Zoptymalizowane metody modelowania barwienia i proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników śledzących komórki

Summary

Skuteczne wykorzystanie barwników śledzących komórki do monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka kluczowych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednolitego, powtarzalnego znakowania za pomocą barwników membranowych; 2) dobór fluorochromów i warunków pozyskiwania danych; oraz 3) wybór modelu do ilościowego określenia proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Abstract

Fluorescencyjne barwniki śledzące komórki, w połączeniu z cytometrią przepływową i obrazową, są potężnymi narzędziami do badania interakcji i losów różnych typów komórek in vitro i in vivo. ^1-5 Chociaż istnieją dosłownie tysiące publikacji używających takich barwników, niektóre z najczęściej spotykanych aplikacji do śledzenia komórek obejmują monitorowanie:

1. Spoczynek, proliferacja i/lub różnicowanie komórek macierzystych i progenitorowych^6-8
2. Sterowany antygenem transfer błonowy⁹ i/lub proliferacja komórek prekursorowych^3,4,10-18 oraz
3. Funkcja komórek immunologicznych, regulacyjnych i efektorowych^1,18-21.

Komercyjnie dostępne barwniki śledzące komórki różnią się znacznie pod względem składu chemicznego i właściwości fluorescencyjnych, ale zdecydowana większość zalicza się do jednej z dwóch klas w zależności od ich mechanizmu znakowania komórek. "Barwniki błonowe", oznaczone jako PKH26, są barwnikami wysoce lipofilowymi, które stabilnie, ale niekowalencyjnie dzielą się na błony komórkowe^1,2,11. "Barwniki białkowe", typowe dla CFSE, to barwniki aminoreaktywne, które tworzą stabilne wiązania kowalencyjne z białkami komórkowymi^4,16,18. Każda klasa ma swoje zalety i ograniczenia. Kluczem do ich skutecznego wykorzystania, szczególnie w badaniach wielobarwnych, w których do śledzenia różnych typów komórek wykorzystuje się wiele barwników, jest zatem zrozumienie krytycznych kwestii umożliwiających optymalne wykorzystanie każdej klasy^2-4,16,18,24.

Zawarte tutaj protokoły podkreślają trzy najczęstsze przyczyny słabych lub zmiennych wyników podczas korzystania z barwników śledzących komórki. Są to:

1. Niepowodzenie w uzyskaniu jasnego, jednolitego i powtarzalnego etykietowania. Jest to niezbędny punkt wyjścia dla każdego badania śledzenia komórek, ale wymaga zwrócenia uwagi na inne zmienne podczas stosowania barwników błonowych niż w przypadku stosowania barwników białkowych lub odczynników wiążących równowagę, takich jak przeciwciała.
2. Nieoptymalne kombinacje fluorochromów i/lub brak uwzględnienia krytycznych kontroli kompensacji. Fluorescencja barwnika śledzącego jest zwykle 10² - 10³ razy jaśniejsza niż fluorescencja przeciwciał. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić, czy obecność barwnika śledzącego nie wpływa negatywnie na zdolność wykrywania innych używanych sond.
3. Brak dobrego dopasowania za pomocą oprogramowania do modelowania szczytów. Takie oprogramowanie umożliwia ilościowe porównanie reakcji proliferacyjnych w różnych populacjach lub bodźcach w oparciu o częstotliwość występowania prekursorów lub inne wskaźniki. Uzyskanie dobrego dopasowania wymaga jednak wykluczenia martwych/umierających komórek, które mogą zniekształcać profile rozcieńczania barwnika i dopasowania założeń leżących u podstaw modelu do charakterystyki obserwowanego profilu rozcieńczania barwnika.

Przykłady podane tutaj ilustrują, jak te zmienne mogą wpływać na wyniki przy użyciu barwników błonowych i/lub białkowych do monitorowania proliferacji komórek.

Protocol

1. Ogólne etykietowanie membran za pomocą barwnika PKH26 do śledzenia komórek (Ref. 25; Rysunek 1)

1. Użyj sterylnej techniki dla kroków 1.1 - 1.9. Przygotować ~10⁷ ludzkich komórek jednojądrzastych lub limfocytów krwi obwodowej (hPBMC, hPBL) przy użyciu standardowej metody laboratoryjnej z dodatkiem końcowego wirowania 300 x g w celu zminimalizowania zanieczyszczenia płytek krwi. Zawiesić komórki w temperaturze 10⁷/ml w HBSS+1% BSA i umieścić na lodzie, zachowując 500 μl podwielokrotności (5x10⁶ komórek) do użycia w kroku 2.
2. Umieść 5x10⁶ komórek (500 μl) w stożkowej probówce polipropylenowej o wymiarach 12 x 75 mm. Przemyć raz 3,5 ml HBSS. Ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15-25 μl pozostałego płynu, ale uważając, aby nie usunąć komórek. Użyj tej probówki, aby przygotować zawiesinę 2x komórkową w kroku 1.4.
3. Podczas mycia komórek w kroku 1.2 dodać 0,5 ml rozcieńczalnika C do etykietowania (z zestawu do PKH26GL) do stożkowej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 x 75 mm. Użyj tej probówki, aby przygotować 2x roztwór PKH26 w kroku 1.5.
4. Dodać 0,5 ml nośnika do znakowania rozcieńczalnika C do przemytego osadu komórkowego z kroku 1.2 i odessać i dozować 3-4 razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową (2x komórka). Unikaj tworzenia się pęcherzyków i nadmiernego mieszania, które może zmniejszyć żywotność i regenerację komórek.
5. Natychmiast po przygotowaniu zawiesiny 2x komórek w kroku 1.4, przygotuj 2x (4 μM) roztwór barwnika, dodając 2,0 μl 1,0 mM barwnika PKH26 w etanolu (z zestawu do PKH26GL) do probówki rozcieńczalnika C przygotowanej w kroku 1.3 i odwirować do równomiernego rozproszenia.
6. Natychmiast po przygotowaniu roztworu 2x barwnika w kroku 1.5, szybko odpipetuj zawiesinę 2x komórek z kroku 1.4 do roztworu 2x barwnika i jednocześnie zasysaj i dozuj 3-4 razy, aby całkowicie rozproszyć komórki w barwniku. Nie: nie dodawaj barwnika 1,0 mM bezpośrednio do komórek; wlej 2x komórki do 2x barwnika; lub dodaj 2x komórki do 2x barwnika podczas wirowania. Ponieważ barwienie jest niemal natychmiastowe, takie metody dają mniej jednolitą intensywność niż metoda zalecana (ryc. 2).
7. Po 1 minucie dodaj 1,0 ml inaktywowanej termicznie surowicy lub HBSS+5% BSA, aby zatrzymać wchłanianie barwnika do błon komórkowych. Nieużycie wystarczającej ilości białka grozi powstawaniem agregatów barwnikowych, które mogą osadzać się z komórkami podczas etapów mycia i powodować niezamierzone znakowanie innych komórek obecnych w eksperymencie. Jeśli jako odczynnik zatrzymujący ma być użyta pożywka z 10% surowicą inaktywowaną termicznie (CM) lub HBSS+1% BSA, należy przeprowadzić barwienie w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml i dodać co najmniej 5,0 ml odczynnika zatrzymującego, aby zapewnić adsorpcję całego niewłączonego barwnika.
8. Odwirować znakowane komórki przez 5 min @ ~400 x g. Ostrożnie odessać supernatant bez usuwania komórek. Umyć granulat dwukrotnie 4 ml CM lub HBSS+1% BSA, dobrze dyspergując osad przed ponownym odwirowaniem. Aby zminimalizować przenoszenie barwnika zaadsorbowanego na ściankach probówki i zmaksymalizować wydajność mycia, po pierwszym ponownym zawieszeniu przenieś komórki do świeżej probówki polipropylenowej. Uwaga: odpowiednio wybarwione komórki będą miały wyraźny różowy odcień w granulce.
9. Zawiesić przemyty osad komórkowy w 1,0 ml HBSS+1% BSA. Policz komórki, określ regenerację komórek i dostosuj objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 10⁷ / ml. Przy starannym zasysaniu regeneracja komórek powinna wynosić ≥85%. Jeśli regeneracja komórek wynosi < 70%, określ przyczynę, zanim przejdziesz dalej. Pobrać 150 μl podwielokrotności (1,5x10⁶ komórek) i umieścić na lodzie do użycia w kroku 2.

2. Przygotowanie kontroli ustawień przyrządów i testów (Tabela 1)

1. Porcję 50 μl (5x10⁵) niebarwionych komórek z zawiesiny komórkowej zapisanej w kroku 1.1 do każdej z pięciu probówek Eppendorfa o pojemności 1,8 ml: 1, 3, 4, 5 i 7. Podwielokrotność 50 μl (5x10⁵) komórek^pos PKH26 z kroku 1.9 do każdej z trzech probówek: 2, 6 i 8.
2. Dodać 10 μl bloku IgG (100 μg/probówkę IgG; patrz tabela odczynników) do probówek 1-8 i inkubować przez 10 minut w temperaturze otoczenia (20-25 °C).
3. Dodać nasyconą ilość przeciwciała (przeciwciał) wskazanego w tabeli 1 do probówek 4, 5, 7 i 8 i inkubować wszystkie próbki (probówki 1-8) przez 30 minut w temperaturze otoczenia i chronić przed światłem.
4. Dodać 1,5 ml HBSS+1% BSA do wszystkich próbek, otopić komórki przez odwirowanie (5 min @ 400 x g) i przemyć raz 1,5 ml HBSS+1% BSA, ostrożnie zasysając, aby uniknąć utraty komórek.
5. Zawiesić każdą próbkę w 500 μl HBSS+1% BSA. Jeśli jest to wymagane do próbek do analizy na cytometrze, przenieś je do probówki o okrągłym dnie 12 x 75 mm. Dodać 10 μl 100 μg/ml dziennego zapasu roboczego 7-AAD (patrz tabela odczynników) do probówek 3, 6, 7 i 8, jak wskazano w tabeli 1. Inkubować na lodzie przez 30 minut przed użyciem w konfiguracji cytometru przepływowego i weryfikacji barwienia (krok 3).

3. Konfiguracja cytometru przepływowego i weryfikacja barwienia

1. Sprawdź, czy cytometr przepływowy działa prawidłowo, korzystając z ustalonych przez laboratorium procedur codziennej kontroli jakości. Sprawdzić, czy sygnały mogą być łatwo wykryte w każdym oknie widmowym, które ma być użyte, oraz czy odpowiedzi detektora są liniowo proporcjonalne do intensywności sygnału w oknie, które ma być wykorzystane do monitorowania proliferacji¹⁴.
2. Zbieraj dane FSC i SSC dla lampy 1 za pomocą liniowych wag wyświetlania. Dostosuj amplifikację każdego detektora tak, aby populacja limfocytów znajdowała się w lewym dolnym kwadrancie wykresu punktowego, nie znajdowała się poza skalą w żadnym parametrze i nie była przerywana z powodu progowania. Zbierz nieprzetworzone dane FSC i SSC dla wszystkich próbek w krokach 3.3 - 3.7.
3. Pozyskaj dane dla lampy 1, bez kompensacji kolorów i logarytmicznych skal wyświetlania dla wszystkich 4 detektorów fluorescencji. Dostosuj wysokie napięcie (HV) każdego detektora, aby umieścić autofluorescencję niebarwionych limfocytów na skali z niewielką liczbą komórek gromadzących się w pierwszym kanale. Ustaw granicę analizy dla każdego histogramu odpowiadającą najjaśniejszym 2% niebarwionych komórek.
4. Korzystając z braku kompensacji kolorów i ustawień HV ustalonych w krokach 3.2 i 3.3, uzyskaj dane dla lampy 2, zbierając FSC, SSC i sygnały we wszystkich 4 detektorach fluorescencyjnych. W przypadku detektora używanego do monitorowania fluorescencji PKH26 sprawdź, czy wszystkie komórki^pos PKH26 pojawiają się na skali jako pojedynczy symetryczny pik w 3-4^dekadzie, z nielicznymi lub żadnymi komórkami w ostatnim kanale. Jeśli występuje wiele pików lub kształt piku jest przekrzywiony, powtórz krok 1, zwracając szczególną uwagę na minimalizację soli i technikę mieszania (rysunek 2). W razie potrzeby dostosuj stężenie barwnika.
5. Korzystając z ustawień ustawionych w kroku 3.3, uzyskaj dane dla lampy 3, zbierając FSC, SSC i sygnały we wszystkich 4 detektorach fluorescencyjnych. W przypadku detektora używanego do monitorowania fluorescencji 7-AAD sprawdź, czy komórki^pos 7-AAD przekraczają granicę 2% ustaloną w kroku 3.3 (tj. czy komórki nieżywotne są dobrze rozdzielone z żywotnych komórek^neg 7-AAD).
6. Korzystając z ustawień ustalonych w kroku 3.3, uzyskaj dane dla lampy 4, zbierając FSC, SSC i sygnały we wszystkich 4 detektorach fluorescencyjnych. Sprawdź, czy komórki^pos CD8 są dobrze rozdzielone z niebarwionych komórek (tj. przekraczają granicę 2% ustaloną w kroku 3.3 dla detektora FITC). Powtórzyć z probówką 5 i sprawdzić, czy komórki^pos CD8 są dobrze rozdzielone z niebarwionych komórek (tj. spadają powyżej granicy 2% ustalonej w kroku 3.3 dla detektora APC).
7. Korzystając z ustawień ustalonych w kroku 3.3, uzyskaj dane dla lamp 6, 7 i 8, zbierając FSC, SSC i sygnały we wszystkich 4 detektorach fluorescencyjnych.
8. Użyj plików trybu listy zebranych dla lamp 1-5 i oprogramowania do kompensacji kolorów, aby ustalić matrycę nakładania się kolorów dla każdego fluorochromu w detektorach używanych do monitorowania trzech pozostałych fluorochromów. Zastosuj tę macierz do pliku trybu listy dla próbki 6 i sprawdź, czy obecność etykietowania PKH26 nie zmienia zdolności wykrywania komórek^pos 7-AAD.
9. Zastosuj macierz nakładania się kolorów z kroku 3.8 do pliku trybu listy dla próbki 7 i sprawdź, czy: a) 3 dobrze rozdzielone subpopulacje (CD3^negCD4^neg, CD3^{posCD4 neg} i CD3^posCD4^pos) można zidentyfikować na wykresie punktowym FITC vs. APC; oraz b) obecność anty-CD3-FITC i anty-CD4-APC nie zmienia zdolności do wykrywania komórek^{7-AAD pos}. Jeśli obecność anty-CD3-FITC zmieni górną granicę 2% dla danych zebranych na detektorze PKH26, w razie potrzeby należy ponownie dostosować granicę.
10. Zastosuj macierz nakładania się kolorów z kroku 3.8 do pliku trybu listy dla próbki 8. Jeżeli obecność oznakowania PKH26 zmienia granicę 2% dla detektorów FITC, 7-AAD lub APC od tych ustawionych za pomocą kontroli autofluorescencji w kroku 3.3, ponownie dostosuj granicę(-y) zgodnie z potrzebami, używając rurki 7 w tabeli 1 i sprawdź, czy nadal można odróżnić CD3^posCD4^pos, CD3^posCD4^neg, i CD3^negCD4^{neg komórki przy} użyciu dostosowanych granic.

4. Wybór modelu proliferacji do monitorowania podziału komórek za pomocą rozcieńczenia barwnika

1. Określ odstępy między pokoleniami, które są zależne od liczby kanałów i dekad logarytmicznych na cytometrze. W przypadku instrumentów cyfrowych wartość ta, zwykle 4 lub 5 dekad, jest określana przez liczbę pojemników w cyfrowym procesorze sygnałowym. W przypadku instrumentów analogowych, w których liczba dekad rzadko jest liczbą całkowitą, dokładne modelowanie wymaga eksperymentalnego wyznaczenia dokładnej liczby dekad. W tym celu dane z mieszaniny skalibrowanych kulek fluorescencyjnych o względnych intensywnościach przypisanych przez producenta są zbierane przy tych samych ustawieniach wysokiego napięcia detektora, które zastosowano w eksperymencie. Położenie pików koralików pozwala na kalibrację skali logarytmicznej pod względem zakresu intensywności na logarytmiczną dekadę. W szczególności odbywa się to poprzez wykreślenie numeru kanału dla każdego typu ściegu w stosunku do logarytmu wartości przypisanej przez producenta. Nachylenie najlepiej dopasowanej linii prostej dla wartości danych ściegu daje liczbę względnych jednostek intensywności na kanał. Pomnożona przez liczbę kanałów, wartość ta będzie następnie liczbą logarytmicznych dekad dla pełnej skali, z której można obliczyć liczbę kanałów odpowiadającą dwukrotnemu spadkowi intensywności (tj. odstępom między generacjami potomnymi)¹⁴.
2. Zdecyduj, czy chcesz użyć stałych odstępów między generacjami, czy pozwolić, aby odstępy były zmienne. Ustawienie standardowe (stałe) użyje wartości odstępów między pokoleniami określonej w kroku 4.5 w celu przypisania lokalizacji każdej generacji i jest zwykle używane, gdy histogram nie ma wyraźnych szczytów. Ustawienie Float umożliwia określenie każdej pozycji piku pokoleniowego za pomocą kształtu histogramu i jest zwykle używane, gdy widoczne są wyraźne piki pokoleniowe.
3. Zdecyduj, czy chcesz użyć stałej szerokości szczytu dla wszystkich generacji, czy szerokości pływającej. Stała szerokość wykorzystuje SD obliczone dla niestymulowanej próby kontrolnej do modelowania wszystkich pokoleń i jest zwykle wybierana, gdy próba nie ma wyraźnych pików pokoleniowych. Zmienna szerokość pozwala programowi na niezależną zmianę SD dla każdej generacji i najlepiej sprawdza się w przypadku rozróżnialnych szczytów pokoleniowych.
4. Uruchom program zawierający moduł analizy proliferacji (tutaj ModFit LT w wersji 3.3). Załaduj stymulowany plik^pos PKH26 z zestawu danych, który ma być analizowany (np. stymulowana 96-godzinna hodowla komórek^pos PKH26 wybarwionych przeciwstawnie, jak dla probówki 8 w tabeli 1).
5. Wybierz parametry do analizy, w tym przypadku PKH26 (585/42) bramkowany na żywotnych (^{7-AAD neg}) limfocytach^pos CD3 i FSC vs. SSC, aby wykluczyć małe zanieczyszczenia i duże agregaty (ryc. 3). Definiując te regiony, należy uważać, aby uwzględnić obszar wysokiego rozproszenia do przodu, w którym zwykle występują wybuchy, i należy pamiętać, że ekspresja CD3 może być modulowana w dół w stymulowanych kulturach.
6. Utwórz nowy model proliferacji za pomocą Kreatora proliferacji. Za pomocą Otwórz plik danych (zakładka Start) załaduj niestymulowany plik^{kontrolny POS} PKH26 i zdefiniuj położenie kanału szczytowego w rozkładzie rodzicielskim odpowiadającego niepodzielonym komórkom.
7. Przeanalizuj plik pod kątem niestymulowanej kontroli^{pos PKH26}, zwracając uwagę na wartości pozycji i szerokości piku rodzicielskiego (odchylenie standardowe). Jeśli wymagana jest stała szerokość piku (SD), zaznacz opcję Zablokuj SD.
8. Załadować kontrolę^neg PKH26 (np. 96-godzinną hodowlę komórek^neg PKH26 wybarwionych przeciwstawnie, jak dla probówki 7 w tabeli 1). Dostosuj liczbę generacji, ustawiając kanał szczytowy dla najciemniejszej generacji powyżej kontrolki^neg PKH26. Określa to liczbę pokoleń potomnych, które model może dokładnie dopasować i zwykle wynosi 6-9 pokoleń.
9. Otwórz plik danych dla stymulowanej próbki (np. stymulowanej 96-godzinnej hodowli komórek^pos PKH26 barwionych przeciwstawnie, jak dla probówki 8 w tabeli 1) i potwierdź, że regiony dla pozycji piku rodzicielskiego i SD, jak określono w kroku 4.7, pozostają niezmienione. Jeśli pożądane są stałe odstępy międzypokoleniowe, wybierz opcję modelu standardowego; w przeciwnym razie wybierz opcję Pływający.
10. Przeanalizuj każdy plik eksperymentalny w zestawie danych, korzystając z tego samego modelu zdefiniowanego w kroku 4.9. Niewielkie korekty pozycji piku rodzicielskiego mogą być konieczne w celu uzyskania najlepszego dopasowania, zdefiniowanego zarówno wizualnie, jak i przez wartość zredukowanego chi-kwadratu (RCS).
11. Rejestruj pożądane wskaźniki proliferacji wynikające z najlepszego dopasowania dla każdego pliku eksperymentalnego w zestawie danych. Aby uzyskać pełny opis możliwych wskaźników, zobacz Ref. 22.

Results

Barwniki błonowe, takie jak PKH26, plamią się przez niemal natychmiastowy podział na błony komórkowe, a nie przez reakcję chemiczną (dla CFSE) lub wiązanie równowagi (dla przeciwciał). Brak uwagi poświęconej krytycznym kwestiom przedstawionym na rysunku 1 może skutkować niejasnym lub niejednorodnym zabarwieniem typu pokazanym na rysunku 2. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie zoptymalizowanych warunków etykietowania (Rysunek 1, Tabela 2) skutkuje jasnymi, jednorodnymi rozkładami odpowiednimi dla różnych zastosowań śledzenia komórek, w tym monitorowania podziału komórek w oparciu o rozcieńczenie barwnika (Rysunek 3). Martwe/umierające komórki tracą różne ilości barwnika śledzącego, co może poszerzyć i/lub zniekształcić intensywność generacji potomnej i skomplikować modelowanie proliferacji oparte na rozcieńczeniu barwnika^3,4,16,18. Stosowanie barwnika żywotności jest zatem zalecane przy zbieraniu danych dotyczących rozcieńczenia barwnika w warunkach, w których może być obecna znaczna liczba martwych komórek, takich jak stymulowane kultury (ryc. 3) lub starsze próbki (ryc. 4).

Ponieważ znakowanie barwnikiem śledzącym zazwyczaj daje intensywność fluorescencji o kilka rzędów wielkości większą niż immunofenotypowanie, ważne jest, aby uwzględnić odpowiednie kontrole kompensacji (Tabela 1) i sprawdzić, czy obecność barwnika śledzącego nie upośledza zdolności do rozpoznawania komórek dodatnich i ujemnych przeciwciał (Rysunek 4). Aby uniknąć konieczności nadmiernej kompensacji kolorów, lepiej jest umieścić jasny fluorochrom lub taki, którego nie ma na interesujących komórkach, taki jak barwnik wykluczony przez żywe komórki, w kanale widmowym (kanałach) przylegającym do barwnika śledzącego (Rysunek 4A&B vs. (4C&D). W przypadku korzystania z oprogramowania do modelowania pików w celu ilościowego określenia zakresu proliferacji, uzyskanie dobrego dopasowania wymaga dopasowania założeń w modelu do charakterystyki analizowanych profili rozcieńczania barwnika (Rysunek 5 i Tabela 3). Dzięki odpowiedniemu doborowi barwników śledzących i odczynników żywotności możliwe jest również scharakteryzowanie odpowiedzi proliferacyjnych w wielu subpopulacjach limfocytów jednocześnie. Na przykład, jak pokazano na rysunku 6, dodanie drugiego barwnika śledzącego upraszcza dyskryminację między limfocytami T regulatorowymi (znakowanymi CellVue Claret) a wysoce proliferowanymi efektorowymi limfocytami T (znakowanymi CFSE) i dostarcza znacznie więcej szczegółów na temat ich interakcji niż można uzyskać przy użyciu znakowania ³H-tymidyny^18,27.

Rysunek 1. Ogólny protokół znakowania membran dla barwników PKH26, PKH67 i CellVue. Podział tych wysoce lipofilowych barwników na błony komórkowe następuje zasadniczo natychmiast po zmieszaniu z komórkami, gdy barwienie odbywa się w bezsolnym nośniku rozcieńczalnika C, dostarczonym w celu maksymalizacji rozpuszczalności barwnika i wydajności barwienia. Jak podsumowano na tym schemacie ogólnego znakowania błony za pomocą PKH26, jasne, jednolite i powtarzalne barwienie jest zatem najłatwiejsze do uzyskania poprzez: 1) zminimalizowanie ilości białka i/lub soli obecnych na etapie barwienia oraz 2) zastosowanie techniki mieszania, która zapewnia szybkie jednorodne rozproszenie komórek w barwniku (tj. jednocześnie wystawia wszystkie komórki na to samo stężenie barwnika).

Rysunek 2. Wpływ warunków barwienia na rozkłady fluorescencji PKH26 (przedruk z Ref. 18). Powtórzone próbki logarytmicznie rosnących, hodowanych komórek U937 barwiono PKH26 (końcowe stężenia: 1 x 10⁷ komórek/ml, 12 - 15 μM PKH26) przez 3 minuty w temperaturze otoczenia, z natychmiastowym mieszaniem lub bez natychmiastowego mieszania po dodaniu 2x komórek do 2x barwnika. Po umyciu wybarwione komórki analizowano na cytometrze przepływowym Beckman Coulter CyAn przy stałych ustawieniach przyrządu. Histogram 1: niebarwiona kontrola z napięciem detektora PKH26 dostosowanym do umieszczenia wszystkich komórek na skali w pierwszej dekadzie, z niewielką liczbą komórek gromadzących się w pierwszym kanale. Histogram 2: barwienie barwnikiem 15 μM przy użyciu dodatku 2x komórek do 2x barwnika z natychmiastowym zmieszaniem spowodowało uzyskanie jasnej, jednorodnie wybarwionej, symetrycznej populacji komórek umieszczonych w czwartej dekadzie, z nielicznymi lub żadnymi komórkami gromadzącymi się w ostatnim kanale (gMFI = 2548, gCV = 26,2%). Histogram 3: barwienie barwnikiem 15 μM przy użyciu dodatku 2x komórek do 2x barwnika, ale bez natychmiastowego mieszania, spowodowało zmniejszenie intensywności i szersze CV (gMFI = 505, gCV = 116%), a także słabo zabarwioną subpopulację, prawdopodobnie z powodu kropli komórek dozowanej na ściankę probówki, a nie do roztworu 2x barwnika. Histogram 4: błąd barwienia doprowadził do tego, że 3 μl skoncentrowanego barwnika etanolowego dodano bezpośrednio do 2x komórek w rozcieńczalniku C bez dalszego mieszania, zamiast użyć do przygotowania 2x roztworu barwnika w rozcieńczalniku C. W ten sposób uzyskano końcowe stężenie barwnika na poziomie 12 μM, ale uzyskano wyjątkowo słabe i niejednorodne zabarwienie (gMFI = 32,9, gCV = 1020%). Obserwowane przekrzywienie w prawo najprawdopodobniej odzwierciedla połączone skutki: i) słabego mieszania z powodu bardzo zróżnicowanych objętości komórek i barwników; oraz ii) fakt, że komórki znajdujące się najbliżej punktu dozowania barwnika byłyby narażone na wyższe stężenie barwnika niż te znajdujące się dalej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 3. Zastosowanie sondy żywotności upraszcza bramkowanie profili proliferacji limfocytów T. hPBMC znakowano PKH26 (końcowe stężenie komórek: 3x10⁷/ml; końcowe stężenie barwnika: 10 μM). Po hodowli przez 96 godzin w obecności (stymulowanej) lub nieobecności (niestymulowanej) anty-CD3 i IL-2, komórki podbarwiano przeciwstawnie anty-CD3-FITC, anty-CD19-APC i 7-AAD i analizowano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (szczegóły w Piśmiennictwie 13). Kompensacja kolorów została przeprowadzona w momencie pozyskiwania danych przy użyciu przewodowych obwodów kompensacyjnych. Zakres proliferacji został zamodelowany zgodnie z opisem w kroku 4 przy użyciu Kreatora proliferacji w ModFit LT3.3. Dane z kontroli^neg PKH26 (Tabela 1, Tuba 7) są nakładane w celach informacyjnych (szare histogramy wypełnione w kolumnie 3). Żywotność dla kultur niestymulowanych i stymulowanych wynosiła 76% i 62% (dane niezainfekowane odpowiednio dla paneli A i B). Panel A. Komórki barwione PKH26 hodowane przez 96 godzin w pożywce bramkowano w celu włączenia żywotnych (^{7-AAD neg}) komórek^pos CD3 (R1). Oprócz inkluzji przeciwciał i bramki wykluczania martwych komórek 7-AAD, zastosowano bramkę rozpraszania do przodu (FSC) w porównaniu z rozpraszaniem bocznym (SSC) (R2) w celu wykluczenia zanieczyszczeń i agregatów. Zwróć uwagę na brak martwych komórek na ostatnim wykresie w tym panelu. Najlepiej dopasowany model dla profilu proliferacji PKH26 (kolumna 3) podał pojedynczy pik o RCS = 2,1 (Dawca 6, Tabela 3), wskazując na dobrą symetrię, i został wykorzystany do zdefiniowania pozycji rodzicielskiej i początkowej szerokości piku do analizy stymulowanej próbki z tego zestawu danych (Panel B). Panel B. Powtórzoną podwielokrotność komórek barwionych PKH26 hodowano z anty-CD3 i IL-2 przez 96 godzin i bramkowano w taki sam sposób, jak w panelu A. Model z pływającą pozycją piku i pływającą szerokością piku dał najlepsze dopasowanie do tych danych z RCS = 1,3 (Donor 6, Tabela 3). Panel C. Ten sam plik danych, co w Panelu A, został przeanalizowany bez użycia danych 7-AAD. Gdy zastosowano pierwotne FSC w porównaniu z SSC w celu częściowego wykluczenia martwych komórek i agregatów (R2) oraz wtórnej bramki w celu wybrania zdarzeń dodatnich CD3 (R3), pozostała niewielka pozostała niewielka pozostała populacja martwych komórek (0,2% zdarzeń bramkowanych). Model najlepiej dopasowany dał pojedynczy pik z RCS = 2,2. Panel D. Ten sam plik danych, co w Panelu B, został bramkowany jak w Panelu C. Zwróć uwagę na większą pozostałą populację martwych komórek w stymulowanej próbce (1,29% zdarzeń bramkowanych) dla tej strategii bramkowania. Najlepiej dopasowanym modelem był model z pływającą pozycją piku i pływającą szerokością piku (RCS = 1,3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Wpływ wyboru fluorochromu i stężenia barwnika na zdolność do immunofenotypu limfocytów znakowanych PKH26. hPBMC wyizolowano z 24-godzinnej krwi i oznaczono PKH26 zgodnie z opisem w kroku 1, z wyjątkiem tego, że barwienie przeprowadzono w probówkach z polistyrenu o okrągłym dnie 12 x 75 mm, a nie w stożkowych probówkach polipropylenowych o wymiarach 12 x 75 mm. Bezpośrednio po znakowaniu PKH26 komórki wybarwiono przeciwstawnie wskazanymi odczynnikami immunofenotypowymi i żywotności oraz przeanalizowano na cytometrze przepływowym LSRFortessa przy użyciu strategii bramkowania z rysunku 3A i następującej konfiguracji optycznej: Laser 488 nm: FSC-A (488 nm); SSC-A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP); PKH26-A (575/26 BP); 7-AAD-A lub PerCP-A (695/40 BP). Laser 640 nm: APC-A lub TOPRO-3-A (670/14 BP). Kompensacja barwy została wykonana w momencie pozyskiwania danych za pomocą oprogramowania BD DiVa. "Auto" oznacza autofluorescencję kontroli bez przeciwciał w odpowiednim oknie spektralnym (APC dla paneli A i B, PerCP dla paneli C i D). Dane z kontroli^neg PKH26 (Tabela 1, Tuba 7) są nakładane w celach informacyjnych (szare histogramy wypełnione, kolumna 5). Żywotność po barwieniu była podobna dla wszystkich próbek (88-92%). Panel A. Komórki znakowane PKH26 w końcowym stężeniu 2 μM były barwione przeciwstawnie za pomocą anty-CD3-FITC, anty-CD4-APC i 7-AAD (probówka 8 w tabeli 3). Po bramkowaniu na żywotnych (^{7-AAD neg}) limfocytach^pos CD3 (kolumna 1) i wykluczeniu szczątków i agregatów na podstawie FSC i SSC (patrz rysunek 3A), intensywność PKH26 oceniano w połączeniu z APC CD4 (kolumny 2 i 3). Niezależnie od tego, czy była nieskompensowana (kolumna 2), czy skompensowana (kolumna 3), ta kombinacja fluorochromu spowodowała dobrą rozdzielczość między limfocytami T^{CD4 pos} i limfocytami T^neg CD4), co zweryfikowano zarówno za pomocą kontroli autofluorescencyjnej bez przeciwciał (probówka 6 w tabeli 1; Kolumna 4) oraz dwukolorowy wykres CD3 vs. CD4 (kolumna 6). Panel B. Użycie tej samej kombinacji fluorochromu co w panelu A, ale zwiększenie końcowego stężenia PKH26 do 4 μM nie wpłynęło negatywnie na zdolność do oddzielania limfocytów T^pos CD4 z limfocytów T^neg CD4. Panel C. Powtórzoną podwielokrotność komórek niezależnie znakowanych PKH26 w końcowym stężeniu 2 μM wybarwiono przeciwwagowo za pomocą anty-CD3-FITC, anty-CD4-PerCP i TOPRO-3. Po bramkowaniu na żywotnych (TOPRO-3^neg) limfocytach^pos CD3 (kolumna 1) i wykluczeniu szczątków i agregatów na podstawie FSC i SSC (patrz rysunek 3A), intensywność PKH26 oceniano w połączeniu z anty-CD4-PerCP (kolumny 2 i 3). Znaczne nakładanie się widmowe PKH26 do kanału PerCP jest widoczne w danych nieskompensowanych (kolumna 2), a rozdzielczość między zdarzeniami PKH26^pos CD4^pos i PKH26^pos CD4^neg jest marginalna po zastosowaniu kompensacji (porównaj kolumnę 3 z kontrolą autofluorescencyjną bez przeciwciał pokazaną w kolumnie 4). Panel D. Gdy stężenie PKH26 wzrośnie do 4 μM, nie jest już możliwe stosowanie kombinacji fluorochromu Panelu C. Nakładanie się widma z PKH26 do kanału PerCP przekracza intensywność sygnału z CD4 (kolumna 2) i CD4^posZdarzenia PKH26^pos nie mogą być już rozwiązane z komórek T^{CD4 neg}PKH26^pos (Kolumna 3 vs. Kolumna 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 5. Wpływ doboru modelu proliferacji na dobroć dopasowania do profili rozcieńczania barwnika. hPBMC znakowano PKH26 (końcowe stężenie komórek: 3x10⁷/ml; końcowe stężenie barwnika: 10 μM). Po hodowli przez 96 godzin w obecności (stymulowanej) lub nieobecności (niestymulowanej) anty-CD3 i IL-2, komórki zebrano pod wpływem przeciwstawnego wybarwienia anty-CD3-FITC, anty-CD19-APC i 7-AAD i analizowano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (szczegółowe metody znajdują się w Piśmiennictwie 13). Kompensacja kolorów została przeprowadzona w momencie pozyskiwania danych przy użyciu przewodowych obwodów kompensacyjnych. Panel A. Profil intensywności PKH26 z niestymulowanej 96-godzinnej hodowli dla dawcy 5, który umiarkowanie zareagował, został bramkowany, jak pokazano na rysunku 3A i wykorzystany do dostarczenia Kreatorowi Proliferacji ModFit pierwszego oszacowania położenia i szerokości piku reprezentującego niepodzielone komórki rodzicielskie. Panel B. Profil intensywności PKH26 z równolegle stymulowanej 96-godzinnej hodowli przeanalizowano przy użyciu początkowych szacunków z Panelu A i 4 różnych kombinacji ustawień "Kreatora proliferacji", odpowiadających stałym lub zmiennym intensywnościom pików oraz stałym lub zmiennym szerokościom pików dla kolejnych pokoleń potomnych, jak pokazano. Jak podsumowano w tabeli 3, model, który najlepiej pasował do obserwowanych danych (najniższy zredukowany chi-kwadrat; RCS) była kombinacją "pływającą/pływającą", w której nie tylko pozycje pików, ale także odchylenia standardowe pików generacji potomnej mogły się zmieniać (RCS = 1,5). Ten sam model okazał się najlepszym wyborem dla Dawcy 6, który szybko reaguje (Ryc. 3B i Tabela 3).

Rysunek 6. Dodanie drugiego barwnika śledzącego komórkę upraszcza dyskryminację między efektorowymi i regulatorowymi limfocytami T w teście tłumienia cytometrii przepływowej (dostosowanym do Ref. 18). Limfocyty zubożone w monocyty przygotowane z filtrów leukaferezy TRIMA wybarwiono anty-CD127-PE, anty-CD4-PE-Cy7 i anty-CD25-APC i posortowano przepływowo do populacji efektorów (Teff; CD4^pos CD127^jasny CD25^{przyciemniony}), regulacyjny (Treg; CD4^pos CD127^przyciemnij CD25^pos) i dodatkowe (^{CD4 neg}) ogniwa. Posortowane komórki Treg znakowane CellVue Claret (końcowe stężenie komórek: 1x10⁶/ml; końcowe stężenie barwnika: 1 μM) i posortowane Teff znakowane CFSE (końcowe stężenie komórek: 5 ×^{10 7}/ml; końcowe stężenie barwnika, 5 μM) hodowano wspólnie w różnych proporcjach w obecności anty-CD3, anty-CD28 i napromieniowanych komórek pomocniczych. Po 96 godzinach zebrano kultury, wybarwiono je anty-CD4-PE-Cy7 i LIVE/DEAD Fixable Violet i przeanalizowano na cytometrze przepływowym LSRII, a w momencie pozyskiwania danych przeprowadzono kompensację barwy za pomocą oprogramowania BD DiVa (patrz odniesienie 18, aby uzyskać szczegółowe informacje, w tym kontrole kompensacji). Wskaźniki proliferacji dla Teff i Treg zostały wymodelowane zgodnie z opisem w kroku 4, przy użyciu Kreatora proliferacji w ModFit LT3.3. Punkty danych w panelach B i C reprezentują średnie odchylenie standardowe ± 1 dla trzech próbek. Panel A. Reprezentatywne dane przedstawiono dla jednej z trzech potrójnych próbek w stosunku Treg:Teff wynoszącym 0,25:1. ŻYWY/MARTWY Odczynnik Fixable Violet został użyty do wykluczenia martwych komórek (R1, lewy górny wykres; komórki pomocnicze = czerwono-brązowe, nieżywotne Teff = szare i nieżywotne Treg = czerwone) ze wszystkich innych wykresów danych. Barwienie CellVue Claret zastosowano w celu odróżnienia żywotnego Treg (R4, środkowy prawy wykres; niebieski) od żywotnego, ale wysoce rozmarżonego Teff (R5, środkowy prawy wykres; zielony). Pojedynczy parametr profilu proliferacji CFSE dla Teff (lewy dolny wykres) został wygenerowany przez bramkowanie na komórkach, które były^{CFSE pos} (R5), CD4^pos (R3), żywotne (nie R1) i miały właściwości rozpraszania limfocytów (R2). Pojedynczy parametr profilu proliferacji CellVue Claret dla Treg został wygenerowany przez bramkowanie na komórkach, które były CellVue Claret^pos (R4), CD4^pos (R3), żywotne (nie R1) i miały właściwości rozpraszania limfocytów (R2). Zwróć uwagę na obfity region limfocytów (R2) zdefiniowany jako obejmujący blasty limfocytów. Należy również zauważyć, że łączna liczba komórek do zebrania zależy od populacji o najniższej częstotliwości. W eksperymencie proliferacji komórek, w którym populacja będąca przedmiotem zainteresowania może być rozmieszczona w szerokim zakresie intensywności reprezentującym do siedmiu lub ośmiu pokoleń, należy zebrać dużą liczbę komórek w celu dokładnego modelowania i obliczenia liczby komórek w każdym pokoleniu. Podczas badania rzadkich komórek może być konieczne po prostu uruchomienie probówki z próbką prawie do sucha, aby zebrać maksymalną możliwą liczbę zdarzeń. W przypadku pokazanej tutaj próbki spowodowało to w sumie ~ 25 000 zdarzeń, z których 11 923 to Teff (wskaźnik proliferacji 3,85), a 1 380 to Treg (wskaźnik proliferacji 1,83). Panel B. Zgodnie z oczekiwaniami, zwiększenie udziału limfocytów Treg obecnych w kokulturach doprowadziło do większego zahamowania proliferacji komórek Teff. Podobne wyniki uzyskano zarówno w przypadku Treg barwionego CellVue Claret (linia ciągła), jak i niebarwionego (linia przerywana), co wskazuje, że barwienie barwnikiem śledzącym CellVue Claret nie wpływało na siłę działania Treg. Panel C. Treg są stosunkowo bezergiczne i, zgodnie z oczekiwaniami, nie proliferują podczas inkubacji z komórkami anty-CD3, anty-CD28 i dodatkowymi przy braku komórek Teff (stosunek Treg:Teff 1:0). Jednak wraz ze wzrostem udziału Teff obecnego w kokulturach (tj. wraz ze spadkiem stosunku Treg do Teff) zwiększył się również zakres proliferacji Treg. Generalnie większe słupki błędów dla tych danych przynajmniej częściowo odzwierciedlają ograniczony zakres proliferacji, co prowadzi do mniejszej liczby zebranych zdarzeń w stosunku do Teff i większej niepewności w modelowaniu liczby komórek w każdym pokoleniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Nr rurki (Przeznaczenie) PKH26 (powiat PKH26) Przeciwciało(-a) 7-AAD 1 (Konfiguracja, kompensacja) - - - 2 (Konfiguracja, kompensacja) + - - 3 (Konfiguracja, kompensacja) - - + 4 (odszkodowanie) - CD8-FITC^b - 5 (odszkodowanie) - CD8-APC^b - 6 (brak kontroli Ab) + - + 7 (brak śledzenia kontroli barwnika) - CD3-FITC CD4-APC lub CD19-APC^c + 8 (sterowanie T0) + CD3-FITC CD4-APC lub CD19-APC^c +

Tabela 1. Elementy sterujące ustawianiem przyrządów^a. ^a Wymienione kontrole są odpowiednie dla 4-kolorowego testu monitorowania proliferacji limfocytów T CD4 z użyciem: PKH26 (barwnik proliferacji), CD3-FITC (marker komórek pan-T), CD4-APC (marker komórek pomocniczych T), 7-aminoaktynomycyna D (7-AAD; wykluczenie martwych komórek). ^b Jaśniejsze substytuty CD3-FITC i CD4-APC (lepsza zdolność do wykrywania błędów kompensacji). ^c Rysunek 3: CD3-FITC i CD19-APC. ^d Rysunek 4: CD3-FITC i CD4-APC.

Typ komórki Końcowe stężenie komórek Końcowe stężenie barwnika odniesienie hPBMC^b 1 x 10⁷/ml 2 μM PKH67 10,17 5 x 10⁶/ml 2 μM PKH26 12 3 x 10⁷/ml 10 μM PKH26 13 5 x 10⁷/ml 30 μM PKH26 Rozdział 18 1 x 10⁶/ml 1 μM CellVue Claret^c Rozdział 18 3 x 10⁷/ml 4 μM CellVue Claret 13 5 x 10⁷/ml 5 μM CellVue Claret Rozdział 18 Komórki w kulturze 5 x 10⁵/ml 0,1 μM PKH26 (1°komórki sutkowe) 8 1 x 10⁷/ml 15 μM PKH26 (U937) Rozdział 18 1 x 10⁷/ml 12,5 -15 μM PKH26 (U937) 15 1 x 10⁷/ml 1 μM PKH67 (K562) Rozdział 18 1 x 10⁷/ml 1 μM PKH67 (linie limfocytów T) 9 1 x 10⁷/ml 10 μM CellVue Claret (YAC-1) 23

Tabela 2. Niezakłócające warunki barwienia barwnikiem membranowym^a. ^a Dostosowane i zaktualizowane z Ref. 18. ^b Zastosowano mycie z małą prędkością (300 x g) w celu zminimalizowania zanieczyszczenia płytek krwi. ^c Limfocyty Treg (posortowane przepływowo limfocyty CD4^posCD25 ^posCD127).

    Ustawienia modelu Wyniki modelu Darczyńca Leczenie Pozycja szczytowa SD Stanowisko rodzicielskie Karta SD rodzica # Szczytów Zamontowanych RCS PI PF 5 Niestymulowany spławik spławik Rozdział 209 Rozdział 4.5 1 5.1 1,0 0 5 Stymulowane stały stały Rozdział 209 Rozdział 4.5 7 35 Rozdział 3,9 Rozdział 31 5 Stymulowane spławik stały Rozdział 209 Rozdział 4.5 8 Rozdział 19 4.3 Rozdział 30 5 Stymulowane stały spławik Rozdział 209 Pytanie 9,2 6 Pytanie 1.9 3.8 Rozdział 30 5 Stymulowane spławik spławik Rozdział 209 9,0 7 1,5 3.7 29 6 Niestymulowany spławik spławik Rozdział 205 Wersja 4.0 1 2.1 1,0 0 6 Stymulowane stały stały Rozdział 205 Wersja 4.0 6 42 Rozdział 42 6,6 60 Rozdział 6 Stymulowane spławik stały Rozdział 205 Wersja 4.0 7 12 7,4 60 Rozdział 6 Stymulowane stały spławik Rozdział 205 8,6 6 6,9 6.8 62 TGLI 6 Stymulowane spławik spławik Rozdział 205 6,5 6 1.3 6,5 59 Rozdział 59

Tabela 3. Wpływ modelu proliferacji na wskaźniki dobroci dopasowania (RCS) i proliferacji ^a. ^a Barwienie próbek, gromadzenie danych i bramkowanie zgodnie z opisem na rysunkach 3A i B.

Discussion

Opisane tutaj metody są tymi, które można znaleźć w naszych połączonych laboratoriach, aby najbardziej wiarygodnie dać optymalne wyniki znakowania hPBMC przy użyciu barwników błonowych^13,16,18 oraz śledzenia fenotypowania i proliferacji podzbioru limfocytów przy użyciu barwników błonowych lub białkowych^{2,11,13,16,18}. Jak pokazano na rysunkach 1 i 2, jasne, jednolite znakowanie najłatwiej osiągnąć poprzez ograniczenie obecności soli fizjologicznych i zastosowanie techniki mieszania, która skutkuje szybką, jednorodną ekspozycją wszystkich komórek na to samo stężenie barwnika. Ponieważ barwienie barwnikami membranowymi odbywa się poprzez podział na dwuwarstwę lipidową, inne zmienne, które zmieniają stężenie wolnego barwnika, mogą również wpływać na skuteczność etykietowania. Na przykład etykietowanie w okrągłodennych tubkach polistyrenowych powoduje mniej efektywne wypłukiwanie soli przed ponownym zawieszeniem w rozcieńczalniku C, a także zmniejszenie stężenia wolnego barwnika w wyniku adsorpcji barwnika na ściankach rury, szczególnie przy niższych stężeniach barwnika. Oba czynniki mają tendencję do dawania szerszego rozkładu barwienia niż w przypadku etykietowania przy użyciu rurek polipropylenowych o stożkowym dnie (ryc. 3, 4 i niepublikowane wyniki). Wiek i rodzaj próbki mogą również wpływać na szerokość piku, nawet jeśli stosowane są zoptymalizowane procedury barwienia. Na przykład CV dla limfocytów PKH26^pos wyizolowanych ze świeżo pobranej krwi waha się od 14-20% (Figura 3, Odnośnik 13 i niepublikowane wyniki), podczas gdy CV dla limfocytów wyizolowanych z 24-godzinnych próbek krwi lub filtrów ferezy TRIMA waha się od 25-30% (Figura 4 i Odnośnik 18).

Jednorodność barwienia i stopień, w jakim komórki niezdolne do życia mogą być wykluczone z analizy, wpływają na to, czy możliwe do rozróżnienia piki potomne są widoczne w profilu rozcieńczenia barwnika, co z kolei wpływa na wybór modelu proliferacji pasującego do obserwowanych danych (ryc. 5 i 6). Chociaż ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) jest tutaj używany jako przykład oprogramowania używanego do generowania wskaźników, takich jak wskaźnik proliferacji i częstotliwość prekursorów (rysunki 3, 5 i 6; Tabela 3), inne pakiety oprogramowania również zawierają moduły do analizy danych dotyczących proliferacji. Należą do nich FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, Kalifornia) i FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, Oregon). Wszystkie te programy wykorzystują nieliniową analizę metodą najmniejszych kwadratów, aby iteracyjnie znaleźć najlepsze dopasowanie do surowych danych poprzez zmianę położenia, wysokości i SD (lub szerokości) szczytów Gaussa reprezentujących sekwencyjne generacje potomne. Wskaźnik proliferacyjny (PI) i częstość występowania prekursorów (PF) są najczęściej stosowanymi miarami zasięgu proliferacji. PI, zgodnie z definicją ModFit, jest miarą wzrostu liczby komórek w trakcie testu, analogiczną do "wskaźnika stymulacji" testu wychwytu tymidyny. PF zwraca frakcję komórek w początkowej populacji, które zareagowały na bodziec poprzez proliferację. Zaleca się jednak ostrożność podczas czytania literatury, ponieważ terminologia różni się nieco w zależności od pakietu oprogramowania (np. FlowJo i ModFit używają różnych definicji i obliczeń dla tego, co rozumie się pod pojęciem "wskaźnika proliferacji")²².

Omówione tutaj krytyczne problemy dotyczące etykietowania i analizy proliferacji za pomocą barwników błonowych występują również podczas stosowania barwników białkowych. Na przykład, należy również zwrócić szczególną uwagę na technikę mieszania, wraz z wykluczeniem martwych/umierających komórek, w celu uzyskania jednorodnych rozkładów i rozróżnialnych pików potomnych podczas korzystania z CFSE (Rysunek 6)^2-4,13,18,24. Odpowiedni dobór fluorochromów do fenotypowania i oceny żywotności jest również ważny, aby uniknąć nadmiernego nakładania się widm i niezdolności do rozpoznania komórek dodatnich pod względem przeciwciał, szczególnie w przypadku widocznych emitujących barwników białkowych, takich jak CFSE^{2-4,11,13,16,18}. Zmniejszenie stężenia barwnika śledzącego zmniejsza problemy z kompensacją w sąsiednich kanałach spektralnych, ale także ogranicza liczbę podziałów komórkowych, które można monitorować, zanim intensywność komórek potomnych zacznie nakładać się na autofluorescencję. Alternatywnie, zastosowanie nowszych barwników śledzących komórki, takich jak CellVue Claret emitujący daleko czerwony (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lub emitujący fiolet CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY) może zmniejszyć problemy z kompensacją (Rysunek 6). Wreszcie, chociaż barwniki błonowe na ogół wykazują mniejszą toksyczność^11,26, możliwe jest nadmierne znakowanie komórek obiema klasami barwników. Dlatego zawsze konieczne jest sprawdzenie, czy stężenie użytego barwnika śledzącego nie zmieniło funkcjonalności komórek, które mają być śledzone (Rysunek 6)^3,13,16,18.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zakupione komercyjnie
7-Aminoactinomycin D	Sigma-Aldrich	A9400
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)	Life Technologies	14175-079	Bez wapnia i magnezu, bez czerwieni
Ludzkie globuliny IgG Cohna frakcji II i III
Mysi anty-ludzki CD3-FITC	BD Biosciences	349201	Stężenie nasycające określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzka CD4-APC	BD Biosciences	340672	Stężenie nasycające określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzka CD4-PECy7	BD Biosciences	348799	Stężenie nasycające określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzka CD8-FITC	BD Biosciences	347313	Stężenie nasycenia określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzka CD8-APC	Caltag (Life Technologies MHCD0805		Stężenie nasycające określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzka CD19-APC	Caltag (Life Technologies)	MHCD1905	Stężenie nasycenia określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzki CD25-APC	BD Biosciences	340938	Stężenie nasycające określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Mysz anty-ludzka CD127-PE	BD Biosciences	557938	Stężenie nasycające określone przez miareczkowanie laboratoryjne
Mysz anty-ludzki CD3	eBiosciences	16-0037-85	1,0 mg / ml; bez azydku
Mysz anty-ludzka CD28	eBiosciences	16-0289-85	1,0 mg/ml; nie zawiera azydku
PBS	Gibco	21300-058
PKH26 zestaw łącznika komórek czerwonej fluorescencji zawierający 10-3M PKH26 w EtOH i rozcieńczalniku C	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT lub MINI26-1KT	Procedury opisane w Kroku 1 dotyczą również zestawów zawierających PKH67 lub inne barwniki
CellVueZestaw łączników komórek fluorescencyjnych CellVue Claret dalekiej czerwieni zawierający 10-3M CellVue Claret w EtOH i rozcieńczalniku C	Sigma-Aldrich	MINCLARET-1KT lub MIDCLARET-1KT
-(i-6)-dioctan 5-(i-6)-karboksyfluoresceiny, ester sukcynimidylu (CFDA-SE)	Invitrogen (Life Technologies)	C34554	Niefluorescencyjny; rozszczepiony przez esterazy błonowe w celu wytworzenia fluorescencyjnych amino-reaktywnych estrów sukcynimidylowych karboksyfluoresceiny (CPSE)
ŻYWY/MARTWY Fixable Violet	Invitrogen (Life Technologies)	L34955
Sterylne stożkowe rurki i nakrętki polipropylenowe 12x75 mm	VWR	60818-102	Zapewnia lepszą wydajność barwienia barwnikiem membranowym (zmniejszona adsorpcja barwnika; mniejsza utrata komórek podczas aspiracji supernatantu)
12x75 mm z okrągłym dnem	Becton Dickinson	21008-936
Cytometr przepływowy	BD Bioscience	FACSCalibur LSRFortessa	Dowolny cytometr zdolny do wykrywania FITC, PKH26 i 7-AAD (np. 488 nm; em. odpowiednio 520 nm, 567 nm i 6555 nm) oraz APC ex. 633-640 nm; em. 660nm)
Cytometr przepływowy	Beckman Coulter	LSRII CyAn	dowolny cytometr zdolny do wykrywania FITC, PKH26 i 7-AAD (np. 488 nm; em. odpowiednio 520 nm, 567 nm i 6555 nm) oraz APC ex 633-640 nm; Em. 660nm)
Laboratory Prepared
7-Aminoactinomycin D, skoncentrowany zapas	NA	NA	1 mg / ml w PBS. Zamrozić w porcjach i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
7-Aminoactinomycin D, zapas roboczy	NA	NA	100 μ g/ml w PBS; przygotowywać codziennie z 1 mg/ml zamrożonego bulionu.
Blok IgG	NA	NA	HBSS + 10 mg / ml Ludzkie globuliny IgG Cohna frakcji II i III + 10 mg / ml BSA.