Badanie funkcji kanału potasowego Kv7 mięśni gładkich tętnic za pomocą elektrofizjologii zacisku krosowego i miografii ciśnieniowej

Summary

Pomiary aktywności kanału potasowego Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych z zaciskiem łatkowym) równolegle z pomiarami odpowiedzi zwężających/rozszerzających (przy użyciu miografii ciśnieniowej) mogą ujawnić ważne informacje na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Abstract

Skurcz lub rozluźnienie komórek mięśni gładkich w ścianach tętnic oporowych określa średnicę tętnicy, a tym samym kontroluje przepływ krwi przez naczynie i przyczynia się do ogólnoustrojowego ciśnienia krwi. Proces skurczu jest regulowany przede wszystkim przez stężenie wapnia cytozolowego ([Ca²⁺]_cyt), które z kolei jest kontrolowane przez różne transportery i kanały jonowe. Kanały jonowe są powszechnymi produktami pośrednimi w szlakach transdukcji sygnału aktywowanych przez hormony wazoaktywne w celu zwężenia lub rozszerzenia naczyń krwionośnych. Kanały jonowe są często atakowane przez środki terapeutyczne celowo (np. blokery kanału wapniowego stosowane w celu wywołania rozszerzenia naczyń krwionośnych i obniżenia ciśnienia krwi), lub nieumyślnie (np. w celu wywołania niepożądanych skutków ubocznych ze strony układu krążenia).

Kv7 (KCNQ) aktywowane napięciem kanały potasowe zostały ostatnio uznane za ważne fizjologiczne i terapeutyczne cele regulacji skurczu mięśni gładkich. Aby wyjaśnić specyficzną rolę kanałów Kv7 zarówno w fizjologicznej transdukcji sygnału, jak i w działaniu środków terapeutycznych, musimy zbadać, w jaki sposób ich aktywność jest modulowana na poziomie komórkowym, a także ocenić ich udział w kontekście nienaruszonej tętnicy.

Tętnice krezkowe szczurów stanowią użyteczny system modelowy. Tętnice można łatwo wypreparować, oczyścić z tkanki łącznej i wykorzystać do przygotowania izolowanych miocytów tętniczych do elektrofizjologii klamry lub kaniulować i zwiększać ciśnienie w celu pomiarów odpowiedzi zwężających naczynia krwionośne / rozszerzających naczynia krwionośne w stosunkowo fizjologicznych warunkach. W tym miejscu opisujemy metody stosowane do obu typów pomiarów i podajemy kilka przykładów, w jaki sposób można zintegrować projekt eksperymentalny, aby zapewnić lepsze zrozumienie ról tych kanałów jonowych w regulacji napięcia naczyniowego.

Protocol

1. Chirurgiczne wycięcie arkady naczyniowej krezki jelita cienkiego

1. Znieczulić szczura Sprague-Dawley 300-400 g izofluranem (4%) podawanym wziewnie.
2. Wykonaj laparotomię w linii środkowej, aby odsłonić krezkę jelita cienkiego. Zewnętrznie wyegzekwuj jelito cienkie i grube przez nacięcie brzucha z dużą ostrożnością, aby uniknąć urazu odsłoniętego jelita i krezki. Delikatnie wachluj krezkę na sterylnej gazie.
3. Chirurgicznie wyciąć jelito cienkie i część jelita grubego, w tym kątnicę (naczynia krwionośne ostrożnie przecięte wzdłuż brzegów i u źródeł od pierwotnych gałęzi tętnicy/żyły krezkowej górnej).
4. Przenieść wyciętą tkankę do zlewki zawierającej lodowaty roztwór preparacyjny (Tabela 1).
5. Po wycięciu jelita szczur powinien zostać humanitarnie poddany eutanazji w znieczuleniu.

2. Preparowanie i oczyszczanie tętnic

1. Przenieść wycięte jelito i arkadę krezkową do schłodzonej komory preparacyjnej (4-5 °C) zawierającej roztwór preparacyjny. Komora składa się z szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm z podstawą z elastomeru SYLGARD 184 do umieszczenia szpilek preparacyjnych; szalkę Petriego umieszcza się w schłodzonej podstawie, która jest utrzymywana w temperaturze 4-5 °C przez cyrkulacyjną łaźnię wodną.
2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wytnij około 10-12 cm odcinek z całego jelita. Przeciąć na każdym końcu odcinka jelita, utrzymując jego układ naczyniowy przyczepiony, a następnie usunąć niewykorzystane jelito z komory, pozostawiając jeden segment z przyczepionym naczyniem (arkada krezkowa) w izolacji.
3. Przypnij odcinek jelita cienkiego, rozsuwając krezkę na bliższą stronę komory tak, aby pierwotna gałąź tętnicy/żyły krezkowej górnej znajdowała się w środku, a kolejne rzędy gałęzi rozchodziły się promieniście od środka (ryc. 1). Szpilki należy umieszczać tylko na segmentach jelita (nie na naczyniach krwionośnych).
4. Odróżnij tętnice od żył po ich stosunkowo jaskrawoczerwonym kolorze, grubych ścianach i charakterystycznych gałęziach w kształcie litery V, a nie gałęziach w kształcie litery U widocznych w żyłach.
5. Wizualizując przez oświetlony mikroskop preparacyjny, ostrożnie oczyść tkankę tłuszczową i tkankę łączną otaczającą tętnice 2-4 rzędu w pobliżu jelit (przerywane kółko na rycinie 1) za pomocą mikrokleszczy i nożyczek. Trzymanie sąsiednich żył ułatwia oczyszczanie tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej. Unikaj niepotrzebnego rozciągania tętnic.
6. Odcinki tętnicy krezkowej oczyszczone z tkanki łącznej można następnie wypreparować i wykorzystać do izolacji komórek (w przypadku badań klamrowych jednokomórkowych, sekcje 3-4) lub kaniulować do miografii ciśnieniowej (sekcja 5). Wytnij segmenty między punktami gałęzi, zwykle do 1 cm długości.

3. Izolacja komórek do badań z użyciem zacisków krosowych

1. Przygotuj 0,5 l roztworu izolacyjnego (Tabela 1) i podziel go na 2 porcje przed dostosowaniem pH. Pierwszą porcję (zwykle 100 ml) należy podgrzać do temperatury 37 °C i doprowadzić pH do 7,2 w temperaturze 37 °C (roztwór izolacyjny o temperaturze 37 °C). Drugą porcję roztworu izolacyjnego należy schłodzić do temperatury 4 °C, a pH należy dostosować do 7,2 w temperaturze 4 °C (roztwór izolacyjny z lodowatym zimnem). Po dostosowaniu pH, osmolarność obu roztworów należy dostosować do 298 mOsm poprzez dodanie odpowiedniej ilości D-glukozy lub_H2O.
2. Przenieść 2 ml roztworu izolacyjnego o temperaturze 37 °C do szklanej fiolki i inkubować w temperaturze 37 °C do użycia w kroku 3.4. Dodać 20 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 10 ml roztworu izolacyjnego o temperaturze 37 °C, rozpuścić, ponownie ogrzać do 37 °C i ponownie ustawić pH do 7,2. Do 2 ml tego roztworu dodać 4 mg kolagenazy typu VIII (Sigma, partia 089K8612: 633 jednostki/mg aktywności kolagenazy, 285 jednostek/mg aktywności kazeiny, 1,6 jednostki/mg aktywności klostripainy), 0,64 mg elastazy typu IV (Sigma, partia 110M7025V 5,9 jednostki/mg; dodać 40 μl 16 mg/ml podstawowego roztworu przygotowanego w 37 °C roztworu izolacyjnego) i 2 μl 1 M DL-ditiotreitolu (DTT Sigma); podgrzej ten roztwór enzymatyczny do temperatury 37 °C, przygotowując się do kroku 3.5.
3. Przenieść 2-3 segmenty tętnicy krezkowej do 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 2 ml lodowatego roztworu izolacyjnego i umieścić naczynie na lodzie. Pokrój segmenty tętnicy krezkowej na kawałki o długości 3-4 mm.
4. Za pomocą pipety Pasteura z wypolerowaną ogniowo końcówką (w celu zapobieżenia uszkodzeniu tętnic) przenieść segmenty tętnic do szklanej fiolki (15 x 45 mm, 1 dram) zawierającej 2 ml wstępnie ogrzanego roztworu izolacyjnego o temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
5. Po 30 minutach ostrożnie odessać roztwór izolacyjny o temperaturze 37 °C za pomocą pipety Pasteura, dodać 2 ml ciepłego roztworu enzymatycznego i inkubować przez 35 minut w temperaturze 37 °C.
6. Natychmiast po 35-minutowej inkubacji w roztworze enzymatycznym umieścić fiolkę na lodzie, odessać roztwór enzymu i dodać 2 ml lodowatego roztworu izolacyjnego (powtórzyć aspirację i dodać 4 razy świeży lodowaty roztwór izolacyjny). Następnie, w objętości 1 ml lodowatego roztworu izolacyjnego, delikatnie rozcierać odcinki tętnicy za pomocą polerowanej pipety Pasteura 10-20 razy, aby uwolnić pojedyncze komórki mięśni gładkich tętnicy krezkowej (MASMC).
7. Okresowo sprawdzaj wygląd miocytów, umieszczając kroplę zawiesiny komórek na 35-milimetrowej szalce i oglądając pod mikroskopem. Zdrowe MASMC powinny mieć gładki, wydłużony wygląd. Nie wszystkie komórki w ścianie tętnicy zostaną uwolnione. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.
8. Innym użytecznym wskaźnikiem zdrowia MASMC jest ich tolerancja na fizjologiczne stężenia Ca²⁺. Napełnij komorę zapisu (Bioscience Tools, #CSC-25L) roztworem do kąpieli zawierającym 2 mM CaCl₂ (pH 7,3 w temperaturze pokojowej (RT), skład patrz Tabela 1) i umieść mostek agarowy (wygięta szklana kapilara wypełniona 2% agarem w 2 M KCl, włożony do elektrody odniesienia (Warner Instrument, REF-3L)) wewnątrz komory. Za pomocą wypolerowanej pipety Pasteura przenieś około 100-200 μl zawiesiny komórek do komory rejestracyjnej i pozwól komórkom przylegać przez 15 minut. Nieuszkodzone komórki nie powinny się znacząco kurczyć w roztworze zawierającym 2 mM CaCl₂ (komórki powinny wydawać się wydłużone lub w kształcie pręcika, a nie zaokrąglone w kulki).
9. Po dodaniu pierwszej podwielokrotności zawiesiny komórek do komory rejestracyjnej, do pozostałej objętości zawiesiny komórek należy dodać 0,25 ml roztworu kąpieli zawierającego 2 mM CaCl₂. Ta pozostała zawiesina komórek może być utrzymywana w tym roztworze na lodzie i używana do nagrywania klamrą krosową przez okres do 6 godzin.

4. Użycie zacisku krosowego całego ogniwa do pomiaru prądów potasu Kv7 lub napięcia membrany

1. Po tym, jak miocyty przylegają do szklanej podstawy komory zapisowej (okrągłe szkiełko nakrywkowe nr 1 o średnicy 25 mm, Warner Instruments), należy rozpocząć ciągłą perfuzję roztworu kąpieli (Tabela 1). W celu rejestracji prądów Kv7 w izolacji od opóźnionych prądów potasowych prostownika z rodziny Kv1 i Kv2, roztwór kąpieli należy uzupełnić 100 μM GdCl₃.
2. Wykonać pipetę punktową ze szkła borokrzemianowego (Kimax-51, Kimble Chase) za pomocą ściągacza do pipet i mikrokuźni; jej rezystancja powinna wynosić 4-5 MΩ po napełnieniu roztworem wewnętrznym (Tabela 1). Pokryj dolną ¹/₃ pipety (~1-2 mm nad końcówką) środkiem SYLGARD 184.
3. Do rejestrowania prądów Kv7 w MASMC należy stosować technikę zacisku napięcia z perforowaną łatą krosową. Zastosowanie konfiguracji perforowanej łaty pomaga zapobiec wyczerpaniu 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie (₂) i późniejszemu szybkiemu (w ciągu 5 minut) wyczerpaniu prądów Kv7, co jest powszechnie obserwowane przy użyciu konwencjonalnej konfiguracji pękniętej łaty. Uzupełnić roztwór wewnętrzny (Tabela 1) 120 μg/ml amfoterycyny B: dodać 3 μl 2 mg/ml zapasu amfoterycyny B (przygotowanej w DMSO i przechowywanej w stanie zamrożonym w małych porcjach i chronionej przed światłem) do 0,5 ml roztworu wewnętrznego. Napełnić końcówkę pipety plastrowej roztworem wewnętrznym wolnym od amfoterycyny B, zanurzając końcówkę pipety w roztworze wewnętrznym wolnym od amfoterycyny B, a następnie odsysając na drugim końcu za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przymocowanej za pomocą rurki (Tygon R-3603). Dodać roztwór pipety zawierający amfoterycynę B od góry za pomocą końcówki do pipet Eppendorf Microloader, aż pipeta będzie wypełniona roztworem w około połowie. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie stukając w pipetę. Pipetę należy natychmiast zużyć.
4. Włóż pipetę do uchwytu elektrody i za pomocą mikromanipulatora opuść pipetę na powierzchnię wydłużonego miocytu (blisko, ale nie na górze jądra, ryc. 2). Gdy rezystancja w pipecie wzrośnie do 6-10 MΩ, zastosuj ssanie, aby uzyskać giga-uszczelnienie (>10 GΩ).
5. Ustaw napięcie podtrzymania na 0 mV w oczekiwaniu na perforację membrany. Zastosuj kroki napięcia 100 ms do +10 mV, a następnie do -10 mV i użyj wzmacniacza do kompensacji stanów przejściowych pojemności pipet. Równolegle z pojawieniem się stanów przejściowych o pojemności całego ogniwa, małe trwałe prądy dodatnie (zwykle 2-10 pA) będą wskazywać na obecność funkcjonalnych kanałów Kv7.
6. Udana perforacja amfoterycyną B zmniejszy opór dostępu do 35 MΩ lub mniej. Zapis prądu można następnie zainicjować za pomocą 5-sekundowego protokołu kroku napięcia od -4 mV napięcia podtrzymania. Używamy napięcia podtrzymania -4 mV, aby osiągnąć prawie maksymalną inaktywację innych typów opóźnionych prądów potasowych prostownika (za pośrednictwem głównie kanałów Kv1 i Kv2), które w przeciwnym razie zanieczyściłyby zapis stosunkowo małych, niedezaktywujących prądów Kv7. Protokół długiego (5 sekund) kroku napięciowego jest niezbędny do osiągnięcia aktywacji w stanie ustalonym kanałów Kv7, które wykazują powolną aktywację i dezaktywację zależną od napięcia. Prądy Kv7 nie dezaktywują się podczas utrzymujących się kroków napięcia.
7. Aby zarejestrować zależność prąd-napięcie Kv7 (I-V), należy zastosować 5-sekundowe kroki napięcia do napięć w zakresie od -84 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów Kv7 jest minimalne, do +16 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów Kv7 osiąga plateau; po 5 sekundach przy każdym napięciu testowym cofnij się do napięcia podtrzymania (-4 mV) na 10 sekund. Pełna seria impulsów testowych zajmie około 3,5 minuty (rysunek 3A). Wykonaj 2-3 kontrolne nagrania I-V, aby upewnić się, że zarejestrowane prądy są stabilne w czasie. Wykreśl średnie końcowe prądy impulsowe (średnie prądy zarejestrowane w ciągu ostatniej 1 sekundy) w funkcji napięcia, aby utworzyć krzywą I-V (rysunek 3D). Krzywe kontrolne I-V powinny być w przybliżeniu nałożone na siebie, jeśli prądy są stabilne.
8. Przed zastosowaniem jakichkolwiek środków farmakologicznych należy zainicjować protokół czasowy, który ma na celu ciągłe rejestrowanie prądu o napięciu -20 mV. Zapewnić stabilny zapis prądu przez co najmniej 5 minut przed zastosowaniem leku. Stosować środki farmakologiczne przez 5-15 minut lub do momentu osiągnięcia stanu ustalonego (ryc. 3C); następnie zakończ protokół przebiegu czasu i zapisz dwie krzywe I-V za pomocą protokołu krokowego napięcia. Wypłucz lek i zapisz przebieg czasowy wypłukiwania leku, a następnie zarejestruj dwie dodatkowe krzywe I-V.
9. Na zakończenie eksperymentu należy zastosować 10 μM linopirydyny lub 10 μM XE991, nieodwracalne inhibitory kanałów Kv7; leki te powinny całkowicie hamować prądy rejestrowane przy napięciach ujemnych do -20 mV (ryc. 3D).
10. Po każdym eksperymencie umyj komorę i system perfuzyjny detergentem, etanolem i gorącą wodą, aby usunąć wszelkie ślady użytych leków.

5. Wykorzystanie nienaruszonych odcinków tętnic do miografii ciśnieniowej

1. Do eksperymentu z miografią ciśnieniową wykorzystano system miografu ciśnieniowego zakupiony od Danish Myo Technology (DMT A/S, Dania, model 110P). Zamontuj segment tętnicy w komorze ze stali nierdzewnej, wkładając poziomo zamocowaną lewą szklaną kaniulę do jednego końca, a ruchomą prawą szklaną kaniulę do drugiego końca. Dwa przetworniki ciśnienia (P1 po prawej stronie i P2 po lewej stronie) są wbudowane w celu monitorowania ciśnienia w świetle tętnicy. Płyn z prawej szklanej kaniuli zostanie wykorzystany do dostosowania ciśnienia wewnątrz tętnicy do jej przybliżonego poziomu fizjologicznego. Aby rozpocząć, należy wstępnie napełnić otwartą strzykawkę o pojemności 10 ml (służącą jako kolumna ciśnieniowa zasilana grawitacyjnie) roztworem świetlnym (Tabela 1). Podnieś strzykawkę, aby wepchnąć roztwór przez rurkę polietylenową do prawej szklanej kaniuli, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w rurce lub kaniuli. Lewą kaniulę należy wstępnie napełnić roztworem światła za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Napełnić komorę miografu ciśnieniowego 10 ml roztworu do kąpieli w naczyniu (tabela 1). Luźno zawieś dwa gotowe cienkie nylonowe szwy z każdej strony przylegające do szklanych kaniuli.
2. Ostrożnie przenieś wypreparowany odcinek tętnicy krezkowej (zwykle segment 3. lub 4. rzędu o średnicy około 200 - 350 μm; od kroku 2.6) z komory preparacyjnej do komory miografu ciśnieniowego, przytrzymując jeden koniec segmentu za pomocą mikrokleszczyków.
3. Wizualizując przez oświetlony mikroskop preparacyjny, przytrzymaj jeden koniec odcinka tętnicy i delikatnie nasuń go na lewą szklaną kaniulę i zabezpiecz koniec za pomocą nylonowych szwów. Delikatnie przepłucz płyn świetlny przez zamontowane naczynie, aby usunąć krew i zanieczyszczenia z naczynia. Zawór lewej strzykawki powinien być następnie zamknięty tak, aby po tej stronie znajdowała się statyczna kolumna płynu, do której ciśnienie jest regulowane z prawej strony.
4. Za pomocą mikromanipulatora umieść ruchomą prawą szklaną kaniulę bliżej odcinka tętnicy i przeciągnij nad nią prawy koniec segmentu, ostatecznie zabezpieczając go nylonowymi szwami. Odetnij nadmiar nici szwowych.
5. Zamontuj miograf ciśnieniowy na stoliku nad mikroskopem miografu ciśnieniowego. Umieść pokrywę nad komorą miografu ciśnieniowego. W pokrywie komory znajduje się wlot superfuzji i przymocowana do niej rura ssąca. Podłączyć wlot przefuzji do kolektora, aby umożliwić grawitacyjne przemieszanie kąpieli w temperaturze pokojowej lub 60 mM roztworu KCl do komory miografu ciśnieniowego. Substancje badane, takie jak leki lub hormony, które znajdują się w pomiarach zacisku łatowego w celu wpływu na funkcję kanału Kv7, są na ogół stosowane bezpośrednio do roztworu kąpieli, a nie przez superfuzję w kąpieli lub w roztworze świetlnym. Superfuzja roztworu do kąpieli zostanie wykorzystana do wypłukania roztworu KCl. Podłącz rurę ssącą do systemu próżniowego, aby usunąć nadmiar nadbezpiecznika. Włóż czujnik temperatury do roztworu kąpieli przez otwór znajdujący się w pokrywie komory miografu.
6. Podłącz moduł miografu ciśnieniowego do systemu myo-interface, sprzętu, który umożliwia komunikację modułu miografu z oprogramowaniem myoview (DMT).
7. Otwórz oprogramowanie myoview w komputerze. W oknie parametrów ustaw temperaturę docelową na 35 °C z tolerancją temperatury 1 °C, docelowe ciśnienie dopływu na 80 mmHg i docelowe ciśnienie wypływu na 80 mmHg. Załaduj plik kalibracyjny i skalibruj zewnętrzną średnicę naczynia tak, aby zmiany średnicy tętnicy były rejestrowane dokładnie w mikronach. W razie potrzeby dostosuj kontrast, aby zapewnić dobry widok zamontowanego segmentu na tle. Szczegółowy opis sposobu korzystania z oprogramowania znajduje się w instrukcji obsługi firmy DMT.
8. Stopniowo podnosić strzykawkę o pojemności 10 ml (służącą jako kolumna ciśnieniowa zasilana grawitacyjnie) przez okres 15 minut, aż przetwornik ciśnienia P1 wskaże 80 mmHg. Podnosząc kolumnę ciśnieniową, sprawdź, czy w naczyniu nie ma wycieków. Jeśli występują jakiekolwiek nieszczelności, wyrzuć segment i zamontuj inny odcinek tętnicy (powtórz kroki z 5.2). W razie potrzeby dostosuj odległość między kaniulami. Odległość powinna być wyregulowana w taki sposób, aby odcinek tętnicy pod ciśnieniem był w przybliżeniu prosty (ale nie rozciągnięty) i tworzył wzór podobny do barku, w którym wykonane są wiązania (ryc. 4A).
9. Włącz ogrzewanie komory miografu ciśnieniowego za pomocą elementów sterujących w systemie myo-interface. Pozostawić roztwór do kąpieli do stopniowego nagrzewania się, aż osiągnie temperaturę 36-37 °C.
10. W razie potrzeby należy użyć regulacji XYZ obiektywu w mikroskopie DMT, aby utrzymać ostrość naczynia i ułatwić dokładne śledzenie zmian zewnętrznej średnicy naczynia.
11. Sprawdź żywotność zamontowanego naczynia przez przejściowe superfuzję (~30 sekund) z 60 mM KCl. Żywe naczynie szybko zwęża się po dodaniu KCl i rozszerza się natychmiast po wypłukaniu 60 mM KCl (przelać około 60 ml roztworu do kąpieli, aby wypłukać KCl). Po tym teście należy ponownie dostosować objętość roztworu do kąpieli dokładnie do 10 ml. Temperatura kąpieli jest obniżana podczas testu KCl i wymłukiwania, ponieważ roztwory te mają temperaturę pokojową, ale grzałka komory przywróci temperaturę do 36-37 °C w ciągu kilku minut.
12. Pozwól tętnicy wyrównać się przez co najmniej 30 minut (średnica powinna być stabilna przez co najmniej ostatnie 10 minut tego okresu). Dodać stężoną substancję badaną bezpośrednio do roztworu do kąpieli i delikatnie pipetować tam i z powrotem w pobliżu krawędzi komory, aby wymieszać substancję badaną w roztworze kąpieli, uzyskując odpowiednie stężenie końcowe w objętości komory 10 ml. Zmiany średnicy naczynia po dodaniu substancji badanej (substancji badanych) mogą być monitorowane na obrazie wideo na żywo, a także przedstawiane na wykresach w oknie analizy obrazu podczas trwania eksperymentu.
13. Po zakończeniu eksperymentu zapisany plik danych (*.myo) można otworzyć jako plik arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

6. Reprezentatywne wyniki

Wyniki pokazane na rysunku 3 ilustrują typowe zapisy prądów Kv7 z miocytów tętnicy krezkowej przy użyciu protokołu kroku napięcia przed (Rysunek 3A,B czarne ślady) i podczas leczenia aktywatorem kanału Kv7 Zn pirytionianem (ZnPyr, 100 nM; Rysunek 3A,B czerwone ślady). Podobne dane kroku napięcia z 3 ogniw uśredniono w celu przygotowania wykresów prąd-napięcie (I-V) pokazanych na rysunku 3D. Reprezentatywny przebieg czasowy zwiększania amplitudy prądu (mierzonej za pomocą ciągłych cęgów napięciowych przy -20 mV) podczas leczenia pirytionianem 100 nM Zn przedstawiono na rysunku 3C. Rysunek 4B ilustruje przebieg w czasie wpływu ZnPyr na zewnętrzną średnicę tętnicy krezkowej mierzoną za pomocą miografii ciśnieniowej; naczynie zostało wstępnie zwężone wazopresyną argininy (AVP) o stężeniu 100 pM przed dodaniem 100 nM ZnPyr. Uśrednione dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź dla rozszerzenia tętnicy krezkowej wywołanego ZnPyr przedstawiono na rycinie 4C.

Rysunek 1. Zdjęcie arkady krezkowej w prosektorium.

Rysunek 2. Zdjęcie miocytu z pipetą plastrową na jego powierzchni.

Rysunek 3. Oryginalne ślady prądów Kv7, przebieg czasowy stosowania leków, krzywe I-V. A. Rodzina sekwencyjnych ścieżek prądowych (dolny panel) zarejestrowanych w odpowiedzi na kroki napięcia (górny panel) przed obróbką (kontrola,) i po stabilizacji w obecności 100 nM ZnPyr (czerwony) w pojedynczym MASMC. B. Reprezentatywne ścieżki prądowe od A (oznaczone grotami strzałek) dla sterowania () i dla 100 nM ZnPyr (czerwony). Szare paski wskazują przedział czasu, w którym zmierzono uśrednione amplitudy prądu dla wykresów prąd-napięcie (I-V). Napięcia krokowe są oznaczone po prawej stronie grotami strzałek. C. Przebieg czasowy wzmocnienia prądu Kv7 o 100 nM ZnPyr mierzony przy ciągłych cęgach napięciowych przy -20 mV (bar). D. Średnie krzywe I-V (n = 3) uzyskane z gęstości prądu Kv7 zarejestrowanych przed (kontrola, wypełnione okręgi), podczas leczenia 100 nM ZnPyr (otwarte okręgi) i podczas leczenia 10 μM XE991 (wypełnione trójkąty). Niespecyficzne prądy upływowe zostały odjęte zgodnie z opisem Passmore i wsp. ¹.

Rysunek 4. ZnPyr indukował rozluźnienie tętnicy krezkowej wstępnie zwężonej 100 pM AVP. A. Fotografia tętnicy krezkowej zamontowanej w ustawieniu miografu ciśnieniowego. B. Przebieg w czasie zmian średnicy zewnętrznej naczynia w odpowiedzi na zastosowanie 100 pM AVP (pręt otwarty), a następnie zastosowanie 100 nM ZnPyr (pręt napełniony). C. Wykres słupkowy podsumowujący wyniki naczyń krwionośnych indukowanych 100 nM ZnPyr.

Discussion

Opisane tutaj metody i podejścia eksperymentalne są dość solidne i mogą dać jasne i powtarzalne wyniki, jeśli są stosowane z drobiazgową dbałością o szczegóły. Dobre zapisy elektrofizjologiczne i zwężenie/rozszerzenie odcinków tętniczych zależą odpowiednio od stanu zdrowia komórek i odcinków tętnic. Preparaty komórkowe mogą się różnić z dnia na dzień, nawet przy użyciu tego samego protokołu. Roztwory izolacyjne mogą być stosowane przez okres do 2 tygodni, ale jeśli jakość przygotowania komórek jest niska przez dwa kolejn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek sodu	Sigma	S5886	Roztwór preparacyjny: 145 Roztwór do kąpieli do elektrofizjologii*: 140 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 10 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 140 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 145 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 145
Chlorek potasu	Sigma	P5405	Roztwór preparacyjny: 4,7 Roztwór do kąpieli do elektrofizjologii*: 5,36 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 135 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 5,36 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 4,7 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 4,7
Potas EGTA	Sigma	E4378	Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 0,05
HEPES	Sigma	H9136	Roztwór do kąpieli do elektrofizjologii*: 10 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 10 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 10
Wodorofosforan disodowy	Sigma	S5136	Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 0,34
Wodorofosforan potasu	Sigma	P5655	Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 0,44
Chlorek magnezu	Sigma	M2393	Roztwór do kąpieli w elektrofizjologii*: 1,2 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 1 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 1,2
Chlorek wapnia	Sigma	C7902	Roztwór do kąpieli w elektrofizjologii*: 2 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 0,05
Fosforan sodu	Fisher Scientific	BP331-1	Roztwór preparacyjny: 1,2 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 1,2 Roztwór światła do miografii ciśnieniowej: 1,2
Siarczan magnezu	Sigma	M2643	Roztwór preparacyjny: 1,17 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 1,17 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 1,17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Roztwór preparacyjny: 3 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 3 Roztwór światła do miografii ciśnieniowej: 3
Kwas pirogronowy	Sigma	P4562	Roztwór preparacyjny: 2 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 2 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 2
dihydrat EDTA	Research Organics	9572E	Roztwór preparacyjny: 0,02 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 0,02 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 0,02
D-Glucose	Sigma	G7021	Roztwór preparacyjny: 5 Roztwór do kąpieli do elektrofizjologii*: 10 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 20 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 10 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 5 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 5
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A3912	Roztwór preparacyjny: 1% Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 1%
pH			Roztwór preparacyjny: 7,4 Roztwór do kąpieli do elektrofizjologii*: 7,3 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 7,2 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 7,2 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 7.4 Roztwór świetlny do miografii ciśnieniowej: 7.4
osmolarności			: 300 Roztwór do kąpieli do elektrofizjologii*: 298 Roztwór wewnętrzny do elektrofizjologii: 298 Roztwór izolacyjny dla miocytów*: 298 Roztwór do kąpieli do miografii ciśnieniowej: 300 Roztwór światła do miografii ciśnieniowej: 300
*11
Tabela 1. Składniki roztworów użytych w eksperymencie.