Artykuł metodologiczny

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

DOI:

10.3791/4261

⸱

29 listopada 2012

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie właściwości biofizycznych i organizacji funkcjonalnej pojedynczych neuronów oraz sposobu, w jaki przetwarzają one informacje, jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów działania mózgu. Podstawową funkcją każdej komórki nerwowej jest przetwarzanie sygnałów elektrycznych, zazwyczaj pochodzących z wielu źródeł. Właściwości elektryczne wypustek neuronalnych są niezwykle złożone, dynamiczne i w ogólnym przypadku niemożliwe do przewidzenia bez szczegółowych pomiarów. Aby uzyskać taki pomiar, idealnie byłoby móc monitorować w wielu miejscach zdarzenia podprogowe w czasie, gdy przemieszczają się one z miejsc powstawania na wypustkach neuronalnych i sumują się w konkretnych lokalizacjach, wpływając na inicjację potencjału czynnościowego. Cel ten nie został osiągnięty w żadnym neuronie ze względu na ograniczenia techniczne pomiarów z wykorzystaniem elektrod. Aby wyeliminować tę wadę, wysoce pożądane jest uzupełnienie metody patch-clamp o techniki obrazowania, które pozwalają na rozległe równoległe rejestracje ze wszystkich części neuronu. W niniejszym opracowaniu opisujemy taką technikę – optyczną rejestrację przejściowych zmian potencjału błonowego za pomocą organicznych barwników napięciowo-czułych (obrazowanie Vm) – charakteryzującą się rozdzielczością poniżej milisekundy i mikrometra. Nasza metoda opiera się na pionierskich pracach nad molekularnymi sondami napięciowo-czułymi 2. Wiele aspektów pierwotnej technologii było sukcesywnie udoskonalanych przez kilka dekad 3, 5, 11. Ponadto wcześniejsze prace udokumentowały dwie istotne cechy obrazowania Vm. Po pierwsze, sygnały fluorescencyjne są liniowo proporcjonalne do potencjału błonowego w całym zakresie fizjologicznym (-100 mV do +100 mV; 10, 14, 16). Po drugie, wprowadzenie do neuronów zastosowanego tutaj barwnika napięciowo-czułego (JPW 3028) nie wywołuje wykrywalnych efektów farmakologicznych. Odnotowane poszerzenie kolca podczas wprowadzania barwnika jest całkowicie odwracalne 4, 7. Dodatkowo dowody eksperymentalne wykazują, że możliwe jest wykonanie znacznej liczby (do setek) rejestracji przed wystąpieniem jakichkolwiek wykrywalnych efektów fototoksycznych 4, 6, 12, 13. Obecnie wykorzystujemy doskonałą jasność i stabilność laserowego źródła światła o niemal optymalnej długości fali, aby zmaksymalizować czułość techniki obrazowania Vm. Obecna czułość pozwala na wielopunktową optyczną rejestrację zmian Vm ze wszystkich części neuronu, w tym z aksonów i kolaterali aksonalnych, końcowych gałęzi dendrytycznych oraz poszczególnych kolców dendrytycznych. Uzyskane informacje o oddziaływaniach sygnałów mogą być analizowane ilościowo, jak również bezpośrednio wizualizowane w formie filmu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja sprzętu

Krok 1.1. Konfiguracja obrazowania

Kluczem do rejestracji sygnałów z barwników napięciowo-czułych jest odpowiednia konfiguracja układu. Wykorzystujemy mikroskop pionowy (BX51WI Olympus lub Zeiss AxioExaminer) wyposażony w trzy kamery. Układ został zaprojektowany do oświetlania pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu światłem wzbudzenia w trybie epi-fluorescencyjnej mikroskopii szerokopolowej, przy użyciu obiektywów imersyjnych wodnych Nikon 60X/1.0 NA lub Zeiss 63X/1.0 NA. Nasze mikroskopy są przykręcone do stołu wibroizolacyjnego i wyposażone w zmotorizowane stoliki. Każdy mikroskop posiada trzy porty kamerowe. Jeden port kamerowy zajmuje standardowa kamera CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej do wideomikroskopii DIC w podczerwieni (IR-1000, Dage MTI, USA). Drugi port kamerowy zajmuje kamera do szybkiej akwizycji danych (częstotliwość klatek do 20 kHz) o stosunkowo niskiej rozdzielczości przestrzennej (80 x 80 pikseli), ale wyjątkowej dynamice (14 bitów) i wyjątkowo niskim szumie odczytu (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Trzeci port kamerowy zajmuje kamera CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (PixelFly, 1392x1024 pikseli; PCO AG, Niemcy) zamontowana na konfokalnym skanerze z wirującym dyskiem (CSU-10, Yokogawa, Japonia), służąca do zbierania stosów obrazów konfokalnych (z-stacks) w celu szczegółowej rekonstrukcji morfologicznej zabarwionej komórki. Źródłem światła wzbudzenia jest laser ciągły Nd:YVO4 pompowany diodą z podwojeniem częstotliwości (400 mW), emitujący przy 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Chiny). Wiązka lasera o średnicy 2 mm, sterowana migawką (LS6; Vincent Associates), jest kierowana do światłowodu sprzężonego z mikroskopem poprzez jednoportowy kondensator epifluorescencyjny (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Niemcy), zaprojektowany tak, aby przepełnić tylną aperturę obiektywu i zapewnić niemal jednorodne oświetlenie płaszczyzny obiektu. Światło laserowe jest stosowane zamiast konwencjonalnej lampy łukowej ksenonowej w celu maksymalizacji czułości obrazowania Vm poprzez: (1) zastosowanie monochromatycznego światła wzbudzenia w czerwonym skrzydle widma absorpcji, aby zmaksymalizować czułość barwnika na Vm 9, 10 oraz (2) zwiększenie natężenia światła wzbudzenia powyżej poziomu osiągalnego za pomocą lampy łukowej. Światło wzbudzenia było odbijane do preparatu przez lustro dichroiczne o długości fali centralnej 560 nm, a rejestrowane światło fluorescencyjne przechodziło przez filtr barierowy 610 nm (Schott RG610). Połączony efekt zwiększenia natężenia światła i zastosowania niemal optymalnych monochromatycznych długości fal wzbudzenia doprowadził do gwałtownej poprawy czułości obrazowania napięcia, około 50-krotnie w porównaniu z poprzednimi pomiarami 6.

Krok 1.2. Korekta dla uzyskania jednorodnego oświetlenia

Należy użyć standardowego preparatu do fluorescencji (podłoże z zieloną ekscytacją/czerwoną emisją). W torze wiązki lasera należy umieścić odpowiednie filtry neutralne, aby uniknąć nasycenia detektora CCD. Obiektyw należy ustawić w celu uzyskania ostrości na powierzchni preparatu. Należy wyregulować pozycję końca odbiorczego kwarcowego światłowodu przed obiektywem nadawczym lasera, a następnie dostosować pozycję końca wyjściowego światłowodu przymocowanego do mikroskopu, korzystając z odpowiednich elementów sterujących kondensora epi-fluorescencyjnego, aby uzyskać scentrowane i jednorodne oświetlenie pola widzenia.

Krok 1.3. Określenie szumu wibracyjnego

Nanieś małą czarną kropkę z tuszu na powierzchnię szkiełka do fluorescencji. Rejestruj natężenie światła za pomocą NeuroCCD w trybie ciągłego zapisu. Ustaw ostrość obiektywu na ciemną krawędź czarnej kropki z tuszu. Rejestruj natężenie światła przez około 100 msec przy częstotliwości klatek 2 kHz. Wyświetl średnią przestrzenną śladów ułamkowego natężenia światła (ΔF/F) z ok. 20 pikseli odbierających światło z obszaru równomiernie oświetlonego oraz z ok. 20 pikseli wzdłuż krawędzi kropki z tuszu. Nadmiarowy szum w zapisach z pikseli o wysokim kontraście krawędzi odzwierciedla szum wibracyjny w systemie.

Krok 1.4. Izolacja od wibracji

Niezbędne jest ograniczenie wibracji poprzez zastosowanie stołu wibroizolacyjnego do poziomu poniżej szumu śrutowego przy natężeniu światła porównywalnym z warunkami rejestracji eksperymentalnej. Należy regulować stół wibroizolacyjny do momentu, aż szum wibracyjny w natężeniu światła z pikseli obejmujących ostrą krawędź obrazu stanie się pomijalny. Na stole nie mogą znajdować się żadne urządzenia z częściami ruchomymi (migawki mechaniczne, wentylatory). Kable łączące urządzenia znajdujące się na stole z innymi komponentami, które nie są odizolowane od wibracji, muszą być luźne, aby nie przenosiły drgań mechanicznych na mikroskop.

2. Wybór odpowiedniego neuronu do obrazowania Vm

Krok 2.1. Wybór neuronów

Przygotować skrawki mózgu zgodnie ze standardowymi procedurami. Należy wykorzystać linię myszy wykazującą ekspresję EGFP w wybranych komórkach nerwowych. Przy użyciu konfokalnego systemu z dyskiem obrotowym należy zwizualizować neurony znakowane EGFP w skrawku. Wybrać neurony do obrazowania Vm, które posiadają nienaruszone drzewa dendrytyczne/aksonalne oraz wypustki przebiegające równolegle i blisko powierzchni skrawka. Nie jest to możliwe do osiągnięcia u myszy typu dzikiego, ponieważ aksony i cienkie dendryty w większości nie są widoczne w trybie mikroskopii DIC.

3. Obciążanie neuronów barwnikiem napięciowo-czułym

Krok 3.1. Napełnianie pipety patch

Wypełnij szklane pipety patch od strony końcówki roztworem wewnątrzkomórkowym bez barwnika, przykładając podciśnienie przez około 15 s, aż do 2/3 zwężenia elektrody. Roztwór bez barwnika w końcówce jest niezbędny, aby zapobiec rozlaniu barwnika na skrawek tkanki, co zwiększyłoby fluorescencję tła i drastycznie obniżyło stosunek sygnału do szumu. Wypełnij elektrodę od tyłu roztworem zawierającym nieprzenikający przez błony barwnik napięciowy JPW3028 rozpuszczony w roztworze wewnątrzkomórkowym (0,8 mM).

JPW3028, najskuteczniejsza sonda napięciowa do zastosowań wewnątrzkomórkowych, jest dwukrotnie dodatnio naładowanym analogiem serii lipofilnych barwników styrylowych ANEP, który zachowuje wystarczającą rozpuszczalność w wodzie, aby mógł być stosowany do mikroiniekcji. Analog dietylowy tego barwnika posiada praktycznie identyczne charakterystyki (w tym czułość na napięcie) i jest dostępny komercyjnie jako JPW1114 (patrz Tabela 1). Przygotowujemy roztwór zapasowy o stężeniu 20 mM w destylowanej H2O. Alikwoty roztworu zapasowego po 50 μl przechowujemy w zamrożeniu w temperaturze -20 °C. Aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 0,8 mM, w dniu eksperymentu 2 μl roztworu zapasowego rozpuszczamy w 50 μl roztworu wewnątrzkomórkowego. Zapasowy roztwór barwnika jest stabilny i może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. W związku z tym jedną alikwotę 50 μl przechowujemy w temperaturze pokojowej aż do całkowitego zużycia.

Krok 3.2. Szybkie utworzenie giga-uszczelnienia (giga-seal)

Wykonaj patch wcześniej wybranego neuronu i pozwól na swobodną dyfuzję barwnika z pipety somatic patch do somy w konfiguracji whole-cell przez 20-45 min. Kluczowe jest uzyskanie szczelnego połączenia (seal) tak szybko, jak to możliwe, aby ilość roztworu bez barwnika w końcówce pipety była jak najmniejsza. Rozpocznij od ćwiczenia szybkiego patchingu bez barwnika w elektrodzie. Następnie ćwicz patching i ładowanie neuronów barwnikiem, dążąc do wykorzystania minimalnej ilości roztworu bez barwnika w końcówce, unikając jednocześnie zanieczyszczenia otaczającej tkanki. Dzięki praktyce możliwe jest uzyskanie szczelnego połączenia w ciągu 1-2 min.

Krok 3.3. Monitorowanie poziomu barwienia

Podczas dyfuzji barwnika w konfiguracji whole-cell należy monitorować stan fizjologiczny neuronu poprzez rejestrację wywołanych potencjałów czynnościowych w trybie clamp prądowy. Dodatkowo należy monitorować stopień barwienia, rejestrując spoczynkową intensywność światła (RLI) z somy komórki przy częstotliwości odświeżania 2 kHz i ułamkowej intensywności światła dostosowanej za pomocą filtrów neutralnych (stosujemy 0,04% intensywności światła lasera z lasera 400 mW). Proces wprowadzania barwnika należy kontynuować do momentu, aż potencjał czynnościowy zacznie się poszerzać, co zazwyczaj następuje po 20-40 minutach, w zależności od rozmiaru i oporności elektrody.

Poszerzenie kolca jest całkowicie odwracalne i najprawdopodobniej wynika z efektu obciążenia pojemnościowego spowodowanego nasyceniem stężeniem barwnika w błonie somatycznej. Kształt fali kolca zostaje w pełni przywrócony po wyrównaniu stężenia barwnika w całym neuronie.

Krok 3.4. Usuń elektrodę z barwnikiem

Po zakończeniu okresu barwienia ostrożnie odsuń pipetę z błoną od somy w konfiguracji voltage clamp, upewniając się, że w tym procesie następuje przejście z konfiguracji whole-cell do konfiguracji outside-out patch.

Krok 3.5. Oczekiwanie na dyfuzję barwnika

Inkubować skrawek przez dodatkowe 1,5-2 hr w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozprowadzenie się barwnika napięciowo-czułego w wypustkach neuronalnych. Po tym, jak znaczna ilość barwnika dyfunduje z somy do wypustek dendrytycznych i aksonalnych, kształt fali AP zostaje całkowicie przywrócony.

4. Rejestracja optyczna

Krok 4.1. Wybór przedziału komórkowego do obrazowania

Zlokalizuj somę zabarwionego neuronu przy niskim poziomie fluorescencji i ponownie wprowadź elektrodę patch (standardową, bez barwnika) do neuronu w trybie DIC. Wizualizuj wypustki neuronalne przy niskim poziomie światła i częstotliwości odświeżania 10-40 Hz w trybie ciągłego rejestrowania kamery CCD w celu obrazowania napięcia. Zmniejsz poziom światła za pomocą filtrów neutralnych do minimum wymaganego do wizualizacji badanego obiektu. Podczas pozycjonowania zabarwionego neuronu stosujemy 0,01% intensywności lasera o mocy 400 mW. Za pomocą stolika X-Y ustaw badaną wypustkę neuronalną na środku obszaru obrazowania. Chroń somę przed światłem wzbudzenia, używając częściowo zamkniętej przysłony ograniczającej pole widzenia mikroskopu. Osłonięcie somy przed światłem wzbudzenia o wysokiej intensywności znacznie ograniczy uszkodzenia fotodynamiczne podczas rejestracji.

Krok 4.2 Rejestracja sygnałów optycznych związanych z przejściowymi zmianami potencjału błonowego

Rejestruj sygnały optyczne związane z potencjałami czynnościowymi (AP) propagującymi się wstecznie w pojedynczych gałęziach dendrytycznych. Rejestruj sygnały optyczne związane z AP w aksonie. Rejestruj sygnały optyczne związane z wstecznie propagującymi się AP w kolcach dendrytycznych. Stosuj częstotliwości odświeżania klatek odpowiednie dla dokładnej rekonstrukcji kształtu sygnału oraz ogranicz czas rejestracji i ekspozycję na wysokointensywne światło wzbudzenia do minimum, aby zminimalizować blaknięcie barwnika i uszkodzenia fotodynamiczne. Na przykład badanie sekwencji inicjacji i propagacji pojedynczych potencjałów czynnościowych w aksonie wymaga okresów rejestracji trwających 5-10 msec. Intensywność światła wzbudzenia podczas rejestracji stanowi kompromis pomiędzy stosunkiem sygnału do szumu z jednej strony a stopniem blaknięcia barwnika i uszkodzeń fotodynamicznych z drugiej. W przypadku rejestracji z długich odcinków aksonów, gdy oświetlany jest obszar o średnicy 300 μm, stosujemy 100% intensywności lasera o mocy 400 mW. Gdy światło wzbudzenia jest skupione na obszarze o średnicy 30 μm w celu obrazowania kolców dendrytycznych, stosujemy 10-25% intensywności światła laserowego. Wymagany czas rejestracji jest istotnym czynnikiem determinującym optymalną intensywność światła wzbudzenia; krótsze okresy rejestracji pozwalają na zastosowanie wyższych intensywności światła. Optymalną intensywność oświetlenia najlepiej ustalić empirycznie dla każdego preparatu i ustawień pomiarowych.

5. Analiza danych

Krok 5.1. Korekta surowych danych pod kątem znanych błędów

Analizę i wyświetlanie danych przeprowadzono przy użyciu programu NeuroPlex (RedShirtImaging) napisanego w języku IDL (ITT Visual Information Solutions, Boulder, Colorado) oraz niestandardowych rutyn w języku Visual Basic. W warunkach niskiego natężenia światła fluorescencja tła staje się istotnym czynnikiem determinującym wielkość sygnału ΔF/F. Surowe dane zostały najpierw skorygowane pod kątem tego efektu poprzez odjęcie średniej intensywności fluorescencji tła, wyznaczonej z niebarwionego obszaru skrawka. Następnie wykorzystano oprogramowanie do wyrównywania sygnałów, aby skorygować jitter czasowy w inicjacji AP, a także ewentualne niewielkie przemieszczenia preparatu podczas uśredniania. W dziedzinie czasu sygnały AP zostały wyrównane poprzez korelację wzajemną elektrycznie rejestrowanych AP w każdej próbie z sygnałem referencyjnym uzyskanym na początku uśredniania (Rysunek 1B). W dziedzinie przestrzennej obrazy wyrównano offline w dwóch wymiarach za pomocą korelacji wzajemnej obrazów, aby skompensować ewentualne niewielkie ruchy boczne preparatu. Prawidłowy nacisk obrazu w wymiarze z weryfikowano przed każdą pojedynczą próbą; często konieczne były niewielkie korekty. Sygnały wyrównane przestrzennie i czasowo uśredniono, jak pokazano na Rysunku 1B. Powolne zmiany natężenia światła wynikające z blaknięcia barwnika skorygowano, dzieląc dane przez odpowiednią podwójną funkcję wykładniczą wyprowadzoną z prób rejestracyjnych bez stymulacji (Rysunek 1B). Kształt sygnału AP zrekonstruowano z zestawu punktów danych za pomocą interpolacji splajnami sześciennymi (Cubic Spline Interpolation), czyli ciągłej krzywej kawałkowej przechodzącej przez każdy punkt danych. Aby potwierdzić, że sygnał z barwnika wrażliwego na napięcie odzwierciedla potencjał błonowy bez istotnych zniekształceń w skali milisekundowej, elektryczny sygnał AP z somy porównano z optycznym sygnałem AP z sąsiedniego pagórka aksonu, jak pokazano na Rysunku 3B. Oba sygnały nakładają się bardzo ściśle, biorąc pod uwagę szum śrutowy w rejestracji optycznej.

Analiza neuronu z wykorzystaniem obrazowania mikroskopowego i rejestracji elektrooptycznej; zaznaczone AIS, węzeł i akson.
Rysunek 1. Analiza danych (Animacja). (A) Górny panel: obraz konfokalny o wysokiej rozdzielczości zabarwionego neuronu z aksonem w pozycji rejestracyjnej. Schematycznie przedstawiono elektrodę rejestrującą przymocowaną do somy oraz zewnątrzkomórkową elektrodę stymulującą obok dendrytu podstawnego. Potencjały czynnościowe wywołane zewnątrzkomórkową stymulacją synaptyczną. Dolny panel: obraz fluorescencyjny aksonu o niskiej rozdzielczości przestrzennej, uzyskany za pomocą matrycy CCD wykorzystywanej do obrazowania Vm. (B) Rejestracje elektrodowe z somy (ślady czarne), rejestracje optyczne z AIS (ślady czerwone) oraz z węzła Ranviera (ślady zielone). Górne ślady: surowe dane z 9 prób wykazujące jitter czasowy w inicjacji AP. Drugi rząd śladów: sygnały wyrównane czasowo. Trzeci rząd śladów: sygnał uśredniony. Czwarty rząd śladów: korekcja fotowybielania. Dolne ślady: interpolacja splotem sześciennym z jednym przebiegiem wygładzania czasowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowo wykonana mikroskopia konfokalna powinna umożliwić wyraźną identyfikację nienaruszonych wypustek neuronalnych, które znajdują się blisko powierzchni skrawka i są położone w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Kluczowy jest wybór neuronów odpowiednich do obrazowania napięciowego przed wprowadzeniem barwnika wrażliwego na napięcie. Przykład obrazów konfokalnych neuronów piramidowych warstwy L5 wykazujących ekspresję EGFP w skrawku kory (transgeniczna linia myszy Crym) przedstawiono na Rysunku 2. Ak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł opisuje metodę rejestracji z użyciem barwnika wrażliwego na napięcie w celu monitorowania aktywności elektrycznej pojedynczych neuronów z submikrometryczną i submilisekundową rozdzielczością czasoprzestrzenną. Wzbudzanie laserowe przy niemal optymalnej długości fali (pod kątem wielkości sygnału) poprawiło czułość rejestracji około 50-krotnie w porównaniu z wcześniejszymi podejściami. Obecna czułość umożliwia monitorowanie sygnałów elektrycznych ze wszystkich części pojedynczych neuronów, w tym z dendryt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dejan Zecevic oświadcza, że jest współwłaścicielem firmy RedShirtImaging LLC., specjalizującej się w szybkich kamerach CCD o niskim poziomie szumów, wykorzystywanych w rejestracji barwników napięciowo-czułych. Pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych interesów finansowych ani potencjalnych konfliktów interesów związanych z niniejszym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni naszym współpracownikom, Knutowi Holthoffowi, Arthurowi Konnerthowi i Marco Canepariemu, którzy uczestniczyli w początkowym opracowaniu tej techniki, a także Leslie M. Loew za uprzejme udostępnienie barwników. Praca finansowana z grantu NSF IOS-0817969, grantów NIH NS068407 i M136043 oraz przez Instytut Neuronauk Kavli na Uniwersytecie Yale.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komponenty zestawu
Mikroskop pionowyOlympus Inc.BX51WIZ trzema portami kamerowymi
Zmotoryzowany stolik przesuwnySiskiyouMXOPi.2
Kondensator do epi-fluorescencji dla Olympus BX51TILL Photonics0000-560-11659
Mikroskop pionowyCarl Zeiss, LLCAxioExaminer D1Z trzema portami kamerowymi
Zmotoryzowana płyta górnaScientifica LimitedMMBP
Kondensator do epi-fluorescencji dla Zeiss Axi–xaminerTILL Photonics
Kamera do akwizycji danychRedShirtImaging LLCNeuroCCD-SMWysoka prędkość, niski szum odczytu
CCD do IR-DICDage-MTIIR-1000
Konfokalny skaner z wirującym dyskiemYokogawaCSU-10
CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w skanerze konfokalnymPCO AGPixelFly1392x1024 pikseli
Laser DPSS CW (532 Nm)CNI Optoelectronics Tech. Co., LtdMLL-III-532 400mWŹródło światła wzbudzenia
Wielomodowy sprzęgacz światłowodowySiskiyouSM-CFT
Przewodnik świetlnyTILL Photonics0000-515-11524
MigawkaVincent AssociatesLS6
Stół wibroizolacyjnyMinus k TechnologyMK26
Odczynniki specyficzne
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114)Life TechnologiesD-6923Barwnik wrażliwy na napięcie
Linia myszy Crym-EGFPGENSAT (MMRRC)STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/MmcdRzadka ekspresja EGFP w neuronach warstwy 5 kory mózgowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  2. Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
  3. Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
  4. Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
  5. Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
  6. Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
  7. Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
  8. Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
  9. Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
  10. Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
  11. Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
  12. Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
  13. Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
  14. Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
  15. Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
  16. Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
  17. Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie potencja u b onowegoprzygotowanie skrawka m zgurejestracja sygna u optycznegoobrazowanie kolc w dendrytycznychrejestracja kolaterali aksonalnychtechnika elektrody patchkonfiguracja mikroskopii fluorescencyjnejmetoda izolacji od wibracjiwprowadzanie barwnika JPW 3028

Powiązane artykuły