Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu różnych szczepów

Summary

Prezentujemy prostą metodę produkcji urządzeń mikroprzepływowych zdolnych do zastosowania podobnych warunków dynamicznych do wielu różnych szczepów, bez potrzeby stosowania czystego pomieszczenia lub miękkiej litografii.

Abstract

Badanie reakcji komórek na zmiany środowiskowe stawia wiele wyzwań eksperymentalnych: komórki muszą być obrazowane w zmieniających się warunkach, często w sposób porównawczy. Płytki wielodołkowe są rutynowo używane do porównywania wielu różnych szczepów lub linii komórkowych, ale pozwalają na ograniczoną kontrolę nad dynamiką środowiska. Z drugiej strony urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na znakomitą dynamiczną kontrolę nad warunkami otoczenia, ale trudno jest zobrazować i rozróżnić w nich więcej niż kilka szczepów. W tym miejscu opisujemy metodę łatwego i szybkiego wytwarzania urządzenia mikroprzepływowego zdolnego do stosowania dynamicznie zmieniających się warunków do wielu różnych szczepów drożdży w jednym kanale. Urządzenie zostało zaprojektowane i wyprodukowane w prosty sposób, bez konieczności miękkiej litografii. Składa się z kanału przepływowego w kształcie litery Y przymocowanego do drugiej warstwy, w której znajdują się mikrostudzienki. Szczepy są umieszczane w oddzielnych mikrostudzienkach i obrazowane w dokładnie tych samych warunkach dynamicznych. Demonstrujemy zastosowanie urządzenia do pomiaru odpowiedzi lokalizacji białek na impulsy zmian składników odżywczych w różnych szczepach drożdży.

Introduction

Komórki nieustannie reagują na dynamicznie zmieniające się środowisko, zmieniając swój metabolizm, profil transkrypcyjny i funkcje komórkowe. Aby zbadać te zjawiska, potrzebne są metody, które mogą określić ilościowo takie zmiany. Jednym z rodzajów odczytu takich reakcji jest zmiana lokalizacji czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w odpowiedzi na stres żywieniowy.

Urządzenia mikroprzepływowe¹ zostały użyte do dynamicznego manipulowania warunkami środowiskowymi w komórkach^2-4. Mają one kilka zalet w obrazowaniu żywych komórek: środowisko komórek może być precyzyjnie kontrolowane i dynamicznie zmieniane; Komórki mogą być obrazowane na żywo przez cały czas, w tym podczas manipulowania warunkami zewnętrznymi; i wymagane są minimalne objętości odczynników. Bardzo prostą konstrukcją urządzenia mikroprzepływowego, umożliwiającą zmianę między dwoma warunkami, jest urządzenie w kształcie litery Y². Rutynowo używamy urządzeń mikroprzepływowych w kształcie litery Y, które umożliwiają zastosowanie dynamicznych zmian w komórkach w kanale. Używamy tego urządzenia do śledzenia zmian lokalizacji fluorescencyjnie znakowanych czynników transkrypcyjnych związanych ze stresem w komórkach drożdży. Śledzimy te zmiany w zmieniających się warunkach żywieniowych. Na przykład, możemy dostarczyć impuls (lub serię impulsów) pożywki zawierającej glukozę w okresie pożywki bez glukozy, w bardzo dobrej rozdzielczości czasowej. Często w takich eksperymentach interesuje nas porównanie odpowiedzi różnych szczepów komórkowych (na przykład różnych mutantów lub różnych dzikich izolatów). Kanał w kształcie litery Y jest ograniczony do jednego szczepu w każdym kanale - jeśli używany jest więcej niż jeden szczep, nie ma prostego sposobu na rozróżnienie szczepów. Aby temu zaradzić, można użyć różnych kanałów. Jeśli chcemy zastosować te same warunki dynamiki do wielu szczepów, chcielibyśmy połączyć koncepcję kanału Y z wieloma kanałami. Wdrożenie tego rozwiązania wiąże się z dwoma wyzwaniami: zastosowanie tych samych warunków w tym samym czasie do wszystkich kanałów może być trudne, a liczba kanałów Y, które można zmieścić w jednym urządzeniu, jest ograniczona geometrycznie. Szukaliśmy więc sposobu na oglądanie kilku szczepów w jednym kanale w dynamicznych warunkach.

Tutaj opisujemy dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe przeznaczone do obrazowania wielu szczepów w jednym kanale w tych samych dynamicznych warunkach. Dolna warstwa składa się z cienkiego PDMS z rzędem otworów. Warstwa ta jest przymocowana do szklanego szkiełka nakrywkowego, tworząc dołki, w których umieścimy różne szczepy, przyklejając je za pomocą Concanavalin A do szkła. Druga warstwa to urządzenie mikroprzepływowe w kształcie litery Y, stworzone przy użyciu metody^taśmy klejącej 5. Po umieszczeniu szczepów w studzienkach druga warstwa jest szybko wyrównywana i dołączana do pierwszej, tworząc jeden kanał z kilkoma dołkami, które zawierają różne szczepy. To końcowe urządzenie pozwala na śledzenie kilku szczepów w jednym kanale, gdzie wszystkie szczepy są poddawane tym samym warunkom dokładnie w tym samym czasie. Cały proces projektowania i produkcji można wykonać na blacie, przy użyciu prostych środków, bez miękkiej litografii.

Protocol

1. Tworzenie mistrza taśmy klejącej⁵

1. Narysuj lub wydrukuj żądany układ mikrokanałów w skali na papierze. W naszym przypadku konstrukcja składa się z dwóch kanałów w kształcie litery Y, każdy o szerokości 3 mm (ilustracja 2).
2. Przykryj szkiełko warstwami taśmy klejącej. Liczba warstw określi wysokość kanału (około 60 μm na warstwę). Użyliśmy 3 warstw taśmy klejącej.
3. Umieść projekt układu na płaskiej powierzchni. Wyrównaj slajd do wzorca projektowego. Ostrożnie przeciąć taśmę na szkiełku skalpelem zgodnie z układem.
4. Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka ze wszystkich obszarów szkiełka z wyjątkiem tych, które znajdują się w układzie mikrokanału.
5. Umieść szkiełko w piekarniku grzewczym w temperaturze 65 °C na 2-3 minuty. Delikatnie wyczyść etanolem.

2. Produkcja urządzenia mikroprzepływowego PDMS

1. Wymieszaj bazę i składniki utwardzające PDMS zgodnie z zaleceniami producenta. Używamy stosunku bazy do utwardzacza 10:1. Wlać około 30 ml mieszaniny PDMS do szalki Petriego na wysokość ~0,5 cm. W razie potrzeby odgazowuje PDMS w próżni. Zanurz szklany szkiełko w PDMS wzorzystą taśmą klejącą skierowaną do góry. Umieszczenie wzoru za PDMS zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza pomiędzy szkiełkiem a dnem naczynia. Utwardzać przez 48 godzin w temperaturze 65 °C, upewniając się, że naczynie jest ustawione poziomo za pomocą poziomicy.
2. Do nowej szalki Petriego o średnicy 90 mm wlej 3 ml mieszanki PDMS, uzyskując warstwę o głębokości około 0,5 mm. (Jeśli dostępna jest powlekarka wirowa, można jej użyć na tym etapie).
3. Odgazowanie i utwardzenie jak w 2.1.
4. Delikatnie wytnij urządzenie mikroprzepływowe do pożądanego rozmiaru za pomocą skalpela. Warstwa ta będzie nazywana "warstwą przepływu".
5. Wytnij podobnej wielkości kawałek cienkiej warstwy PDMS z drugiej szalki Petriego. Będzie to nazywane "warstwą studni".
6. Użyj dziurkacza do biopsji o odpowiedniej wielkości (używamy średnicy wewnętrznej 1,2 mm), aby wybić otwory na wloty i wyloty w warstwie przepływowej.
7. Umieść warstwę studzienek na grubym szkiełku na układzie projektu i wybij studzienki za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy wewnętrznej 2 mm, zgodnie z mikrokanałami na układzie.
8. Oczyść obie warstwy PDMS, a także szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm z etanolem. Suszyć na powietrzu i utrzymywać w czystości.
9. Plazma poddaje się obróbce zarówno szklanego szkiełka nakrywkowego, jak i warstwy studzienek PDMS za pomocą standardowego wytrawiacza plazmowego (do nieodwracalnego łączenia) lub ręcznej obróbki koronowej⁶ do odwracalnego klejenia. Ostrożnie umieść warstwę studzienek na wierzchu szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać przyczepność (Rysunek 3). Delikatnie zetrzyj wszelkie pęcherzyki powietrza (w razie potrzeby).

3. Eksperyment z obrazowaniem komórek

1. Upewnij się, że masz przygotowane żądane media w odpowiednich strzykawkach podłączonych do elastycznych plastikowych rurek o średnicy wewnętrznej 0,02" (Tygon) w pompie strzykawkowej.
2. Uprawiaj szczepy S. cerevisiae do pożądanej fazy w płynnym YPD. Dokładnie przemieszać i umieścić 300 μl każdego szczepu w probówce do mikrowirówki.
3. Delikatnie umieścić 1 μl Concanavalin A (sigma) 2 mg/ml w każdym dołku. Wypłukać nadmiar konkanawaliny A z każdej studzienki dwukrotnie, delikatnie pipetując wodę.
4. Podczas gdy Concanavalin A wysycha, należy przemyć szczepy dwukrotnie 300 μl podłoża SC pozbawionego glukozy. Wypłukiwanie resztkowej glukozy ze ścian komórkowych pomaga w prawidłowym przyleganiu do konkanawaliny A.
5. Dokładnie odwiruj komórki. Pobrać pipetę 0,75 μl lub mniej zawiesiny każdej komórki do osobnego dołka (ryc. 3). Delikatnie wypłucz pozostałe komórki bogatym podłożem. Kolejne dwa kroki należy wykonać szybko, aby zapobiec wysychaniu komórek.
6. Plazma dokładnie traktuje chip i studnie za pomocą ręcznej obróbki koronowej, uważając, aby nie uderzyć bezpośrednio w studzienki. Ostrożnie umieść chip na studzienkach, zwracając szczególną uwagę na wyrównanie między nimi (ten krok można wykonać pod stereoskopem). Delikatnie dociśnij, aby przykleić dwie warstwy PDMS. Powoli całkowicie napełnij urządzenie roztworem o zawartości około 50 μl, upewniając się, że wewnątrz kanału nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza.
7. Podłącz urządzenie, wkładając rurki do odpowiednich wlotów i rozpocznij przepływ mediów. Uważaj, aby do urządzenia nie dostały się pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one być trudne do usunięcia; Można to osiągnąć, odłączając wlot lub wylot i delikatnie stukając w urządzenie, w którym znajdują się bąbelki, uważając, aby nie rozbić szklanego szkiełka nakrywkowego.
8. Umieść pod mikroskopem i znajdź odpowiednie punkty obrazowania w każdej studzience.
9. Utrzymuj komórki w bogatym przepływie pożywki przez 1 godzinę lub dłużej, aby w razie potrzeby umożliwić regenerację.
10. Rozpocznij eksperyment: używamy stałego przepływu z każdej z dwóch pomp strzykawkowych, aby zapobiec cofaniu się mediów, zmieniając względne natężenia przepływu zgodnie z potrzebami. Ustawienie pompy A na 0,8 ml/h i pompy B na 0,2 ml/h powoduje, że medium A przepływa przez 80% szerokości kanału (rysunek 4). Można to dynamicznie zmieniać, zmieniając dwa natężenia przepływu. Nowe warunki stabilizują się w ciągu kilku sekund na całej długości kanału².

Results

Aby zademonstrować separację między różnymi szczepami, zobrazowaliśmy dwa rozróżnialne szczepy drożdży w naprzemiennych studzienkach. Obrazowanie pełnych studzienek nie wykazuje wycieku komórek między studzienkami (ryc. 5a,b). Oba szczepy mają czynnik transkrypcyjny MSN2 oznaczony YFP. Aby przetestować jednoczesny efekt dynamicznie zmieniających się warunków, zamieniliśmy natężenia przepływu w dwóch kanałach wejściowych, tworząc krok pożywki bez glukozy, co spowodowało lokalizację Msn2-YFP w jądrze (

Discussion

W artykule przedstawiono prostą metodę laboratoryjną tworzenia urządzenia mikroprzepływowego, które pozwala na jednoczesne śledzenie kilku szczepów drożdży w warunkach dynamicznych. Śledzenie kilku szczepów w jednym kanale zapewnia wiarygodne narzędzie do porównywania dynamiki odpowiedzi pojedynczych komórek w wielu szczepach. Jedną z zalet naszego podejścia jest możliwość wytworzenia urządzenia prostymi technikami bez konieczności posiadania czystego pomieszczenia. W rzeczywistości przeprowadziliśmy również protokół z p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS- SYLGARD 184	Dow Corning USA
Eksykator próżniowy	Nalgene	5310-0250
Dziurkacze do biopsji	Ted Pella Inc.	Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1,2 mm)
Pompy strzykawkowe	Chemyx	Fusion 200
Obróbka koronowa	Produkty elektrotechniczne	Rurka BD-20
Tygon Tygon	Tygon	S-54-HL
Concanavalin-A	Sigma	C7275
Taśma klejąca	3M Taśma	klejąca przezroczysta 1/2"