczepach drożdży.
Wprowadzenie
Komórki nieustannie reagują na dynamicznie zmieniające się środowisko, modyfikując swój metabolizm, profil transkrypcyjny oraz funkcje komórkowe. Aby badać te zjawiska, konieczne są metody pozwalające na ilościowe określenie takich zmian. Jednym z odczytów takich odpowiedzi jest zmiana lokalizacji czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w odpowiedzi na stres żywieniowy.
Urządzenia mikroprzepływowe1 są wykorzystywane do dynamicznego manipulowania warunkami środowiskowymi komórek2-4. Oferują one szereg zalet w obrazowaniu żywych komórek: środowisko komórek może być precyzyjnie kontrolowane i dynamicznie zmieniane, komórki mogą być obrazowane w czasie rzeczywistym, w tym podczas manipulowania warunkami zewnętrznymi, a ponadto wymagane są minimalne objętości odczynników. Bardzo prostym projektem urządzenia mikroprzepływowego, pozwalającym na przełączanie się między dwoma stanami, jest urządzenie w kształcie litery Y2. Rutynowo stosujemy mikroprzepływowe urządzenia w kształcie litery Y, które umożliwiają wprowadzanie dynamicznych zmian w warunkach oddziaływania na komórki znajdujące się w kanale. Wykorzystujemy to urządzenie do śledzenia zmian lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w komórkach drożdży. Zmiany te obserwujemy w zmiennych warunkach odżywczych. Przykładowo, możemy podać impuls (lub serię impulsów) medium zawierającego glukozę w okresie przebywania w medium bez glukozy, z bardzo wysoką rozdzielczością czasową. Często w takich eksperymentach interesuje nas porównanie odpowiedzi różnych szczepów komórkowych (na przykład różnych mutantów lub różnych izolatów dzikich). Kanał w kształcie litery Y ogranicza się do jednego szczepu w każdym kanale – jeśli użytych zostanie więcej niż jeden szczep, nie ma prostego sposobu na ich rozróżnienie. Aby temu zaradzić, można zastosować różne kanały. Jeśli chcemy zastosować tę samą dynamikę warunków do wielu szczepów, chcielibyśmy połączyć koncepcję kanału Y z wieloma kanałami. Wdrażanie tego rozwiązania wiąże się z dwoma wyzwaniami: może być trudno zastosować te same warunki w tym samym czasie we wszystkich kanałach, a ponadto istnieje geometryczne ograniczenie liczby kanałów Y, które można zmieścić w jednym urządzeniu. Poszukiwaliśmy zatem sposobu na obserwację kilku szczepów w jednym kanale w warunkach dynamicznych.
Opisujemy tutaj dwuwarstwowe urządzenie mikrofluidyczne przeznaczone do obrazowania wielu szczepów w jednym kanale w tych samych warunkach dynamicznych. Warstwa dolna składa się z cienkiego PDMS z rzędem otworów. Warstwa ta jest przymocowana do szklanego szkiełka cover slip, tworząc wgłębienia, w których umieszczone zostaną różne szczepy, przytwierdzone do szkła za pomocą konkanawaliny A. Druga warstwa to mikrofluidyczne urządzenie w kształcie litery Y, wykonane metodą taśmy klejącej5. Po umieszczeniu szczepów we wgłębieniach druga warstwa jest szybko wyrównana i przytwierdzona do pierwszej, tworząc jeden kanał z kilkoma wgłębieniami zawierającymi różne szczepy. Końcowe urządzenie pozwala na śledzenie kilku szczepów w jednym kanale, gdzie wszystkie szczepy są poddane tym samym warunkom w dokładnie tym samym czasie. Cały proces projektowania i produkcji można przeprowadzić w warunkach laboratoryjnych, korzystając z prostych środków, bez użycia miękkiej litografii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Tworzenie matrycy z taśmy klejącej5
- Narysuj lub wydrukuj w odpowiedniej skali na papierze pożądany układ mikrokanałów. W naszym przypadku projekt składa się z dwóch kanałów w kształcie litery Y, z których każdy ma szerokość 3 mm (Rycina 2).
- Pokryj szkiełko przedmiotowe warstwami taśmy klejącej. Liczba warstw zdeterminuje wysokość kanału (około 60 μm na warstwę). Użyliśmy 3 warstw taśmy klejącej.
- Połóż projekt układu na płaskiej powierzchni. Dopasuj szkiełko do wzoru projektu. Ostrożnie wytnij skalpelem taśmę na szkiełku zgodnie z układem.
- Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka przedmiotowego, z wyjątkiem tych znajdujących się w układzie mikrokanałów.
- Umieść szkiełko w piekarniku w temperaturze 65 °C na 2-3 min. Delikatnie oczyść etanolem.
2. Wytwarzanie mikroprzepływowego urządzenia z PDMS
- Wymieszaj bazę i utwardzacz PDMS zgodnie z zaleceniami producenta. Stosujemy stosunek bazy do utwardzacza 10:1. Wlej około 30 ml mieszaniny PDMS do szalki Petriego, aby uzyskać wysokość ~0,5 cm. W razie potrzeby odgazuj PDMS w próżni. Zanurz szkiełko w PDMS tak, aby wzorowana taśma Scotch była skierowana do góry. Umieszczenie wzoru przed wylaniem PDMS zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza między szkiełkiem a dnem szalki. Utwardzaj przez 48 hr w temperaturze 65 °C, upewniając się za pomocą poziomicy, że szalka znajduje się w pozycji poziomej.
- Do nowej szalki Petriego o średnicy 90 mm wlej 3 ml mieszaniny PDMS, tak aby uzyskać warstwę o głębokości około 0,5 mm. (Jeśli dostępna jest wirówka do nakładania warstw, można jej użyć na tym etapie).
- Odgazuj i utwardź zgodnie z punktem 2.1.
- Ostrożnie wytnij skalpelem urządzenie mikroprzepływowe o pożądanej wielkości. Warstwa ta będzie określana jako „warstwa przepływu”.
- Wytnij podobnej wielkości fragment cienkiej warstwy PDMS z drugiej szalki Petriego. Będzie ona określana jako „warstwa studzienek”.
- Użyj odpowiednio dobranego wycinaka do biopsji (stosujemy średnicę wewnętrzną 1,2 mm), aby wyciąć otwory dla wlotów i wylotów w warstwie przepływu.
- Połóż warstwę studzienek na grubym szkiełku nad schematem projektu i wycinij studzienki, używając wycinaka do biopsji o średnicy wewnętrznej 2 mm, zgodnie z rozmieszczeniem mikrokanałów na schemacie.
- Oczyść obie warstwy PDMS oraz szkiełko podstawowe o wymiarach 24 mm x 60 mm etanolem. Pozostaw do wyschnięcia i zachowaj w czystości.
- Poddaj działaniu plazmy szkiełko podstawkowe oraz warstwę studzienek PDMS, używając standardowej trawaczki plazmowej (dla wiązania nieodwracalnego) lub ręcznego urządzenia do traktowania koronowego6 dla wiązania odwracalnego. Ostrożnie połóż warstwę studzienek na szkiełku, aby uzyskać adhezję (Rycina 3). Delikatnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza (jeśli to konieczne).
3. Eksperyment obrazowania komórek
- Upewnij się, że pożądane pożywki są przygotowane w odpowiednich strzykawkach podłączonych do elastycznych plastikowych rurek o średnicy wewnętrznej 0,02" (Tygon) w pompie strzykawkowej.
- Hoduj szczepy S. cerevisiae do pożądanej fazy w płynnym YPD. Dokładnie wymieszaj na vortexie i przenieś 300 μl każdego szczepu do probówki do mikrowirówki.
- Delikatnie nanieś 1 μl Konkanawaliny A (sigma) 2 mg/ml do każdego dołka. Dwukrotnie wypłucz nadmiar Konkanawaliny A z każdego dołka, delikatnie pipetując wodę.
- Podczas wysychania Konkanawaliny A dwukrotnie przemyj szczepy 300 μl pożywki SC pozbawionej glukozy. Wypłukanie resztkowej glukozy ze ścian komórkowych wspomaga prawidłową adhezję do Konkanawaliny A.
- Dokładnie wymieszaj komórki na vortexie. Pipetuj 0,75 μl lub mniej każdej zawiesiny komórkowej do oddzielnego dołka (Rysunek 3). Delikatnie wypłucz resztkowe komórki pożywką bogatą. Następne dwa kroki należy wykonać szybko, aby zapobiec wyschnięciu komórek.
- Dokładnie potraktuj plazmą chip i dołki, używając ręcznego urządzenia do potraktowania koronowego, uważając, aby nie uderzać bezpośrednio w dołki. Ostrożnie umieść chip na dołkach, zwracając szczególną uwagę na ich wyrównanie (ten krok można wykonać pod stereomikroskopem). Delikatnie dociśnij, aby skleić dwie warstwy PDMS. Powoli wypełnij urządzenie całkowicie około 50 μl pożywki bogatej, upewniając się, że w kanale nie pozostały pęcherzyki powietrza.
- Podłącz urządzenie, wkładając rurki do odpowiednich wlotów, i rozpocznij przepływ pożywek. Dopilnuj, aby do urządzenia nie dostały się pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą być trudne do usunięcia; można to osiągnąć, odłączając wlot lub wylot i delikatnie opukując urządzenie w miejscu, gdzie znajdują się pęcherzyki, uważając, aby nie stłuc szklanego kryszalku.
- Umieść pod mikroskopem i znajdź odpowiednie punkty obrazowania w każdym dołku.
- Utrzymuj komórki w przepływie pożywki bogatej przez 1 h lub dłużej, aby umożliwić regenerację, jeśli jest to konieczne.
- Rozpocznij eksperyment: stosujemy stały przepływ z każdej z dwóch pomp strzykawkowych, aby zapobiec cofaniu się pożywek, zmieniając względne szybkości przepływu według potrzeb. Ustawienie pompy A na 0,8 ml/hr i pompy B na 0,2 ml/hr skutkuje przepływem pożywki A nad 80% szerokości kanału (Rysunek 4). Można to dynamicznie zmieniać poprzez modyfikację obu szybkości przepływu. Nowe warunki stabilizują się w ciągu kilku sekund na całej długości kanału2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zademonstrować separację między różnymi szczepami, obrazowano dwa rozróżnialne szczepy drożdży w naprzemiennych studniach. Obrazowanie całych studni nie wykazuje wycieku komórek między nimi (Rycina 5a,b). Oba szczepy posiadają czynnik transkrypcyjny MSN2 znakowany YFP. Aby przetestować jednoczesny efekt dynamicznie zmieniających się warunków, zmieniono szybkości przepływu w dwóch kanałach wejściowych, tworząc skokowo podany pożywkę bez glukozy, co doprowadziło do lokalizacji Msn2-YFP w jądrze komórko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę laboratoryjną wytwarzania urządzenia mikrofluidycznego, które umożliwia jednoczesne śledzenie kilku szczepów drożdży w warunkach dynamicznych. Obserwacja kilku szczepów w jednym kanale stanowi niezawodne narzędzie do porównywania dynamiki odpowiedzi pojedynczych komórek w wielu szczepach. Jedną z zalet naszego podejścia jest możliwość wykonania urządzenia za pomocą prostych technik, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room. Co więcej, przeprowadziliśmy ten ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
YG otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z IDB. IN jest stypendystą Alona oraz członkiem kadry naukowej w Edmond J. Safra Center for Bioinformatics na Uniwersytecie w Tel Awiwie. Badania te były finansowane z grantu ISF 1499/10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Susznik próżniowy | Nalgene | 5310-0250 | |
| Wycinaki do biopsji | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Pompy strzykawkowe | Chemyx | Fusion 200 | |
| Urządzenie do aktywacji koronowej | Electro-technic products | BD-20 | |
| Przewody Tygon | Tygon | S-54-HL | |
| Konkanawalina-A | Sigma | C7275 | |
| Taśma klejąca Scotch | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
Bibliografia
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
