Rejestracje metodą patch-clamp w komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego wyizolowanych z ryby danio-ostrobramowej

Podsumowanie

Celem tego filmu jest zaprezentowanie procedur pozyskiwania zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych z organów ucha wewnętrznego dorosłych danio pręgowanych, a następnie wykorzystania ich w badaniach metodą patch clamp w celu scharakteryzowania właściwości biofizycznych ich kanałów sterowanych napięciem.

Streszczenie

Analizy metodą patch-clamp w odniesieniu do kanałów sterowanych napięciem w komórkach rzęskowych sensorycznych izolowanych od różnych gatunków zostały opisane wcześniej^1-4, jednak niniejszy film stanowi pierwsze zastosowanie tych technik w odniesieniu do komórek rzęskowych ryby danio pręgowanego (zebrafish). Prezentujemy tutaj metodę izolacji zdrowych, nienaruszonych komórek rzęskowych ze wszystkich narządów końcowych ucha wewnętrznego: sakula, lageny, utricula oraz kanałów półkolistych. Ponadto wykazujemy zróżnicowanie rozmiarów i morfologii komórek rzęskowych oraz przedstawiamy przykłady rejestracji metodą patch-clamp, jakie można uzyskać. Przewaga zastosowania tego modelu zebrafish nad innymi wynika z dostępności mutantów zebrafish, u których zaburzony jest zarówno słuch, jak i równowaga. W połączeniu z wykorzystaniem linii transgenicznych oraz innych technik opartych na analizie i manipulacjach genetycznych, przedstawione tutaj metody izolacji komórek i badania elektrofizjologiczne powinny ułatwić lepsze zrozumienie roli, jaką komórki rzęskowe odgrywają w pośredniczeniu tych modalności sensorycznych.

Protokół

1. Przygotowania przedeksperymentalne

1. Przygotować sześć roztworów (składy znajdują się w Tabeli 1): (a) 100 ml NZR (standardowy roztwór Ringera dla danio przebrzuchego), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR +BSA; (d) 100 ml LoCaS (roztwór z niską zawartością Ca²⁺), (e) 10 ml LoCaS + papaina, (f) 100 ml K⁺-internal solution. Roztwory (a), (b), (d) i (f) można przechowywać do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C. Roztwory (c) i (e) należy przygotować w dniu eksperymentu. Przed rozpoczęciem doświadczeń wszystkie roztwory powinny osiągnąć temperaturę pokojową.
2. Oznaczyć i napełnić cztery szalki Petriego o średnicy 35 mm mniej więcej do połowy roztworami (a), (c), (d) i (e).
3. Przygotować naczynie do sekcji, wypełniając szalkę Petriego o średnicy 60 mm masą Sylgard (Dow Corning, Midland, MI), a następnie wycinając w niej wgłębienie, które pozwoli rybie utrzymać się w pozycji pionowej bez przewracania się.
4. Przygotować co najmniej dwa narzędzia do izolacji komórek, przyklejając końcówkę włosa psa (od strony mieszka) do końcówki szklanej pipety Pasteura za pomocą superglue, tak aby włos wystawał poza końcówkę pipety o około 0,5 cm. Dobrze sprawdzają się włosy psów o miękkiej sierści, np. labradorów i weimaranów.

2. Izolacja błędnika słuchowego i przedsionka

1. Uśmierć jedną dorosłą danio-ostrobiu (zebrafish) poprzez zanurzenie w zlewce zawierającej NZR + Tricaine. Monitoruj wizualnie skrzela, aż do całkowitego ustania ruchów pokryw skrzelowych. Odczekaj dodatkowe dziesięć minut przed wyjęciem ryby i opłukaniem jej świeżym roztworem NZR. Procedury te zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Pepperdine, jednak zgodę należy uzyskać z własnej instytucji.
2. Przymocuj rybę do tacki sekcyjnej grzbietem do góry, wbijając jedną standardową prostą szpilkę krawiecką (o długości ok. 2,5 cm) w każdy oczodół oraz trzecią szpilkę w osi grzbietowo-brzusznej w odległości około jednej trzeciej do połowy dystansu od głowy do ogona, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1A.
3. Pod stereomikroskopem sekcyjnym z powiększeniem (0,62-5x) i okularami 10x, użyj nożyczek sprężynowych (Fine Science Tools numer katalogowy 15000-02), aby odsłonić mózg i krótki odcinek rdzenia kręgowego, usuwając sklepienie czaszki od punktu położonego około 0,5 cm za poziomem skrzeli w kierunku nosa ryby. Przetnij rdzeń kręgowy i podnieś mózg za pomocą precyzyjnej pęsety (Fine Science Tools numer katalogowy 11251-30), przecinając nerwy rdzeniowe i inne przyczepy; usuń mózg i go odrzuć (Rysunek 1B).
4. Pozostała brzuszna połowa torebki czaszki tworzy „miseczkę” zawierającą organy ucha wewnętrznego. Zaobserwuj wyraźne, białe, nieprzezroczyste otolity w lagenach i sakkulach znajdujących się symetrycznie na końcu ogonowym każdego ucha wewnętrznego oraz położone bardziej rostralnie i bocznie otolity utrykul (Rysunki 1C i 4A).
5. Usuń kostną miseczkę, przecinając wszystkie przyczepy brzuszne i boczne, jednocześnie delikatnie wyciągając ją z głowy precyzyjną pęsetą. Umieść ją w płytce Petri zawierającej LoCaS (Rysunki 1D i 4B).
6. Używając dwóch par precyzyjnych pęset, rozłup miseczkę wzdłuż linii środkowej, chwytając krawędzie boczne kości i rozsuwając je lub alternatywnie oddzielając prawą i lewą połowę poprzez włożenie końców pęset w centrum i rozdzielenie połówek. Usuń dwa labirynty z kości za pomocą precyzyjnej pęsety (Rysunek 2).
7. Obejrzyj labirynty, aby zidentyfikować narządy końcowe słuchowe i przedsionkowe: kanały półkoliste, utrykuły, sakkule i lageny (Rysunek 4C). Różowawe obszary pod każdym otolitem to maculae zawierające komórki rzęsate. Podobnie, różowy pasek wewnątrz ampull kanałów półkolistych wskazuje cupula, w której znajdują się komórki rzęsate.
8. Ostrożnie usuń otolity z lageny i utrykuły za pomocą precyzyjnej pęsety (Rysunki 2 i 4C). Nie jest konieczne usuwanie otolitu z sakkuli, ponieważ może to uszkodzić komórki rzęsate sakkuli.

3. Izolacja komórek rzęsistych

1. Za pomocą plastikowej pipety transferowej (numer katalogowy Fisher Scientific 13-711-9AM) przenieś organy końcowe do naczynia zawierającego LoCaS + papain, minimalizując objętość przenoszonego płynu.
2. Inkubuj te struktury w tym roztworze przez trzydzieści minut w temperaturze pokojowej.
3. Po zakończeniu okresu inkubacji przenieś struktury do naczynia zawierającego NZR + BSA i inkubuj w tym roztworze przez co najmniej trzydzieści minut. Komórki rzęsiste pozostaną zdrowe w tym roztworze do czterech godzin, ale ich stan pogorszy się po 1-2 godzinach od izolacji (patrz kolejne kroki).
4. W przygotowaniu do izolacji komórek przenieś jeden z organów końcowych do naczynia zawierającego NZR.
5. W przypadku lagen i utrykulów użyj włosu psa, aby delikatnie odłączyć plamy (maculae) – arkusze różowawą tkanki nabłonkowej zawierające komórki rzęsiste (Rysunek 3A). Plamy można wybrać (używając włosa psa) spod otolitów sakulów, a kopułki (cupulae) z ich lokalizacji w ampullach kanałów półkolistych.
6. Używając dwóch narzędzi do izolacji komórek przygotowanych w kroku 1.4, utrzyturuj plamę lub kopułkę, aby stworzyć obszar z detrytusem zawierającym komórki rzęsiste (Rysunek 3B). Pozostaw komórki na co najmniej pięć minut, aby osiadły na dnie naczynia przed jego przeniesieniem.
7. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w optykę kontrastową fazową. Obserwuj komórki przy powiększeniu 40X i zwróć uwagę na różnorodność morfologiczną. Wiele komórek ma kształt awokado, podczas gdy inne są długie i cienkie. Obecność apikalnych wiązek rzęsek identyfikuje je jako komórki rzęsiste, a jasność w kontraście fazowym potwierdza ich żywotność. Fotomikrografie izolowanych komórek rzęsistych przedstawiono na Rysunku 5.

4. Patch clamping komórek rzęskowych ryb danio pręgowanych

1. W celu przygotowania do rejestracji metodą perforowanej pipety (perforated patch recordings)^5,6, przygotuj wewnętrzny roztwór zawierający amfoterycynę w następujący sposób: umieść 5 mg amfoterycyny B (Sigma A4888) w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dopełnij 100 μl DMSO. Natychmiast wymieszaj ten roztwór na wirówce wortex przez 10-20 sekund, aż cała amfoterycyna zostanie rozpuszczona. Następnie pipetuj 625 μl wewnętrznego roztworu K⁺ do drugiej probówki do mikrocentryfugi. Dodaj 10 μl roztworu amfoterycyny do wewnętrznego roztworu K⁺ i wymieszaj w vortex w opisany wyżej sposób. Roztwór zapasowy amfoterycyny zachowa trwałość przez kilka godzin, jednak końcowy roztwór należy odrzucić po jednej godzinie.
2. Wykonaj pipety do patch-clampu ze szkła borokrzemowego BF 150-86-10 (Sutter Instruments) za pomocą wieloetapowej wyciągarki (Sutter P-1000). Pipety powinny mieć średnicę końcówki około 2 μm i oporność 1-3 MΩ w roztworach podanych w Tabeli 1. Ustawienia wyciągarki, które sprawdzają się najlepiej, to: Heat=Ramp minus10, Pull=0, Velocity=18, Delay=1, Pressure=600. Kształt końcówki dobrej pipety jest widoczny na zdjęciu w insertcie c na Rysunku 5. Preferowane są tępe pipety o kształcie „pocisku”, ponieważ oferują one najmniejszą oporność dostępu podczas rejestracji elektrofizjologicznej.
3. Użyj igły strzykawki Microfil o rozmiarze 28 gauge (MF28G-5; World Precision Instruments), aby wypełnić elektrodę rejestrującą do połowy wewnętrznym roztworem K⁺ zawierającym amfoterycynę.
4. Przymocuj elektrodę do głowicy wzmacniacza patch-clamp. Aplikuj skoki napięcia -10 mV przez 10 ms z częstotliwością 10 Hz i utrzymuj dodatnie ciśnienie w elektrodzie podczas jej przemieszczania przez granicę powietrze/roztwór i opuszczania na dno naczynia rejestracyjnego w pobliże komórek.
5. Ustaw elektrodę prostopadle do zdrowo wyglądającej komórki. Gdy elektroda znajdzie się wystarczająco blisko komórki, tak że ta zacznie oddalać się od wypływającego roztworu, szybko odwróć ciśnienie, przykładając do elektrody lekką próżnię, aż komórka „przeskoczy” na nią. Natychmiast przerwij ssanie elektrody i przyłóż potencjał utrzymujący -70 mV do wnętrza elektrody. W ciągu kilku sekund utworzy się uszczelnienie gigaohmove (gigaohm seal).
6. Obserwuj przejściowe prądy pojemnościowe na początku i końcu skoków napięcia, które pojawiają się wkrótce po utworzeniu uszczelnienia. Kontynuuj monitorowanie perforacji błony pod elektrodą przez amfoterycynę, obserwując wzrost amplitudy tych przelotów aż do osiągnięcia ich maksymalnej wartości (po około dziesięciu minutach).
7. Aby potwierdzić ustanowienie konfiguracji whole-cell (perforowanej) w zdrowej komórce, wywołaj prądy wyjściowe K⁺ poprzez aplikację hiperpolaryzujących i depolaryzujących skoków napięcia. Większość komórek rzęsek wykazuje wyraźne prądy wyjściowe (patrz Rysunek 6).

5. Reprezentatywne wyniki

Rycina 4 przedstawia obrazy wykonane podczas etapów izolacji komórek. Na panelu A widać otolity związane z lagenami, sacculi i utriculi przez cienką warstwę kości, która je przykrywa. Te nieprzezroczyste struktury stanowią wygodne punkty orientacyjne, które pomagają w bezpiecznym usunięciu narządów końcowych z organizmu zwierzęcia podczas kolejnych kroków sekcji. Panel B pokazuje kostną „miseczkę” zawierającą nienaruszone labirynty oraz wyraźne otolity w utriculi, lagenach i sacculi. Panel C przedstawia labirynt usunięty z kości. Należy zwrócić uwagę na duży otolit z karbowanym brzegiem w lagenie, otolit w kształcie soplek w sacculi oraz otolit w kształcie fasoli w utriculi. Część zróżnicowania wielkości i morfologii obserwowanych w komórkach izolowanych z lageny zilustrowano na Rycynie 5. Zdrową komórkę można łatwo zidentyfikować po jasnym obrazie w kontraście fazowym i ostrym obrysie. Kształty komórek można w przybliżeniu podzielić na dwie klasy: w kształcie awokado (avo) oraz długie i cienkie (thn), choć rozmiary komórek wewnątrz każdej z grup mogą się znacząco różnić (porównaj na przykład avo 1 i avo 3). Wstawka a pokazuje skupisko trzech komórek, które nie zostały całkowicie odizolowane od siebie. Czarny kolor i ziarnisty wygląd komórki we wstawce b jednoznacznie identyfikuje tę komórkę jako martwą. Wstawka c pokazuje końcówkę pipety patch, ilustrując kształt i wymiary odpowiednie do rejestracji z tych komórek.

Prądy przedstawione na Rysunku 6 uzyskano w odpowiedzi na kroki hiperpolaryzujące i depolaryzujące potencjału przyłożone do komórki lageny podobnej do avo 2 pokazanej na Rysunku 5. Odpowiedzi prądowe w komórkach o różnych rozmiarach i kształtach mogą się znacznie różnić, co sugeruje różnorodność w zestawie kanałów sterowanych napięciem.

Ryciny 1-3: Schematy przedstawiające etapy izolacji komórek rzęskowych.

Rysunek 1. Usuwanie torebki czaszki zawierającej błędniki ucha wewnętrznego u danio-pręgowanego. A. Przymocowanie uśmierconego danio-pręgowanego grzbietem do góry do naczynia sekcyjnego za pomocą szpilek. B. Otwarcie czaszki, usunięcie i utylizacja mózgu. C. Obserwacja otolitów w utriculusach, lagenach i sacculi. D. Usunięcie brzusznej części torebki czaszki zawierającej błędniki.

Rysunek 2. Usuwanie labiryntów z torebki czaszki. A. Rozdzielenie torebki czaszki wzdłuż linii środkowej. B. Usunięcie labiryntów z kości. C. Usunięcie otolitów z lagen i utriculi za pomocą pęsety.

Rycina 3. Izolacja komórek rzęsnych z labiryntów. A. Delikatnie oddziel plamki za pomocą włosa psa. B. Rozetrzyj plamki dwoma włosami psa. C. Wykorzystaj izolowane komórki rzęsiste do techniki patch clamp.

Rysunek 4. Obrazy wykonane podczas poszczególnych etapów izolacji pojedynczych komórek. A. Po usunięciu mózgu widoczne są otolity związane z dwiema lagenami i sakkulami (strzałki) oraz utrykułami (groty strzałek). B. Po usunięciu z organizmu brzusznej części torebki czaszki zawierającej organy ucha wewnętrznego. Schemat w prawej części obrazu B wskazuje lokalizację lewego utrykułu, lageny i sakkuli. Linia przerywana oznacza przybliżoną pozycję lewego labiryntu. C. Prawy labirynt (widok przyśrodkowy) D: Schemat ilustrujący kluczowe części labiryntu widocznego na obrazie C. a: przedni kanał półkolisty, b: kanał poziomy, c: kanał tylny, d: otolit utrykuły, e: otolit sakkuli, f: otolit lageny. Pasek skali w D reprezentuje 1 mm dla A i B oraz 0,5 mm dla C i D.

Rycina 5. Izolowane, zdrowe komórki z lagena ilustrujące różnorodność morfologiczną; avo: komórki o kształcie awokado; thn: komórki długie i cienkie. Wstawka a: skupisko trzech nie w pełni izolowanych komórek; wstawka b: martwa komórka; wstawka c: końcówka elektrody płatkowej użytej w rejestracjach elektrofizjologicznych z komórek rzęsek ryby zebrafish. Pasek skali = 20 μm odnosi się do głównego obrazu i wszystkich wstawek.

Rycina 6. Prądy zarejestrowane w komórce rzęsnej poddanej technice patch-clamp. Uśrednione odpowiedzi w komórce (podobnej do avo 2 na Rycynie 5) na trzy prezentacje skoków napięcia przyłożonych w przyrostach 10 mV od -140 mV do +70 mV z potencjału spoczynkowego -70 mV. Zwróć uwagę na prąd inaktywujący, który pojawia się przy bardziej zdepolaryzowanych potencjałach. Wartości skoków napięcia są przedstawione obok niektórych przebiegów.

Dyskusja

Staranna dyssekcja narządów końcowych oraz delikatne obchodzenie się z komórkami są kluczowe dla pomyślnej izolacji zdrowych, nienaruszonych i fizjologicznie aktywnych komórek rzęsatych. Przestrzeganie poniższych wskazówek zapewni sukces:

1. Łatwiej jest uzyskać zdrowe komórki z mniejszych ryb (o długości 2-2,5 cm). Większe ryby posiadają znacznie więcej kropel tłuszczu, które utrudniają wizualizację podczas procesu sekcji.
2. Należy zachować ostrożność podczas usuwania otolitów, które znajdują się nad komórkami rzęskami. Należy unikać dotykania komórek podczas chwytania otolitów pincetą.
3. Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy maculae i cupulae są podnoszone jako płaty, a komórki są oddzielane od nabłonka poprzez tryturację.
4. Stwierdziliśmy, że użycie włosa psa do tryturacji komórek jest skuteczniejsze niż inne metody, w tym użycie ludzkich rzęs⁷, które nie są tak zwężone i są mniej elastyczne.
5. Podczas metody patch clamp ważne jest zastosowanie dodatniego ciśnienia w elektrodzie w momencie przechodzenia przez granicę powietrze/roztwór, aby utrzymać czystość końcówki. Równie istotne jest zwolnienie dodatniego ciśnienia, aby komórka mogła „zeskoczyć” na elektrodę. Metoda ta usuwa niewielką objętość roztworu zawierającego amfoterycynę z obszaru końcówki, co zwiększa prawdopodobieństwo utworzenia uszczelnienia gigaohmicznego z komórką. W naszych eksperymentach stosujemy technikę rejestracji z perforowanym otworem (perforated patch) zamiast tradycyjnej konfiguracji whole-cell ze względu na kruchość komórek. Próba przejścia w tryb „whole cell” często prowadzi do utraty uszczelnienia gigaohmicznego.

Opisana tutaj metoda pozwoli na uzyskanie setek zdrowych komórek słuchowych z jednego zwierzęcia. Technikę tę można przeprowadzić w temperaturze pokojowej i nie wymaga ona żadnego specjalistycznego sprzętu poza mikroskopem operacyjnym. Wcześniejsza publikacja w JoVE opisuje dysekcję ucha wewnętrznego ryb danio-ostrobramowych z wykorzystaniem podejścia brzusznego⁸. Autorzy ci demonstrują dysekcję całych organów ucha wewnętrznego utrwalonych w paraformaldehydzie. Zachęcamy czytelnika do obejrzenia tego filmu w celu porównania z naszymi metodami. Jedną z zalet zaprezentowanych tutaj metod jest możliwość pozyskania żywych komórek, które są użyteczne w badaniach fizjologicznych. Poza zastosowaniem w eksperymentach patch-clamp do badania kanałów sterowanych napięciem (jak pokazano tutaj), wykorzystanie tych komórek można rozszerzyć na badanie rezonansu komórkowego^9,10, monitorowanie uwalniania neuroprzekaźników poprzez pomiary pojemności^11,12, badanie neuromodulacji indukowanej aktywacją kanałów sterowanych ligandem¹³, a także wykorzystanie bogactwa informacji, jakie można uzyskać dzięki zastosowaniu mutantów wpływających zarówno na słuch, jak i na równowagę¹⁴.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(a) NZR (roztwór Ringera dla zdrowych rybek zebrafish) (w mM)	116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl22, 3 glukozy, 5 Na+-HEPES, pH 7,35.
(b) NZR + tricaina	NZR + 0,02% metanosulfonianu estrów etylowych kwasu 3-aminobenzoowego (Sigma A5040).
(c) NZR + BSA	NZR + 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (Sigma A2153).
(d) LoCaS (niska zawartość wapnia)2+ Roztwór (w mM)	100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl2, 0,05 MgCl22, 3 glukozy, 30 Na+-HEPES, pH 7,35.
(e) LoCaS + papaina	LoCaS + 0,05% L-cysteiny (Sigma C1276) + 0,2% papainy (Sigma P3375).
(f) K+-roztwór wewnętrzny (w mM)	52 K2SO4, 38 KCl, 1 K+-EGTA, 5 K+-HEPES, pH 7,3.
Tabela 1. Roztwory.