Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Podsumowanie

Pomiary aktywności kanałów potasowych Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych patch clamp) równolegle z pomiarami odpowiedzi skurczowych/rozkurczowych (przy użyciu myografii ciśnieniowej) mogą dostarczyć istotnych informacji na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Streszczenie

Skurcz lub rozkurcz komórek mięśni gładkich w ścianach tętnic oporowych determinuje średnicę tętnicy, a tym samym kontroluje przepływ krwi przez naczynie i wpływa na systemowe ciśnienie tętnicze. Proces skurczu jest regulowany przede wszystkim przez stężenie wapnia w cytozolu ([Ca²⁺]_cyt), które z kolei jest kontrolowane przez szereg transporterów i kanałów jonowych. Kanały jonowe są powszechnymi pośrednikami w szlakach transdukcji sygnałów aktywowanych przez hormony wazoaktywne w celu wywołania skurczu naczyń lub rozszerzenia naczyniowego. Kanały jonowe są często celem środków terapeutycznych, albo celowo (np. blokery kanałów wapniowych stosowane w celu wywołania rozszerzenia naczyń i obniżenia ciśnienia krwi), albo nieumyślnie (np. prowadząc do niepożądanych działań niepożądanych ze strony układu sercowo-naczyniowego).

Kanały potasowe Kv7 (KCNQ) aktywowane napięciem zostały niedawno uznane za istotne cele fizjologiczne i terapeutyczne w regulacji skurczu mięśni gładkich. Aby wyjaśnić konkretną rolę kanałów Kv7 zarówno w fizjologicznej transdukcji sygnału, jak i w działaniu czynników terapeutycznych, konieczne jest zbadanie, w jaki sposób ich aktywność jest modulowana na poziomie komórkowym, a także ocena ich wkładu w kontekście nienaruszonej tętnicy.

Tętnice krezkowe szczura stanowią użyteczny system modelowy. Tętnice te można łatwo wypreparować, oczyścić z tkanki łącznej i wykorzystać do przygotowania izolowanych miocytów tętniczych do elektrofizjologii metodą patch-clamp lub kaniulować i poddać ciśnieniu w celu pomiaru odpowiedzi naczynioskurczowych/naczyniorozkurczowych w stosunkowo fizjologicznych warunkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody stosowane dla obu rodzajów pomiarów i przedstawiamy przykłady tego, jak projekt eksperymentalny może zostać zintegrowany, aby zapewnić lepsze zrozumienie roli tych kanałów jonowych w regulacji napięcia naczyniowego.

Protokół

1. Chirurgiczne wycięcie splotu naczyniowego krezki jelita cienkiego

1. Zanestetyzuj szczura rasy Sprague-Dawley o masie 300-400 g za pomocą izofluranu (4%) podanego drogą wziewną.
2. Wykonaj laparotomię pośrodkową, aby odsłonić krezkę jelita cienkiego. Wyprowadź jelito cienkie i grube przez nacięcie brzuszne, zachowując szczególną ostrożność, aby uniknąć urazu odsłoniętego jelita i krezki. Delikatnie rozłóż krezkę na sterylnej gazie.
3. Chirurgicznie wyciśnij jelito cienkie oraz fragment jelita grubego, w tym kątnicę (naczynia krwionośne należy ostrożnie przeciąć wzdłuż marginesów oraz w miejscach odgałęzień od głównych pni tętnicy i żyły krezkowej górnej).
4. Przenieś wyciętą tkankę do zlewki zawierającej lodowaty roztwór do sekcji (Tabela 1).
5. Po wycięciu jelita szczura należy humanitarnie uśmiercić podczas anestezji.

2. Disekcja i oczyszczanie tętnic

1. Przenieś wycięte jelito i łuk krezkowy do schłodzonej komory sekcyjnej (4-5 °C) zawierającej roztwór sekcyjny. Komora składa się ze szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm z podstawą z elastomeru SYLGARD 184, która umożliwia umieszczenie szpilek sekcyjnych; szalka Petriego jest umieszczona w schłodzonej podstawie, której temperatura jest utrzymywana na poziomie 4-5 °C za pomocą cyrkulującej kąpieli wodnej.
2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wytnij odcinek o długości około 10-12 cm z całego jelita. Przetnij oba końce odcinka jelita, zachowując przytwierdzone do niego naczynia krwionośne, a następnie usuń niewykorzystane jelito z komory, pozostawiając jeden odcinek z przytwierdzonymi naczyniami (łukiem krezkowym) w izolacji.
3. Przyszpil odcinek jelita cienkiego, rozkładając krezkę na najbliższej ścianie komory w taki sposób, aby główna gałąź tętnicy/żyły krezkowej górnej znajdowała się w centrum, a kolejne rzędy odgałęzień promieniowały od środka (Rysunek 1). Szpilki umieszczaj wyłącznie w segmentach jelita (nie w naczyniach krwionośnych).
4. Odróżnij tętnice od żył po ich stosunkowo jasnoczerwonym kolorze, grubych ścianach i charakterystycznych odgałęzieniach w kształcie litery V, w przeciwieństwie do odgałęzień w kształcie litery U widocznych w żyłach.
5. Obserwując preparat przez oświetlony mikroskop sekcyjny, ostrożnie usuń tkankę tłuszczową i tkankę łączną otaczającą tętnice 2^go- 4^go rzędu w pobliżu jelit (przerywana linia na Rysunku 1) za pomocą mikropincety i nożyczek. Odsuwanie sąsiednich żył ułatwia usuwanie tkanki tłuszczowej i łącznej. Unikaj niepotrzebnego rozciągania tętnic.
6. Oczyszczone z tkanki łącznej odcinki tętnicy krezkowej można następnie wypreparować i wykorzystać do izolacji komórek (do badań metodą patch clamp na pojedynczych komórkach, sekcje 3-4) lub kaniulować do mikrografii ciśnieniowej (sekcja 5). Wycinaj odcinki między punktami rozgałęzień, zazwyczaj o długości do 1 cm.

3. Izolacja komórek do badań metodą patch-clamp

1. Przygotować 0,5 L roztworu do izolacji (Tabela 1) i podzielić go na 2 porcje przed skorygowaniem pH. Pierwszą porcję (zwykle 100 ml) należy podgrzać do 37 °C i skorygować pH do 7,2 w temperaturze 37 °C (roztwór do izolacji 37 °C). Drugą porcję roztworu do izolacji należy schłodzić do 4 °C i skorygować pH do 7,2 w temperaturze 4 °C (lodowaty roztwór do izolacji). Po skorygowaniu pH osmolarność obu roztworów musi zostać dostosowana do 298 mOsm poprzez dodanie odpowiedniej ilości D-glukozy lub H₂O.
2. Przenieść 2 ml roztworu do izolacji 37 °C do szklanej fiolki i inkubować w 37 °C do wykorzystania w kroku 3.4. Dodać 20 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 10 ml roztworu do izolacji 37 °C, rozpuścić, ponownie podgrzać do 37 °C i ponownie skorygować pH do 7,2. Do 2 ml tego roztworu dodać 4 mg kolagenazy typu VIII (Sigma, Lot 089K8612: 633 units/mg aktywności kolagenazy, 285 units/mg aktywności kazeinazy, 1,6 units/mg aktywności klostripainy), 0,64 mg elastazy typu IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 units/mg; dodać 40 μl zapasu 16 mg/ml przygotowanego w roztworze do izolacji 37 °C) oraz 2 μl 1 M DL-ditiotreitolu (DTT Sigma); podgrzać ten roztwór enzymatyczny do 37 °C w przygotowaniu do kroku 3.5.
3. Przenieść 2-3 segmenty tętnicy krezkowej do 35-mm szalki do hodowli tkanek zawierającej 2 ml lodowatego roztworu do izolacji i umieścić szalkę na lodzie. Pociąć segmenty tętnicy krezkowej na kawałki o długości 3-4 mm.
4. Używając pipety Pasteura z końcówką wypalaną ogniowo (aby zapobiec uszkodzeniu tętnic), przenieść segmenty tętnic do szklanej fiolki (15 x 45 mm, 1 dram) zawierającej 2 ml podgrzanego roztworu do izolacji 37 °C i inkubować przez 30 min w 37 °C.
5. Po 30 min ostrożnie odessać roztwór do izolacji 37 °C za pomocą pipety Pasteura, dodać 2 ml ciepłego roztworu enzymatycznego i inkubować przez 35 min w 37 °C.
6. Natychmiast po 35-minutowej inkubacji w roztworze enzymatycznym umieścić fiolkę na lodzie, odessać roztwór enzymatyczny i dodać 2 ml lodowatego roztworu do izolacji (powtórzyć odsysanie i dodawanie świeżego lodowatego roztworu do izolacji 4 razy). Następnie, w objętości 1 ml lodowatego roztworu do izolacji, delikatnie rozetrzeć segmenty tętnic wypaloną pipetą Pasteura 10-20 razy, aby uwolnić pojedyncze komórki mięśni gładkich tętnicy krezkowej (MASMCs).
7. Okresowo weryfikować wygląd miocytów, umieszczając kroplę zawiesiny komórkowej na 35-mm szalce i obserwując ją pod mikroskopem. Zdrowe MASMCs powinny mieć gładki, wydłużony wygląd. Nie wszystkie komórki w ścianie tętnicy zostaną uwolnione. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.
8. Innym użytecznym wskaźnikiem kondycji MASMC jest ich tolerancja na fizjologiczne stężenia Ca²⁺. Napełnić komorę rejestracyjną (Bioscience Tools, #CSC-25L) roztworem kąpieli zawierającym 2 mM CaCl₂ (pH 7,3 w temperaturze pokojowej (RT), skład opisano w Tabeli 1) i umieścić mostek agarowy (zgięta kapilara szklana wypełniona 2% agarem w 2 M KCl, wstawiona do elektrody odniesienia (Warner Instrument, REF-3L)) wewnątrz komory. Używając wypalonej pipety Pasteura, przenieść około 100-200 μl zawiesiny komórkowej do komory rejestracyjnej i pozostawić komórki do adhezji na 15 min. Nieuszkodzone komórki nie powinny kurczyć się znacząco w roztworze zawierającym 2 mM CaCl₂ (komórki powinny pozostać wydłużone lub prętowate, a nie zaokrąglić się w formie kulek).
9. Po dodaniu pierwszej porcji zawiesiny komórkowej do komory rejestracyjnej, do pozostałej objętości zawiesiny komórkowej należy dodać 0,25 ml roztworu kąpieli zawierającego 2 mM CaCl₂. Tę pozostałą zawiesinę komórkową można przechowywać w tym roztworze na lodzie i wykorzystywać do rejestracji metodą patch clamp przez maksymalnie 6 h.

4. Wykorzystanie metody patch-clamp w konfiguracji whole-cell do pomiaru prądów potasowych Kv7 lub napięcia błony

1. Po przywieraniu miocytów do szklanego dna komory pomiarowej (okryweczka okrągła nr 1, 25 mm, Warner Instruments), rozpocząć ciągłą perfuzję roztworu kąpielowego (Tabela 1). W celu rejestracji prądów Kv7 w izolacji od prądów potasowych opóźnionego prostowania z rodzin Kv1 i Kv2, roztwór kąpielowy należy uzupełnić o 100 μM GdCl₃.
2. Wykonać pipetę patch z szkła borokrzemianowego (Kimax-51, Kimble Chase), używając wyciągacza pipet i mikrokuźni; jej oporność po napełnieniu roztworem wewnętrznym powinna wynosić 4-5 MΩ (Tabela 1). Dolną ¹/₃ część pipety (~1-2 mm nad końcówką) pokryć SYLGARD 184.
3. Do rejestracji prądów Kv7 w MASMC należy zastosować technikę clampowania napięciowej całej komórki z perforowanym patchem (perforated patch whole cell voltage clamp). Zastosowanie konfiguracji z perforowanym patchem pomaga zapobiec wyczerpaniu fosfatydyloinozytolu 4,5-bisfosforanu (PIP₂) błony i następującemu szybkiemu (w ciągu 5 min) zanikowi prądów Kv7, co jest powszechnie obserwowane przy zastosowaniu konwencjonalnej konfiguracji z przerwaniem błony (ruptured patch). Uzupełnić roztwór wewnętrzny (Tabela 1) o 120 μg/ml amfoterycyny B: dodać 3 μl roztworu zapasowego amfoterycyny B o stężeniu 2 mg/ml (przygotowanego w DMSO, przechowywanego w zamrożonych małych alikwotach i chronionego przed światłem) do 0,5 ml roztworu wewnętrznego. Napełnić końcówkę pipety patch roztworem wewnętrznym bez amfoterycyny B, zanurzając końcówkę pipety w odpowiednim roztworze, a następnie stosując podciśnienie na drugim końcu za pomocą strzykawki 10 ml podłączonej za pomocą odcinka rurki (Tygon R-3603). Dodać z góry roztwór pipetowy zawierający amfoterycynę B, używając końcówki do mikropipety Eppendorf Microloader, aż pipeta zostanie wypełniona w połowie. Usunąć pęcherzyki powietrza, delikatnie opukując pipetę. Użyć pipety niezwłocznie.
4. Włożyć pipetę do uchwytu elektrody i za pomocą mikromanipulatora opuścić pipetę na powierzchnię wydłużonego miocytu (blisko jądra, ale nie na nim, Rysunek 2). Gdy oporność w pipecie wzrośnie do 6-10 MΩ, zastosować podciśnienie w celu uzyskania giga-uszczelnienia (giga-seal >10 GΩ).
5. Ustawić napięcie podtrzymujące na 0 mV w oczekiwaniu na perforację błony. Zastosować skoki napięcia trwające 100 ms do +10 mV, a następnie do -10 mV i użyć wzmacniacza do kompensacji szybkich przejściowych pojemności pipety. Równocześnie z pojawieniem się przejściowych pojemności całej komórki, małe, utrzymujące się prądy dodatnie (zwykle 2-10 pA) wskażą obecność funkcjonalnych kanałów Kv7.
6. Skuteczna perforacja amfoterycyną B zredukuje oporność dostępu do 35 MΩ lub mniej. Rejestrację prądu można następnie rozpocząć, stosując protokół skoków napięcia trwających 5 s od napięcia podtrzymującego -4 mV. Napięcie podtrzymujące -4 mV stosujemy w celu uzyskania niemal maksymalnej inaktywacji innych typów prądów potasowych opóźnionego prostowania (pośredniczonych głównie przez kanały Kv1 i Kv2), które w przeciwnym razie zakłócałyby rejestrację stosunkowo małych, nieinaktywujących się prądów Kv7. Długi (5 s) protokół skoków napięcia jest niezbędny do osiągnięcia stanu stacjonarnego aktywacji kanałów Kv7, które wykazują powolną napięciowo zależną aktywację i deaktywację. Prądy Kv7 nie ulegają inaktywacji podczas utrzymywanych skoków napięcia.
7. Aby zarejestrować zależność prądowo-napięciową (I-V) prądu Kv7, zastosować 5-sekundowe skoki napięcia w zakresie od -84 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów Kv7 jest minimalne, do +16 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów Kv7 osiąga plateau; po 5 s przy każdym napięciu testowym powrócić do napięcia podtrzymującego (-4 mV) na 10 s. Pełna seria impulsów testowych zajmie około 3,5 min (Rysunek 3A). Wykonać 2-3 kontrolne pomiary I-V, aby upewnić się, że rejestrowane prądy są stabilne w czasie. Wykreślić średnie prądy końcowe impulsu (średnie prądy zarejestrowane przez ostatnią 1 s) w funkcji napięcia, aby stworzyć krzywą I-V (Rysunek 3D). Kontrolne krzywe I-V powinny się mniej więcej pokrywać, jeśli prądy są stabilne.
8. Przed zastosowaniem jakichkolwiek czynników farmakologicznych rozpocząć protokół przebiegu czasowego zaprojektowany do ciągłej rejestracji prądu przy -20 mV. Upewnić się, że rejestracja prądu jest stabilna przez co najmniej 5 min przed aplikacją leku. Stosować czynniki farmakologiczne przez 5-15 min lub do osiągnięcia stanu stacjonarnego (Rysunek 3C); następnie przerwać protokół przebiegu czasowego i zarejestrować dwie krzywe I-V, stosując protokół skoków napięcia. Wypłukać lek i zarejestrować przebieg czasowy wypłukiwania leku, a następnie zarejestrować dwie dodatkowe krzywe I-V.
9. Na koniec eksperymentu zastosować 10 μM linopirdyny lub 10 μM XE991, nieodwracalnych inhibitorów kanałów Kv7; leki te powinny całkowicie zahamować prądy rejestrowane przy napięciach ujemnych względem -20 mV (Rysunek 3D).
10. Po każdym eksperymencie przemyć komorę i system perfuzyjny detergentem, etanolem i gorącą wodą, aby usunąć wszelkie ślady użytych leków.

5. Wykorzystanie nienaruszonych odcinków tętnic do mikrografii ciśnieniowej

1. Do eksperymentu z myografii ciśnieniowej wykorzystuje się system myografu ciśnieniowego zakupiony w Danish Myo Technology (DMT A/S, Dania, Model 110P). Zamocuj odcinek tętnicy w komorze ze stali nierdzewnej, wkładając nieruchomą lewą kaniulę szklaną do jednego końca, a ruchomą prawą kaniulę szklaną do drugiego końca. Wbudowano dwa przetworniki ciśnienia (P1 po prawej i P2 po lewej stronie) do monitorowania ciśnienia w świetle tętnicy. Ciecz z prawej kaniuli szklanej będzie służyć do regulacji ciśnienia wewnątrz tętnicy do poziomu zbliżonego do fizjologicznego. Na początek napełnij otwartą strzykawkę o pojemności 10 ml (pełniącą rolę kolumny ciśnienia zasilanej grawitacyjnie) roztworem do światła naczynia (Tabela 1). Podnieś strzykawkę, aby wtłoczyć roztwór przez rurkę polietylenową do prawej kaniuli szklanej, dbając o to, aby w rurce lub kaniuli nie powstały pęcherzyki powietrza. Lewą kaniulę należy uprzednio napełnić roztworem do światła naczynia za pomocą strzykawki 1 ml. Wypełnij komorę myografu ciśnieniowego 10 ml roztworu kąpielowego dla naczyń (Tabela 1). Luźno zawieś dwa przygotowane cienkie nylonowe szwy po każdej stronie, obok kaniul szklanych.
2. Ostrożnie przenieś wypreparowany odcinek tętnicy krezkowej (zazwyczaj odcinek 3^rd lub 4^th rzędu, o średnicy około 200 - 350 μm; z kroku 2.6) z komory preparowania do komory myografu ciśnieniowego, trzymając jeden koniec odcinka za pomocą mikropincety.
3. Obserwując naczynie przez oświetlony mikroskop preparacyjny, przytrzymaj jeden koniec odcinka tętnicy i delikatnie nasuń go na lewą kaniulę szklaną, a następnie zabezpiecz koniec za pomocą nylonowych szwów. Delikatnie przepłucz światło zamocowanego naczynia cieczą do światła, aby usunąć krew i zanieczyszczenia z wnętrza naczynia. Zawór do lewej strzykawki należy następnie zamknąć, tak aby ta strona stanowiła statyczną kolumnę cieczy, względem której regulowane jest ciśnienie z prawej strony.
4. Za pomocą mikromanipulatora ustaw ruchomą prawą kaniulę szklaną bliżej odcinka tętnicy i nasuń na nią prawy koniec odcinka, zabezpieczając go na koniec nylonowymi szwami. Odetnij nadmiar nici szewnych.
5. Zamocuj jednostkę myografu ciśnieniowego na stoliku nad mikroskopem myograficznym. Nałóż pokrywkę na komorę myografu ciśnieniowego. Pokrywka komory zawiera wlot do superfuzyjnego przepływu cieczy oraz przymocowaną do niego rurkę ssącą. Podłącz wlot do kolektora, aby umożliwić grawitacyjny przepływ roztworu kąpielowego w temperaturze pokojowej lub roztworu 60 mM KCl do komory myografu ciśnieniowego. Substancje testowe, takie jak leki lub hormony, które w pomiarach patch-clamp wpływają na funkcję kanałów Kv7, są zazwyczaj aplikowane bezpośrednio do roztworu kąpielowego, a nie poprzez superfuzyjny przepływ kąpieli lub w roztworze do światła naczynia. Superfuzyjny przepływ roztworu kąpielowego będzie wykorzystywany do wypłukania roztworu KCl. Podłącz rurkę ssącą do systemu próżniowego w celu usunięcia nadmiaru superfuzyjatu. Włóż czujnik temperatury do roztworu kąpielowego przez otwór znajdujący się w pokrywie komory myografu.
6. Podłącz jednostkę myografu ciśnieniowego do systemu myo-interface, który jest sprzętem umożliwiającym komunikację jednostki myografu z oprogramowaniem myoview (DMT).
7. Uruchom oprogramowanie myoview na komputerze. W oknie parametrów ustaw temperaturę docelową na 35 °C z tolerancją temperatury 1 °C, docelowe ciśnienie wlotowe na 80 mmHg oraz docelowe ciśnienie wylotowe na 80 mmHg. Wczytaj plik kalibracyjny i skalibruj zewnętrzną średnicę naczynia, aby zmiany średnicy tętnicy były dokładnie rejestrowane w mikronach. Dostosuj kontrast w razie potrzeby, aby uzyskać dobry widok zamocowanego odcinka na tle. Szczegółowy opis obsługi oprogramowania znajduje się w instrukcji użytkownika od DMT.
8. Stopniowo podnoś strzykawkę 10 ml (pełniącą rolę kolumny ciśnienia zasilanej grawitacyjnie) w czasie 15 min, aż przetwornik ciśnienia P1 wskaże 80 mmHg. Podczas podnoszenia kolumny ciśnienia sprawdź, czy naczynie nie przecieka. W przypadku wycieków odrzuć odcinek i zamocuj inny odcinek tętnicy (powtórz kroki od 5.2). W razie potrzeby dostosuj odległość między kaniulami. Odległość powinna być dostosowana w taki sposób, aby podciśnieniowy odcinek tętnicy był w przybliżeniu prosty (ale nie naciągnięty) i tworzył wzór przypominający bark w miejscach zawiązań (Rysunek 4A).
9. Włącz ogrzewanie komory myografu ciśnieniowego za pomocą sterowników w systemie myo-interface. Pozostaw roztwór kąpielowy do stopniowego ogrzania, aż osiągnie temperaturę 36-37 °C.
10. W razie potrzeby korzystaj z regulacji XYZ obiektywu w mikroskopie DMT, aby utrzymać naczynie w ostrości i ułatwić dokładne śledzenie zmian zewnętrznej średnicy naczynia.
11. Sprawdź żywotność zamocowanego naczynia poprzez krótkotrwałą superfuzję (~30 s) roztworem 60 mM KCl. Żywe naczynie szybko kurczy się po dodaniu KCl i natychmiast rozszerza po wypłukaniu 60 mM KCl (przepłucz około 60 ml roztworu kąpielowego, aby wypłukać KCl). Po tym teście ponownie dostosuj objętość roztworu kąpielowego do dokładnie 10 ml. Temperatura kąpieli obniża się podczas testu KCl i wypłukiwania, ponieważ roztwory te są w temperaturze pokojowej, ale grzałka komory przywróci temperaturę do 36-37 °C w ciągu kilku minut.
12. Pozostaw tętnicę do equilibracji przez co najmniej 30 min (średnica powinna być stabilna przez co najmniej ostatnie 10 min tego okresu). Dodaj stężoną substancję testową bezpośrednio do roztworu kąpielowego i delikatnie pipetuj w górę i w dół przy krawędziach komory, aby wymieszać substancję testową w roztworze kąpielowym, uzyskując odpowiednie stężenie końcowe w 10 ml objętości komory. Zmiany średnicy naczynia po dodaniu substancji testowej można monitorować na obrazie wideo w czasie rzeczywistym oraz nanosić na wykres w oknie analizy obrazu w trakcie trwania eksperymentu.
13. Po zakończeniu eksperymentu zapisany plik danych (*.myo) można otworzyć jako plik arkusza kalkulacyjnego do dalszej analizy.

6. Reprezentatywne wyniki

Wyniki przedstawione na Rysunku 3 obrazują typowe zapisy prądów Kv7 z miocytów tętnicy krezkowej z wykorzystaniem protokołu skoków napięcia przed (Rysunek 3A,B ślady czarne) oraz w trakcie podawania aktywatora kanałów Kv7, pirytionu cynku (ZnPyr, 100 nM; Rysunek 3A,B ślady czerwone). Podobne dane ze skoków napięcia z 3 komórek zostały uśrednione w celu przygotowania wykresów zależności natężenia prądu od napięcia (I-V) przedstawionych na Rysunku 3D. Reprezentatywny przebieg czasowy zwiększenia amplitudy prądu (mierzonej przy ciągłym zaciskaniu napięcia na poziomie -20 mV) podczas podawania 100 nM pirytionu cynku pokazano na Rysunku 3C. Rysunek 4B ilustruje przebieg czasowy wpływu ZnPyr na zewnętrzną średnicę tętnicy krezkowej mierzoną za pomocą myografii ciśnieniowej; naczynie zostało uprzednio skurczone za pomocą 100 pM argyniny wazopresyny (AVP) przed dodaniem 100 nM ZnPyr. Uśrednione dane zależności dawka-odpowiedź dla rozszerzenia tętnicy krezkowej indukowanego przez ZnPyr przedstawiono na Rysunku 4C.

Rysunek 1. Zdjęcie łuku krezkowy w komorze sekcyjnej.

Rycina 2. Zdjęcie miocytu z pipetą do patch-clampy na jego powierzchni.

Rycina 3. Oryginalne zapisy prądów Kv7, przebieg czasowy aplikacji leków, krzywe I-V. A. Rodzina sekwencyjnych zapisów prądowych (dolny panel) zarejestrowanych w odpowiedzi na skoki napięcia (górny panel) przed traktowaniem (kontrola, kolor czarny) oraz po stabilizacji w obecności 100 nM ZnPyr (kolor czerwony) w pojedynczej komórce MASMC. B. Reprezentatywne zapisy prądowe z punktu A (wskazane grotami strzałek) dla kontroli (kolor czarny) i dla 100 nM ZnPyr (kolor czerwony). Szare paski wskazują przedział czasowy, w którym mierzono średnie amplitudy prądu do wykresów prądowo-napięciowych (I-V). Napięcia skokowe są wskazane po prawej stronie grotami strzałek. C. Przebieg czasowy wzmocnienia prądu Kv7 przez 100 nM ZnPyr, mierzony przy ciągłym clampowaniu napięcia na poziomie -20 mV (pasek). D. Średnie krzywe I-V (n=3) wyprowadzone z gęstości prądu Kv7 zarejestrowanych przed (kontrola, wypełnione koła), podczas traktowania 100 nM ZnPyr (otwarte koła) oraz podczas traktowania 10 μM XE991 (wypełnione trójkąty). Niespecyficzne prądy przecieku zostały odjęte zgodnie z opisem Passmore et al. ¹.

Rysunek 4. Rozkurcz wywołany ZnPyr w tętnicy krezkowej uprzednio skurczonej 100 pM AVP. A. Zdjęcie tętnicy krezkowej zamocowanej w układzie myografu ciśnieniowego. B. Przebieg czasowy zmian średnicy zewnętrznej naczynia w odpowiedzi na podanie 100 pM AVP (pusty słupek), a następnie podanie 100 nM ZnPyr (wypełniony słupek). C. Wykres słupkowy podsumowujący wyniki rozszerzenia naczyń wywołanego przez 100 nM ZnPyr.

Dyskusja

Opisane tutaj metody i podejścia eksperymentalne są dość stabilne i mogą przynieść przejrzyste oraz powtarzalne wyniki, jeśli zostaną zastosowane z pieczołowitą dbałością o szczegóły. Jakość zapisów elektrofizjologicznych oraz skurczu/rozkurczu segmentów tętnic zależy odpowiednio od stanu zdrowotnego komórek i fragmentów tętnic. Preparaty komórkowe mogą różnić się z dnia na dzień, nawet przy zastosowaniu tego samego protokołu. Roztwory do izolacji można stosować przez maksymalnie 2 tygodnie, jednak jeśli przez dwa kolejn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu	Sigma	S5886	Roztwór do dyssekcji: 145 Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 140 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 10 Roztwór do izolacji miocytów*: 140 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 145 Roztwór do światła naczynia do mikrografii ciśnieniowej: 145
Chlorek potasu	Sigma	P5405	Roztwór do preparowania: 4,7 Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 5,36 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 135 Roztwór do izolacji miocytów*: 5,36 Roztwór kąpielowy do miografii ciśnieniowej: 4,7 Roztwór do lumenu w mikrografii ciśnieniowej: 4,7
EGTA potas	Sigma	E4378	Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 0,05
HEPES	Sigma	H9136	Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 10 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 10 Roztwór do izolacji miocytów*: 10
Wodorofosforan sodu	Sigma	S5136	Roztwór do izolacji miocytów*: 0,34
Wodorofosforan potasu	Sigma	P5655	Roztwór do izolacji miocytów*: 0,44
chlorek magnezu	Sigma	M2393	Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 1,2 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 1 Roztwór do izolacji miocytów*: 1,2
Chlorek wapnia	Sigma	C7902	Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 2 Roztwór do izolacji miocytów*: 0,05
Fosforan sodu	Fisher Scientific	BP331-1	Roztwór do preparowania: 1,2 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 1,2 Roztwór do światła naczynia do myografii ciśnieniowej: 1,2
Siarczan magnezu	Sigma	M2643	Roztwór do dyssekcji: 1,17 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 1,17 Roztwór do światła naczynia do mikromanometrii ciśnieniowej: 1,17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Roztwór do dysekcji: 3 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 3 Roztwór do światła naczynia do miografii ciśnieniowej: 3
Kwas pirogronowy	Sigma	P4562	Roztwór do dyssekcji: 2 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 2 Roztwór do światła naczynia do myografii ciśnieniowej: 2
dwuwodny EDTA	Research Organics	9572E	Roztwór do dyssekcji: 0,02 Roztwór kąpielowy do miografii ciśnieniowej: 0,02 Roztwór do światła naczynia do miografii ciśnieniowej: 0,02
D-glukoza	Sigma	G7021	Roztwór do dyssekcji: 5 Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 10 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 20 Roztwór do izolacji miocytów*: 10 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 5 Roztwór do światła naczynia do miografii ciśnieniowej: 5
Albumin surowicy bydlęcej	Sigma	A3912	Roztwór do dyssekcji: 1% Roztwór do światła naczynia do miografii ciśnieniowej: 1%
pH			Roztwór do sekcji: 7,4 Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 7,3 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 7,2 Roztwór do izolacji miocytów*: 7,2 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 7,4 Roztwór do światła naczynia do miografii ciśnieniowej: 7,4
Osmolarność			Roztwór do sekcji: 300 Roztwór kąpielowy do elektrofizjologii*: 298 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 298 Roztwór do izolacji miocytów*: 298 Roztwór kąpielowy do myografii ciśnieniowej: 300 Roztwór do lumenu w myografii ciśnieniowej: 300
*11
Tabela 1. Składniki roztworów wykorzystanych w doświadczeniu.