Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrozumienie właściwości biofizycznych i organizacji funkcjonalnej pojedynczych neuronów oraz sposobu, w jaki przetwarzają one informacje, jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów działania mózgu. Podstawową funkcją każdej komórki nerwowej jest przetwarzanie sygnałów elektrycznych, zazwyczaj pochodzących z wielu źródeł. Właściwości elektryczne wypustek neuronalnych są niezwykle złożone, dynamiczne i w ogólnym przypadku niemożliwe do przewidzenia bez szczegółowych pomiarów. Aby uzyskać taki pomiar, idealnie byłoby móc monitorować w wielu miejscach zdarzenia podprogowe w czasie, gdy przemieszczają się one z miejsc powstawania na wypustkach neuronalnych i sumują się w konkretnych lokalizacjach, wpływając na inicjację potencjału czynnościowego. Cel ten nie został osiągnięty w żadnym neuronie ze względu na ograniczenia techniczne pomiarów z wykorzystaniem elektrod. Aby wyeliminować tę wadę, wysoce pożądane jest uzupełnienie metody patch-clamp o techniki obrazowania, które pozwalają na rozległe równoległe rejestracje ze wszystkich części neuronu. W niniejszym opracowaniu opisujemy taką technikę – optyczną rejestrację przejściowych zmian potencjału błonowego za pomocą organicznych barwników napięciowo-czułych (obrazowanie Vm) – charakteryzującą się rozdzielczością poniżej milisekundy i mikrometra. Nasza metoda opiera się na pionierskich pracach nad molekularnymi sondami napięciowo-czułymi 2. Wiele aspektów pierwotnej technologii było sukcesywnie udoskonalanych przez kilka dekad 3, 5, 11. Ponadto wcześniejsze prace udokumentowały dwie istotne cechy obrazowania Vm. Po pierwsze, sygnały fluorescencyjne są liniowo proporcjonalne do potencjału błonowego w całym zakresie fizjologicznym (-100 mV do +100 mV; 10, 14, 16). Po drugie, wprowadzenie do neuronów zastosowanego tutaj barwnika napięciowo-czułego (JPW 3028) nie wywołuje wykrywalnych efektów farmakologicznych. Odnotowane poszerzenie kolca podczas wprowadzania barwnika jest całkowicie odwracalne 4, 7. Dodatkowo dowody eksperymentalne wykazują, że możliwe jest wykonanie znacznej liczby (do setek) rejestracji przed wystąpieniem jakichkolwiek wykrywalnych efektów fototoksycznych 4, 6, 12, 13. Obecnie wykorzystujemy doskonałą jasność i stabilność laserowego źródła światła o niemal optymalnej długości fali, aby zmaksymalizować czułość techniki obrazowania Vm. Obecna czułość pozwala na wielopunktową optyczną rejestrację zmian Vm ze wszystkich części neuronu, w tym z aksonów i kolaterali aksonalnych, końcowych gałęzi dendrytycznych oraz poszczególnych kolców dendrytycznych. Uzyskane informacje o oddziaływaniach sygnałów mogą być analizowane ilościowo, jak również bezpośrednio wizualizowane w formie filmu.
Protokół
1. Konfiguracja sprzętu
Krok 1.1. Konfiguracja obrazowania
Kluczem do rejestracji sygnałów z barwników napięciowo-wrażliwych jest odpowiednia konstrukcja układu. Używamy mikroskopu odwróconego (BX51WI Olympus lub Zeiss AxioExaminer) wyposażonego w trzy kamery. Układ został zaprojektowany do oświetlania poszczególnych neuronów w skrawkach mózgu światłem wzbudzenia w trybie epi-fluorescencji i mikroskopii szerokopolowej, przy użyciu obiektywów imersyjnych wodnych Nikon 60X/1.0 NA lub Zeiss 63X/1.0 NA. Nasze mikroskopy są przytwierdzone do stołu wibroizolacyjnego i wyposażone w zmotoryzowane stoliki. Każdy mikroskop posi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Prawidłowo wykonana mikroskopia konfokalna powinna umożliwiać wyraźną identyfikację nienaruszonych wypustek neuronalnych, które znajdują się blisko powierzchni skrawka i leżą w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Krytyczne jest wybranie neuronów odpowiednich do obrazowania napięcia przed obciążeniem ich barwnikiem wrażliwym na napięcie. Przykład obrazów konfokalnych neuronów piramidowych L5 wykazujących ekspresję EGFP w skrawku kory (transgeniczna linia myszy Crym) przedstawiono na Rysunku 2. Aksony poszcz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy artykuł opisuje metodę rejestracji z użyciem barwnika wrażliwego na napięcie w celu monitorowania aktywności elektrycznej pojedynczych neuronów z submikrometryczną i submilisekundową rozdzielczością czasoprzestrzenną. Wzbudzanie laserowe przy niemal optymalnej długości fali (pod kątem wielkości sygnału) poprawiło czułość rejestracji około 50-krotnie w porównaniu z wcześniejszymi podejściami. Obecna czułość umożliwia monitorowanie sygnałów elektrycznych ze wszystkich części pojedynczych neuronów, w tym z dendryt.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Dejan Zecevic oświadcza, że jest współwłaścicielem firmy RedShirtImaging LLC., specjalizującej się w szybkich kamerach CCD o niskim poziomie szumów, wykorzystywanych w rejestracji barwników napięciowo-czułych. Pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych interesów finansowych ani potencjalnych konfliktów interesów związanych z niniejszym badaniem.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni naszym współpracownikom, Knutowi Holthoffowi, Arthurowi Konnerthowi i Marco Canepariemu, którzy uczestniczyli w początkowym opracowaniu tej techniki, a także Leslie M. Loew za uprzejme udostępnienie barwników. Praca finansowana z grantu NSF IOS-0817969, grantów NIH NS068407 i M136043 oraz przez Instytut Neuronauk Kavli na Uniwersytecie Yale.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komponenty zestawu | |||
| Mikroskop pionowy | Olympus Inc. | BX51WI | Z trzema portami kamerowymi |
| Zmotoryzowany stolik przesuwny | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Kondensator do epi-fluorescencji dla Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Mikroskop pionowy | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | Z trzema portami kamerowymi |
| Zmotoryzowana płyta górna | Scientifica Limited | MMBP | |
| Kondensator do epi-fluorescencji dla Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Kamera do akwizycji danych | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | Wysoka prędkość, niski szum odczytu |
| CCD do IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Konfokalny skaner z wirującym dyskiem | Yokogawa | CSU-10 | |
| CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w skanerze konfokalnym | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pikseli |
| Laser DPSS CW (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Źródło światła wzbudzenia |
| Wielomodowy sprzęgacz światłowodowy | Siskiyou | SM-CFT | |
| Przewodnik świetlny | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Migawka | Vincent Associates | LS6 | |
| Stół wibroizolacyjny | Minus k Technology | MK26 | |
| Odczynniki specyficzne | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Barwnik wrażliwy na napięcie |
| Linia myszy Crym-EGFP | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Rzadka ekspresja EGFP w neuronach warstwy 5 kory mózgowej |
Bibliografia
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
