Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Podsumowanie

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Streszczenie

Sztucznie wytworzone tkanki mięśniowe mogą być wykorzystywane w wielu różnych celach, w tym do produkcji tkanek służących jako modele chorób in vitro, np. do badania odleżyn, w medycynie regeneracyjnej oraz jako alternatywa dla mięsa ¹. Pierwsze raportowane trójwymiarowe konstrukty mięśniowe zostały stworzone wiele lat temu, a pionierami w tej dziedzinie byli Vandenburgh i współpracownicy ^2,3. Postępy w inżynierii tkankowej mięśni są nie tylko wynikiem ogromnego wzrostu wiedzy na temat czynników biochemicznych, komórek macierzystych i komórek progenitorowych, ale opierają się w szczególności na spostrzeżeniach badaczy, że czynniki fizyczne odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu zachowania komórek i rozwoju tkanek. Nowoczesne sztuczne konstrukty mięśniowe składają się obecnie z konstrukcji hydrożelowych zasiedlonych przez komórki. W naszym laboratorium składają się one zazwyczaj z mysich komórek progenitorowych mioblastów, wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy lub mysiej linii komórkowej mioblastów C2C12, zmieszanych z mieszaniną kolagenu/Matrigelu i wysianych między dwoma punktami kotwiczącymi, co naśladuje więzadła mięśniowe. Można rozważyć również inne komórki, np. alternatywne linie komórkowe, takie jak mioblasty szczura L6 ⁴, noworodkowe komórki progenitorowe pochodzenia mięśniowego ⁵, komórki pochodzące z tkanek mięśniowych osobników dorosłych innych gatunków, np. ludzkich ⁶, a nawet indukowane pluripotentne komórki macierzyste (komórki iPS) ⁷. Kurczliwość komórek powoduje ich wyrównanie wzdłuż długiej osi konstruktu ^8,9 oraz różnicowanie komórek progenitorowych mięśni po około jednym tygodniu hodowli. Ponadto zastosowanie stymulacji elektrycznej może w pewnym stopniu wspomóc proces różnicowania ⁸. Ze względu na ograniczony rozmiar (8 x 2 x 0,5 mm) całą tkankę można analizować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu monitorowania np. żywotności, różnicowania i wyrównania komórek. W zależności od konkretnego zastosowania wymagania wobec sztucznej tkanki mięśniowej będą się różnić; np. zastosowanie w medycynie regeneracyjnej wymaga zwiększenia rozmiaru tkanki i unaczynienia, natomiast w celu wykorzystania jako alternatywy dla mięsa konieczna jest translacja na inne gatunki.

Protokół

1. Hodowla progenitorowych komórek mioblastów mysich lub komórek C2C12

1. Wyizolować komórki zgodnie z protokołem pierwotnie opublikowanym przez Shefera i współpracowników ¹⁰, a następnie zaadaptowanym przez Collinsa et al. ¹¹ oraz Boonena et al. ¹², i przechowywać je w ciekłym azocie. Wymagane są myszy, np. C57Bl/6. W innych laboratoriach stosowane są alternatywne metody, np. metoda opublikowana w Journal of Visualized Experiments przez Li Y et al. ¹³. W kwestii odczynników i sprzętu należy zapoznać się z tabelą na stronach 7 i 8. Z mięśni jednej myszy zazwyczaj uzyskuje się wystarczającą liczbę komórek do krioarkiwizacji około 20 fiolek w ciekłym azocie. Następnie rozpoczynamy protokół rozmrażania komórek z przechowywania w ciekłym azocie.
2. Przenieść komórki z 1 fiolki do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm² powlekanej Matrigelem (1 mg/ml) i dodać medium wzrostowe (GM) składające się z (335 ml DMEM advanced, 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml L-glutaminy, 5 ml ekstraktu z zarodka kurczaka (CEE)).

Uwaga: inkubować przez 2 hr w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć Matrigel poprzez aspirację.

3. Przesiewaj komórki w stosunku około 1:3 co 3 dni.
   Oznacza to: w dniu 3. przenieś komórki z jednej kolby 25 cm² do kolby 75 cm²; w dniu 6. przenieś komórki z jednej kolby 75 cm² do dwóch kolb 150 cm² (z 30-minutowym wstępnym wysiewaniem do kolb niepowlekanych). W dniu 9. przenieś zawartość jednej kolby 150 cm² do jednej potrójnej kolby 150 cm² lub, jeśli taka jest niedostępna, do trzech kolb 150 cm² (w razie potrzeby ponownie zastosuj wstępny wysiew, zależnie od fenotypu komórek). W dniu 12. komórki są gotowe do wysiewu do konstrukcji mięśniowej.

Uwagi: - Na każdą potrójną płytkę 150 cm² liczba komórek wyniesie około 4,5 x 10⁶ komórek.
- W celu uzyskania mieszanej populacji komórek w momencie wysiewu, należy użyć fiolek z różnych izolacji i wymieszać je.

Uwaga: Jeśli zdecydują się Państwo nie pracować z komórkami pierwotnymi, dobrą alternatywą są mioblasty C2C12.

2. Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych

1. Przygotować klej silikonowy, mieszając „elastomer” z „utwardzaczem” (10:1). Wyciąć kwadratowe fragmenty rzepu o boku +/- 5 mm z jednym trójkątnym bokiem (kształt przypominający domek; Rysunek 1). Przykleić rzep do dołków płytki hodowlanej 6-dołkowej, zachowując odstęp około 12 mm pomiędzy kwadratami.

Uwagi: - Należy używać wyłącznie miękkiej strony rzepa, kierując tę stronę do góry.
- Należy upewnić się, że wierzchołki są skierowane ku sobie.
- Silikonowym klejem należy pokryć tylko rzep; nie wolno rozprowadzać kleju w całej studni.
- W celu późniejszej stymulacji elektrycznej istotne jest ustawienie konstruktów w pionowym kierunku płytki wielodobowej (wzdłuż długiej osi).

2. Pozostawić do wyschnięcia na noc w nieogrzewanej suszarce próżniowej, głównie w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Sterylizować poprzez dodanie 70% EtOH do dołków i inkubować przez 15 min. Przepłukać 3x buforem PBS i naświetlać promieniowaniem UV przez 15 min. Usunąć cały PBS z dołków oraz z rzepów (Velcro) i umieścić w inkubatorze do momentu użycia.
3. Rozmrozić roztwór Matrigelu w lodówce i przygotować roztwór kolagenu o pożądanym stężeniu krótko przed przygotowaniem konstruktów 3D. Rozcieńczyć zapas kolagenu sterylnym 0,02% kwasem octowym (stężenie końcowe 3,2 mg/ml).

Uwaga: wszystkie odczynniki i próbki należy przechowywać w lodzie.

4. Poddać komórki trypsynizacji, resuspendować w GM i policzyć. Pozostawić komórki w probówce do wirowania w inkubatorze.
5. Do probówki dodać odpowiednią ilość roztworu zapasu kolagenu dla liczby konstruktów, które zamierza się przygotować (zgodnie z Tabelą 1), a następnie dodawać 0,5M NaOH do tego roztworu kolagenu, aż jasnoróżowy kolor wskaże pH 7,5. Pomieszać delikatnie, pipetując w górę i w dół, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie dodać Matrigel i bardzo delikatnie, ale dokładnie wymieszać. Na koniec dodać GM do mieszaniny kolagenu i Matrigelu (odpowiednie ilości znajdują się w Tabeli 1).

Uwagi: - Każdy krok należy wykonywać w lodzie! Matrigel i kolagen szybko żelują w temperaturze powyżej 0°C.
- Należy upewnić się, że kolor jest rzeczywiście różowy! Wzrost pH również wywoła szybką żelację.
- Końcowe stężenie kolagenu: 1.6 mg/ml.

6. Odwirować odpowiednią ilość komórek przy 1,000 rpm przez 5 min, a następnie usunąć nadsącz.

Uwaga: - W zależności od aktywności komórek liczbę komórek na konstrukt należy odpowiednio dostosować. Zazwyczaj liczba ta mieści się w przedziale od 750 000 do 1 250 000 komórek na konstrukt.

7. Użyj części mieszaniny żelowej, aby resuspendować pellet komórkowy, a następnie przenieś komórki do pozostałej części mieszaniny i wymieszaj dokładnie, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.
8. Wyjmij podgrzane wcześniej płytki z inkubatora i pipetuj 0,35 - 0,4 ml mieszaniny komórkowo-żelowej najpierw na rzepy. Następnie zacznij pipetować mieszaninę od środka, pomiędzy miejscami mocowania, rozszerzając ją w stronę rzepów. Na koniec wykorzystaj pozostały żel, aby wypełnić lukę między dwoma kotwicami z rzepów i pipetuj wokół fragmentów rzepów.
9. Po 5-10 min ostrożnie sprawdź, czy żele są wystarczająco stałe, aby można było je przenieść, i.e. delikatnie stuknij płytki i sprawdź wizualnie, czy żel jest sztywny. Jeśli tak, ostrożnie umieść płytki w inkubatorze. Zazwyczaj można je wyjąć po dziesięciu minutach. Następnie, po 1-2 h, delikatnie przykryj każdy żel 4 ml ciepłego medium GM.

Uwaga: -Należy unikać gwałtownych ruchów podczas przenoszenia płytek.

10. Po 24 h zastąp GM pożywką różnicującą (pożywka wzrostowa bez ekstraktu z zarodka kurczaka), a następnie wymieniaj pożywkę na świeżą co 2-3 dni. W 7. dniu powinny powstać dojrzałe, zorientowane włókna mięśniowe, co można ocenić poprzez barwienie w celu oceny rozwoju poprzecznych prążków w stopionych włóknach mięśniowych.

3. Stymulacja elektryczna

1. Przed użyciem wysterylizować elektrody z płytki ionoptix (patrz tabela odczynników i sprzętu) za pomocą 70% etanolu, a następnie wysuszyć pod promieniowaniem UV w komorze bezpiecznej. Umieścić płytkę z elektrodami na płytce hodowlanej z konstruktami, przykryć pokrywką z płytki hodowlanej i przenieść do inkubatora. Podłączyć urządzenie Ionoptix C-pacer za pomocą odpowiednich kabli.

Uwaga: Elektrody są umieszczone równolegle wzdłuż konstruktu mięśniowego (Rysunek 2).

2. Zastosuj przewidziany protokół stymulacji.

Uwaga: Zazwyczaj stosujemy impulsy o wartości 4 V/CM i czasie trwania 6ms przy częstotliwości 2Hz. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 24 hr w trakcie stymulacji.

Wyniki

Produktem końcowym będą konstrukty mięśniowe przedstawione na Ryc. 3. Rozmiar tkanki będzie wynosić około 8 mm długości, 2 mm szerokości i 0,5 mm grubości. Stymulacja elektryczna podczas różnicowania zmieni ekspresję izoform ciężkiego łańcucha miozyny, ale nie wzmocni znacząco procesu różnicowania indukowanego przez medium różnicujące 8; stymulację elektryczną można również zastosować na koniec procesu w celu sprawdzenia funkcjonalności mięśnia, ponieważ mięsień z w pełni rozwiniętymi sarkomerami będzie ...

Dyskusja

Inżynieria tkanek mięśniowych wykazuje ogromny potencjał w zastosowaniach jako model choroby, w przesiewaniu leków, w medycynie regeneracyjnej oraz w produkcji mięsa. Wymagania dla tych zastosowań są jednak zróżnicowane. Zdecydowaliśmy się pracować z kombinacją kolagenu i matrigelu, ponieważ kolagen umożliwia wyrównanie komórek, a komórki progenitorowe mioblastów wymagają obecności białek pochodzących z błony podstawnej, co ustalono w poprzednich badaniach 2D ¹². Ponadto w naszym laboratorium testowano żele fi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matrigel z obniżoną zawartością czynników wzrostu	Beckton and Dickinson
DMEM (wysoka zawartość glukozy)*	Gibco	42430
Advanced DMEM	Gibco	12491
Surowica konia	Gibco	65050-122
Płodowa surowica bydlęca	Greiner	758075
Filtr strzykawkowy 0,45 i 0,22 μm*	Whatmann (Schleicher and Scheull)	10462100
L-glutamina	Gibco	25030024
Penicylina/streptomycyna	Gibco	10378016
Amfoterycyna	Gibco	15290-018
Plastik hodowlany	Greiner		Obejmuje kolby hodowlane i pipety
Ekstrakt z zarodka kurczaka	United States Biological	C3999
Pipeta Pasteura*	Hilgenberg		Pipety Pasteura, z przewężeniem, z watą, z otwartym końcem L: 230 mm z średnicą końcówki 0,9 - 1,1 mm
Pipeta Pasteura*	Hilgenberg		Pipety Pasteura, z przewężeniem, z watą, z otwartym końcem L: 230 mm z średnicą końcówki 1,4 - 1,6 mm
Pipeta Pasteura	VWR	612-1702
Kolagenaza typu I*	Sigma	C0130-16
Sito do komórek 40 μm*	BD Falcon	352340
Igła 19G
Elastomer	Dow Corning corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Utwardzacz	Dow Corning corporation		Silastic MDX 4-4210#
Rzep	Sklep ogólnodostępny		Można kupić w zwykłym sklepie, używać tylko miękkiej strony
Kolagen typu I, z ogona szczura	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP Culture Pacer	Ionoptix
Płytki hodowlane 6-dołkowe do stymulacji elektrycznej	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon #353846
Elektrody do płytek hodowlanych C-Dish	Ionoptix
* Wymagane do izolacji komórek (punkt 1.1) # Razem w jednym zestawie