Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowane metody barwienia i modelowania proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych przy użyciu barwników do śledzenia komórek

38.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4287

⸱

13 grudnia 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Flow and Image Cytometry, Roswell Park Cancer Institute, 2Flow Cytometry & Cell Sorting Resource Laboratory, University of Pennsylvania , 3SciGro, Inc., 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Skuteczne zastosowanie barwników do śledzenia komórek w celu monitorowania funkcji i proliferacji komórek odpornościowych obejmuje kilka krytycznych etapów. Opisujemy metody: 1) uzyskiwania jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania barwnikami błonowymi; 2) wyboru fluorochromów i warunków akwizycji danych; oraz 3) wyboru modelu do ilościowego określania proliferacji komórek na podstawie rozcieńczenia barwnika.

Streszczenie

Fluorescencyjne barwniki do śledzenia komórek, w połączeniu z cytometrią przepływową i obrazową, stanowią potężne narzędzia do badania interakcji i losów różnych typów komórek in vitro oraz in vivo.1-5 Choć istnieje dosłownie tysiące publikacji wykorzystujących takie barwniki, do najczęściej spotykanych zastosowań śledzenia komórek należy monitorowanie:

  1. spoczynek, proliferacja i/lub różnicowanie komórek macierzystych i progenitorowych6-8
  2. antykörper-zależny transfer błonowy9 i/lub proliferacja komórek prekursorowych3,4,10-18 oraz
  3. funkcja komórek efektorowych i regulacyjnych układu odpornościowego1,18-21.

Dostępne w handlu barwniki do śledzenia komórek znacznie różnią się pod względem chemicznym i właściwości fluorescencyjnych, jednak ogromna większość z nich zalicza się do jednej z dwóch klas, w zależności od mechanizmu znakowania komórek. „Barwniki błonowe”, których typowym przedstawicielem jest PKH26, to silnie lipofilowe barwniki, które stabilnie, lecz niekowalencyjnie wbudowują się w błony komórkowe1,2,11. „Barwniki białkowe”, których typowym przedstawicielem jest CFSE, to barwniki aminoreaktywne, które tworzą stabilne wiązania kowalencyjne z białkami komórkowymi4,16,18. Każda z tych klas posiada własne zalety i ograniczenia. Kluczem do ich skutecznego zastosowania, szczególnie w badaniach wielobarwnych, w których wykorzystuje się wiele barwników do śledzenia różnych typów komórek, jest zatem zrozumienie krytycznych kwestii umożliwiających optymalne wykorzystanie każdej z tych klas2-4,16,18,24.

Protokoły zawarte w niniejszej publikacji wskazują na trzy częste przyczyny słabych lub zmiennych wyników podczas stosowania barwników do śledzenia komórek. Są to:

  1. Brak jasnego, jednorodnego i powtarzalnego znakowania. Jest to niezbędny punkt wyjścia dla każdego badania śledzenia komórek, jednak wymaga zwrócenia uwagi na inne zmienne w przypadku stosowania barwników membranowych niż przy użyciu barwników białkowych lub odczynników wiążących w stanie równowagi, takich jak przeciwciała.
  2. Nieoptymalne kombinacje fluorochromów i/lub brak krytycznych kontroli kompensacji. Fluorescencja barwników do śledzenia jest zazwyczaj 102 - 103 razy silniejsza niż fluorescencja przeciwciał. Niezbędne jest zatem zweryfikowanie, czy obecność barwnika do śledzenia nie upośledza możliwości wykrycia innych stosowanych sond.
  3. Brak dobrego dopasowania w oprogramowaniu do modelowania pików. Takie oprogramowanie umożliwia ilościowe porównanie odpowiedzi proliferacyjnych w różnych populacjach lub pod wpływem różnych bodźców na podstawie częstotliwości prekursorów lub innych parametrów. Uzyskanie dobrego dopasowania wymaga jednak wykluczenia martwych i obumierających komórek, które mogą zniekształcać profile rozcieńczania barwnika, oraz uzgodnienia założeń leżących u podstaw modelu z charakterystyką obserwowanego profilu rozcieńczania barwnika.

Przedstawione tutaj przykłady ilustrują, w jaki sposób zmienne te mogą wpływać na wyniki podczas stosowania barwników błonowych i/lub białkowych do monitorowania proliferacji komórek.

Protokół

1. Ogólne znakowanie błony za pomocą barwnika do śledzenia komórek PKH26 (Ref. 25; Rysunek 1)

  1. W krokach 1.1–1.9 stosować technikę sterylną. Przygotować ok. 107 mononuklearnych komórek krwi obwodowej człowieka lub limfocytów (hPBMC, hPBL), korzystając ze standardowej metody laboratoryjnej z dodatkowym wirowaniem przy 300 x g w celu zminimalizowania zanieczyszczenia płytkami krwi. Resuspendować komórki do stężenia 107/ml w HBSS+1% BSA i umieścić na lodzie, odstawiając 500 μl alikwotu (5x106 komórek) do użycia w Kroku 2.
  2. Przenieść 5x106 komórek (500 μl) do stożkowatej probówki polipropylenowej o wymiarach 12 x 75 mm. Przemyć raz 3,5 ml HBSS. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15-25 μl pozostałej cieczy, dbając o to, aby nie usunąć komórek. Tę probówkę wykorzystać do przygotowania 2-krotnej zawiesiny komórek w Kroku 1.4.
  3. Podczas przemywania komórek w Kroku 1.2, dodać 0,5 ml rozcieńczalnika C do znakowania (z zestawu PKH26GL) do stożkowatej probówki polipropylenowej 12 x 75 mm. Tę probówkę wykorzystać do przygotowania 2-krotnego roztworu PKH26 w Kroku 1.5.
  4. Dodać 0,5 ml rozcieńczalnika C do znakowania do osadu z przemytych komórek z Kroku 1.2, a następnie odessać i dozować zawiesinę 3-4 razy w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórkowej (2-krotne stężenie komórek). Należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza i nadmiernego mieszania, co może zmniejszyć żywotność i odzysk komórek.
  5. Niezwłocznie po przygotowaniu 2-krotnej zawiesiny komórek w Kroku 1.4, przygotować 2-krotny (4 μM) roztwór barwnika, dodając 2,0 μl zapasu barwnika PKH26 o stężeniu 1,0 mM w etanolu (z zestawu PKH26GL) do probówki z rozcieńczalnikiem C przygotowanej w Kroku 1.3, a następnie wymieszać w wstrząsarce typu vortex w celu uzyskania jednorodności.
  6. Niezwłocznie po przygotowaniu 2-krotnego roztworu barwnika w Kroku 1.5, szybko przenieść 2-krotną zawiesinę komórek z Kroku 1.4 do 2-krotnego roztworu barwnika, jednocześnie odsysając i dozując zawiesinę 3-4 razy, aby całkowicie rozproszyć komórki w barwniku. Nie należy: dodawać barwnika 1,0 mM bezpośrednio do komórek; wlewać 2-krotnej zawiesiny komórek do 2-krotnego roztworu barwnika; ani dodawać 2-krotnej zawiesiny komórek do 2-krotnego roztworu barwnika podczas mieszania w vortexie. Ponieważ barwienie następuje niemal natychmiastowo, takie metody dają mniej jednorodne natężenie barwienia niż metoda zalecana (Rycina 2).
  7. Po 1 min dodać 1,0 ml surowicy inaktywowanej termicznie lub HBSS+5% BSA, aby zatrzymać pobieranie barwnika przez błony komórkowe. Niedostateczna ilość białka stwarza ryzyko powstania agregatów barwnika, które mogą osadzać się wraz z komórkami podczas etapów przemywania i powodować niezamierzone znakowanie innych komórek obecnych w eksperymencie. Jeśli jako odczyn zatrzymujący ma być użyte medium z 10% surowicą inaktywowaną termicznie (CM) lub HBSS+1% BSA, barwienie należy przeprowadzić w stożkowatej probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml i dodać co najmniej 5,0 ml odczynu zatrzymującego, aby zapewnić adsorpcję całego niewkorzystanego barwnika.
  8. Odwirować znakowane komórki przez 5 min przy ~400 x g. Ostrożnie odessać supernatant, nie usuwając komórek. Przemyć osad dwukrotnie 4 ml CM lub HBSS+1% BSA, dobrze rozbijając osad przed ponownym wirowaniem. Aby zminimalizować przenoszenie barwnika zaadsorbowanego na ściankach probówki i maksymalnie zwiększyć wydajność przemywania, po pierwszej resuspensji przenieść komórki do nowej probówki polipropylenowej. Uwaga: prawidłowo zabarwione komórki będą wykazywać wyraźny różowy odcień w osadzie.
  9. Resuspendować przemyty osad komórkowy w 1,0 ml HBSS+1% BSA. Policzyć komórki, określić stopień ich odzysku i dostosować objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 107/ml. Przy ostrożnym odsysaniu odzysk komórek powinien wynosić ≥85%. Jeśli odzysk komórek wynosi < 70%, przed dalszym postępowaniem należy ustalić przyczynę. Pobrać 150 μl alikwotu (1,5x106 komórek) i umieścić na lodzie do użycia w Kroku 2.

2. Przygotowanie instrumentu i kontroli konfiguracji analizy (Tabela 1)

  1. Do każdej z pięciu probótek Eppendorf 1,8 ml (oznaczonych numerami 1, 3, 4, 5 i 7) odnieś 50 μl (5x105) niebarwionych komórek z zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 1.1. Do trzech probótek (2, 6 i 8) odnieś 50 μl (5x105) komórek PKH26pos z kroku 1.9.
  2. Do probótek 1-8 dodaj 10 μl bloku IgG (100 μg IgG na probówkę; patrz tabela odczynników) i inkubuj przez 10 min w temperaturze pokojowej (20-25 °C).
  3. Do probótek 4, 5, 7 i 8 dodaj nasycającą ilość przeciwciał wskazanych w Tabeli 1; wszystkie próbki (probótki 1-8) inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem.
  4. Do wszystkich próbek dodaj 1,5 ml HBSS+1% BSA, odwirowaj komórki (5 min @ 400 x g) i przemyj raz 1,5 ml HBSS+1% BSA, ostrożnie aspirując znad osadu, aby uniknąć utraty komórek.
  5. Każdą próbkę resuspenduj w 500 μl HBSS+1% BSA. Jeśli jest to wymagane do analizy na użytym cytometrze, przenieś próbki do probótek z okrągłym dnem o wymiarach 12 x 75 mm. Do probótek 3, 6, 7 i 8 dodaj 10 μl codziennego roztworu roboczego 7-AAD o stężeniu 100 μg/ml (patrz tabela odczynników), zgodnie ze wskazaniami w Tabeli 1. Inkubuj na lodzie przez 30 min przed użyciem do konfiguracji cytometru przepływowego i weryfikacji barwienia (Krok 3).

3. Konfiguracja cytometru przepływowego i weryfikacja barwienia

  1. Zweryfikuj prawidłowe działanie cytometru przepływowego, stosując ustalone w laboratorium procedury codziennej kontroli jakości. Upewnij się, że sygnały są łatwo wykrywalne w każdym z używanych okien spektralnych oraz że odpowiedzi detektorów są liniowo proporcjonalne do intensywności sygnału w oknie wykorzystywanym do monitorowania proliferacji14.
  2. Nacquired dane FSC vs. SSC dla Probówki 1, korzystając z liniowych skal wyświetlania. Dostosuj wzmocnienie każdego detektora tak, aby populacja limfocytów znajdowała się w dolnym lewym kwadracie wykresu kropkowego, nie wykraczała poza skalę w żadnym z parametrów i nie była ucinana przez próg detekcji (thresholding). Zbierz niebramkowane dane FSC vs. SSC dla wszystkich próbek w Krokach 3.3 – 3.7.
  3. Nacquired dane dla Probówki 1, nie stosując kompensacji kolorów i korzystając z logarytmicznych skal wyświetlania dla wszystkich 4 detektorów fluorescencji. Dostosuj wysokie napięcie (HV) każdego detektora tak, aby autofluorescencja niebarwionych limfocytów mieściła się w skali, przy czym w pierwszym kanale powinno gromadzić się niewiele lub żadne komórki. Wyznacz granicę analizy dla każdego histogramu odpowiadającą najjaśniejszym 2% niebarwionych komórek.
  4. Bez stosowania kompensacji kolorów i przy ustawieniach HV ustalonych w Krokach 3.2 i 3.3, naacquired dane dla Probówki 2, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji. W przypadku detektora służącego do monitorowania fluorescencji PKH26 sprawdź, czy wszystkie komórki PKH26pos pojawiają się w skali jako pojedynczy symetryczny pik w 3rd-4th dekadzie, z niewielką ilością lub brakiem komórek w ostatnim kanale. Jeśli występują wiele pików lub kształt piku jest skośny, powtórz Krok 1, zwracając szczególną uwagę na minimalizację ilości soli i technikę mieszania (Rysunek 2). W razie potrzeby dostosuj stężenie barwnika.
  5. Przy ustawieniach ustalonych w Kroku 3.3, naacquired dane dla Probówki 3, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji. W przypadku detektora służącego do monitorowania fluorescencji 7-AAD sprawdź, czy komórki 7-AADpos znajdują się powyżej granicy 2% ustalonej w Kroku 3.3 (t.j. czy komórki nieżywe są dobrze oddzielone od żywych komórek 7-AADneg).
  6. Przy ustawieniach ustalonych w Kroku 3.3, naacquired dane dla Probówki 4, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji. Sprawdź, czy komórki CD8pos są dobrze oddzielone od komórek niebarwionych (t.j. znajdują się powyżej granicy 2% ustalonej w Kroku 3.3 dla detektora FITC). Powtórz czynność dla Probówki 5 i upewnij się, że komórki CD8pos są dobrze oddzielone od komórek niebarwionych (t.j. znajdują się powyżej granicy 2% ustalonej w Kroku 3.3 dla detektora APC).
  7. Przy ustawieniach ustalonych w Kroku 3.3, naacquired dane dla Probówek 6, 7 i 8, zbierając FSC, SSC oraz sygnały ze wszystkich 4 detektorów fluorescencji.
  8. Wykorzystaj pliki w trybie list (list mode) zebrane dla Probówek 1-5 oraz oprogramowanie do kompensacji kolorów, aby stworzyć macierz nakładania się kolorów dla każdego fluorochromu w detektorach używanych do monitorowania trzech pozostałych fluorochromów. Zastosuj tę macierz do pliku w trybie list dla Próbki 6 i zweryfikuj, czy obecność znakowania PKH26 nie zmienia możliwości wykrywania komórek 7-AADpos.
  9. Zastosuj macierz nakładania się kolorów z Kroku 3.8 do pliku w trybie list dla Próbki 7 i sprawdź, czy: a) na wykresie kropkowym FITC vs. APC można zidentyfikować 3 dobrze oddzielone subpopulacje (CD3negCD4neg, CD3posCD4neg oraz CD3posCD4pos); oraz b) obecność przeciwciał anti-CD3-FITC i anti-CD4-APC nie zmienia możliwości wykrywania komórek 7-AADpos. Jeśli obecność anti-CD3-FITC zmienia górną granicę 2% dla danych zebranych na detektorze PKH26, skoryguj granicę zgodnie z potrzebami.
  10. Zastosuj macierz nakładania się kolorów z Kroku 3.8 do pliku w trybie list dla Próbki 8. Jeśli obecność znakowania PKH26 zmienia granicę 2% dla detektorów FITC, 7-AAD lub APC w stosunku do granic ustalonych przy użyciu kontroli autofluorescencji w Kroku 3.3, skoryguj granice w razie potrzeby, korzystając z Probówki 7 z Tabeli 1, i zweryfikuj, czy nadal możliwe jest rozróżnienie komórek CD3posCD4pos, CD3posCD4neg oraz CD3negCD4neg przy użyciu skorygowanych granic.

4. Wybór modelu proliferacji do monitorowania podziałów komórkowych poprzez rozcieńczanie barwnika

  1. Wyznacz odstępy między generacjami, który zależą od liczby kanałów i dekad logarytmicznych w cytometrze. W instrumentach cyfrowych wartość ta, zazwyczaj 4 lub 5 dekad, jest określona przez liczbę koszy (bins) w cyfrowym procesorze sygnałów. W instrumentach analogowych, gdzie liczba dekad rzadko jest liczbą całkowitą, dokładne modelowanie wymaga eksperymentalnego wyznaczenia precyzyjnej liczby dekad. W tym celu dane z mieszaniny skalibrowanych kulek fluorescencyjnych o przypisanych przez producenta intensywnościach względnych są pozyskiwane przy tych samych ustawieniach wysokiego napięcia detektora, które zastosowano w eksperymencie. Położenie pików kulek pozwala na kalibrację skali logarytmicznej w przeliczeniu na zakres intensywności na dekadę logarytmiczną. Konkretnie wykonuje się to poprzez wykreślenie numeru kanału dla każdego typu kulek względem logarytmu wartości przypisanej przez producenta. Nachylenie linii prostej najlepiej dopasowanej do danych z kulek wskazuje liczbę jednostek intensywności względnej na kanał. Wartość ta, pomnożona przez liczbę kanałów, będzie stanowiła liczbę dekad logarytmicznych dla pełnej skali, z której można obliczyć liczbę kanałów odpowiadającą dwukrotnemu spadkowi intensywności (tj. odstęp między generacjami potomnymi)14.
  2. Zdecyduj, czy zastosować stały odstęp między generacjami, czy pozwolić na odstęp zmienny. Ustawienie Standard (stałe) wykorzystuje wartość odstępu generacyjnego wyznaczoną w kroku 4.5 do określenia położenia każdej generacji i jest zazwyczaj stosowane, gdy histogram nie posiada wyraźnych pików. Ustawienie Float pozwala na wyznaczenie pozycji każdego piku generacyjnego na podstawie kształtu histogramu i jest zazwyczaj stosowane, gdy widoczne są rozróżnialne piki generacyjne.
  3. Zdecyduj, czy zastosować stałą szerokość piku dla wszystkich generacji, czy szerokość zmienną. Stała szerokość wykorzystuje SD obliczoną dla niestymulowanej próbki kontrolnej do modelowania wszystkich generacji i jest zazwyczaj wybierana, gdy próbka nie posiada rozróżnialnych pików generacyjnych. Szerokość zmienna pozwala programowi na niezależną zmianę SD dla każdej generacji i najlepiej sprawdza się przy rozróżnialnych pikach generacyjnych.
  4. Uruchom program zawierający moduł analizy proliferacji (w tym przypadku ModFit LT wersja 3.3). Załaduj plik stymulowanych komórek PKH26pos ze zbioru danych do analizy (np. stymulowaną 96-godzinną hodowlę komórek PKH26pos z barwieniem kontrastowym zgodnie z procedurą dla probówki nr 8 w Tabeli 1).
  5. Wybierz parametry analizy, w tym przypadku PKH26 (585/42) z bramkowaniem na żywe (7-AADneg) limfocyty CD3pos oraz FSC vs. SSC w celu wykluczenia małych zanieczyszczeń i dużych agregatów (Rysunek 3). Definiując te obszary, należy pamiętać o uwzględnieniu obszaru wysokiego rozproszenia światła w przód, gdzie zazwyczaj znajdują się blasty, oraz zwrócić uwagę, że ekspresja CD3 może być obniżona w hodowlach stymulowanych.
  6. Utwórz nowy model proliferacji za pomocą Kreatora Proliferacji (Proliferation Wizard). Używając opcji Open Data File (karta Start), załaduj plik kontrolny niestymulowanych komórek PKH26pos i określ położenie kanału piku w rozkładzie rodzicielskim odpowiadające niepodzielonym komórkom.
  7. Przeanalizuj plik dla niestymulowanej kontroli PKH26pos, odnotowując wartości położenia piku rodzicielskiego i jego szerokości (odchylenia standardowego). Jeśli pożądana jest stała szerokość piku (SD), zaznacz Lock SD.
  8. Załaduj kontrolę PKH26neg (np. 96-godzinną hodowlę komórek PKH26neg z barwieniem kontrastowym zgodnie z procedurą dla probówki nr 7 w Tabeli 1). Dostosuj liczbę generacji, ustawiając kanał piku dla najsłabiej fluorescencyjnej generacji powyżej kontroli PKH26neg. Wyznacza to liczbę generacji potomnych, które model może dokładnie dopasować, co zazwyczaj wynosi od 6 do 9 generacji.
  9. Otwórz plik danych dla próbki stymulowanej (np. stymulowanej 96-godzinnej hodowli komórek PKH26pos z barwieniem kontrastowym zgodnie z procedurą dla probówki nr 8 w Tabeli 1) i potwierdź, że obszary dla położenia piku rodzicielskiego oraz SD zdefiniowane w kroku 4.7 nie uległy zmianie. Jeśli pożądany jest stały odstęp generacyjny, wybierz opcję modelu Standard; w przeciwnym razie wybierz opcję Floating.
  10. Przeanalizuj każdy plik eksperymentalny w zbiorze danych, korzystając z tego samego modelu zdefiniowanego w kroku 4.9. W celu uzyskania najlepszego dopasowania, określanego zarówno wizualnie, jak i za pomocą zredukowanej wartości chi kwadrat (RCS), mogą być konieczne niewielkie korekty położenia piku rodzicielskiego.
  11. Zapisz wymagane wskaźniki proliferacji wynikające z najlepszego dopasowania dla każdego pliku eksperymentalnego w zbiorze danych. Pełny opis możliwych wskaźników znajduje się w ref. 22.

Wyniki

Barwniki membranowe, takie jak PKH26, barwią poprzez niemal natychmiastowy rozdział do błon komórkowych, a nie w wyniku reakcji chemicznej (jak w przypadku CFSE) lub wiązania równowagowego (jak w przypadku przeciwciał). Brak uwagi poświęconej krytycznym kwestiom przedstawionym na Rysunku 1 może doprowadzić do słabego lub niejednorodnego barwienia, takiego jak pokazano na Rysunku 2. Z kolei zastosowanie zoptymalizowanych warunków znakowania (Rysunek 1, Tabela 2) prowadzi do uzyskania jasnego, jednorodnego rozkładu, odpowiedniego dla różnorodnych zastosowań w śledzeniu komórek, w tym monitorowania podziałów komórkowych w oparciu o rozcieńczenie barwnika (Rysunek 3). Martwe lub obumierające komórki tracą różną ilość barwnika śledzącego, co może poszerzać i/lub zniekształcać intensywność sygnału w generacjach potomnych oraz komplikować modelowanie proliferacji oparte na rozcieńczeniu barwnika3,4,16,18. Dlatego zaleca się stosowanie barwnika żywotności podczas gromadzenia danych o rozcieńczeniu barwnika w warunkach, w których mogą występować znaczne liczby martwych komórek, np. w kulturach stymulowanych (Rysunek 3) lub starszych próbkach (Rysunek 4).

Ponieważ znakowanie barwnikiem śledzącym zazwyczaj daje intensywność fluorescencji o kilka rzędów wielkości większą niż w przypadku immunofenotypowania, ważne jest zastosowanie odpowiednich kontroli kompensacji (Tabela 1) oraz zweryfikowanie, czy obecność barwnika śledzącego nie upośledza zdolności do rozróżnienia komórek przeciwciałowo-dodatnich i ujemnych (Rysunek 4). Aby uniknąć konieczności nadmiernej kompensacji kolorów, zaleca się umieszczenie jasnego fluorochromu lub takiego, który nie występuje na analizowanych komórkach (np. barwnika wykluczanego przez żywe komórki), w kanałach spektralnych sąsiadujących z barwnikiem śledzącym (Rysunek 4A&B vs. 4C&D). Podczas korzystania z oprogramowania do modelowania szczytów w celu ilościowego określenia zakresu proliferacji, uzyskanie dobrego dopasowania wymaga dostosowania założeń modelu do charakterystyki analizowanych profili rozcieńczania barwnika (Rysunek 5 oraz Tabela 3). Przy odpowiednim doborze barwników śledzących i odczynników do oceny żywotności możliwe jest również jednoczesne scharakteryzowanie odpowiedzi proliferacyjnej w wielu subpopulacjach limfocytów. Na przykład, jak pokazano na Rysunku 6, dodanie drugiego barwnika śledzącego upraszcza rozróżnienie między limfocytami T regulatorowymi (znakowanymi CellVue Claret) a silnie proliferującymi efektorowymi limfocytami T (znakowanymi CFSE) i dostarcza znacznie więcej szczegółów na temat ich interakcji, niż można by uzyskać przy użyciu znakowania 3H-tymidyną18,27.

Proces znakowania komórek barwnikiem PKH26; schemat zawiesiny komórkowej, mieszania z barwnikiem i etapów inkubacji.
Rysunek 1. Ogólny protokół znakowania błon za pomocą barwników PKH26, PKH67 i CellVue. Wbudowywanie tych silnie lipofilnych barwników w błony komórkowe następuje niemal natychmiast po zmieszaniu z komórkami, gdy barwienie jest przeprowadzane w dostarczonym bezsolnym rozcieńczalniku Diluent C, który maksymalizuje rozpuszczalność barwnika i wydajność barwienia. Jak przedstawiono na tym schemacie ogólnego znakowania błon barwnikiem PKH26, jasne, jednorodne i powtarzalne barwienie najłatwiej uzyska poprzez: 1) zminimalizowanie ilości białek i/lub soli obecnych na etapie barwienia oraz 2) zastosowanie techniki mieszania, która zapewnia szybkie, homogeniczne rozproszenie komórek w barwniku (tj. jednoczesne wystawienie wszystkich komórek na to samo stężenie barwnika).

Histogramy cytometrii przepływowej, analiza fluorescencji PKH26, rozkład populacji komórek, dane eksperymentalne.
Rysunek 2. Wpływ warunków barwienia na rozkłady fluorescencji PKH26 (reprint z Ref. 18). Próbki powtórne hodowlanych komórek U937 w fazie wzrostu logarytmicznego barwiono PKH26 (stężenia końcowe: 1 x 107 komórek/ml, 12 - 15 μM PKH26) przez 3 min w temperaturze otoczenia, z natychmiastowym mieszaniem lub bez niego po dodaniu 2x komórek do 2x barwnika. Po przemyciu zabarwione komórki analizowano na cytometrze przepływowym Beckman Coulter CyAn przy stałych ustawieniach instrumentu. Histogram 1: kontrola niezabarwiona z napięciem detektora PKH26 ustawionym tak, aby wszystkie komórki mieściły się w skali w pierwszej dekadzie, z niewielką lub żadną liczbą komórek gromadzących się w pierwszym kanale. Histogram 2: barwienie przy stężeniu barwnika 15 μM poprzez dodanie 2x komórek do 2x barwnika z natychmiastowym mieszaniem doprowadziło do powstania jasnej, homogenicznie zabarwionej, symetrycznej populacji komórek umieszczonej w czwartej dekadzie, z niewielką lub żadną liczbą komórek gromadzących się w ostatnim kanale (gMFI = 2548, gCV = 26,2%). Histogram 3: barwienie przy stężeniu barwnika 15 μM poprzez dodanie 2x komórek do 2x barwnika, ale bez natychmiastowego mieszania, skutkowało zmniejszoną intensywnością i szerszym CV (gMFI = 505, gCV = 116%) oraz słabo zabarwioną subpopulacją, co prawdopodobnie wynikało z osadzenia się kropel komórek na ściance probówki zamiast w roztworze 2x barwnika. Histogram 4: błąd podczas barwienia polegający na dodaniu 3 μl skoncentrowanego etanolowego roztwaku barwnika bezpośrednio do 2x komórek w Diluent C bez dalszego mieszania, zamiast użycia go do przygotowania roztworu 2x barwnika w Diluent C. Skutkowało to końcowym stężeniem barwnika 12 μM, lecz dało niezwykle słabe i heterogeniczne zabarwienie (gMFI = 32,9, gCV = 1020%). Obserwowana prawostronna skośność najprawdopodobniej odzwierciedla połączone efekty: i) słabego mieszania z powodu znacznych różnic w objętościach komórek i barwnika; oraz ii) faktu, że komórki znajdujące się najbliżej miejsca dozowania barwnika były narażone na wyższe stężenie barwnika niż te położone dalej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Analizy cytometrii przepływowej żywotności komórek przy użyciu 7-AAD i bramkowania FSC-SSC; porównanie warunków.
Rycina 3. Zastosowanie sondy żywotności upraszcza bramkowanie profili proliferacji limfocytów T. hPBMC oznakowano barwnikiem PKH26 (końcowe stężenie komórek: 3x107/ml; końcowe stężenie barwnika: 10 μM). Po hodowli przez 96 h w obecności (stymulowane) lub w nieobecności (niestymulowane) przeciwciał anty-CD3 i IL-2, komórki poddano barwieniu kontrastowemu przeciwciałami anty-CD3-FITC, anty-CD19-APC oraz 7-AAD, a następnie analizowano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (szczegóły w Odnośniku 13). Kompensację kolorów przeprowadzono w czasie akwizycji danych przy użyciu wbudowanych układów kompensacyjnych. Zakres proliferacji zamodelowano zgodnie z opisem w Kroku 4, korzystając z narzędzia Proliferation Wizard w programie ModFit LT3.3. Dane z kontroli PKH26neg (Tabela 1, probówka 7) naniesiono dla odniesienia (szare wypełnione histogramy w kolumnie 3). Żywotność kultur niestymulowanych i stymulowanych wyniosła odpowiednio 76% i 62% (dane niebramkowane dla paneli A i B). Panel A. Komórki barwione PKH26 hodowane przez 96 h w medium poddano bramkowaniu w celu wyodrębnienia żywotnych (7-AADneg) komórek CD3pos (R1). Oprócz bramki włączającej przeciwciała i bramki wykluczającej martwe komórki 7-AAD, zastosowano bramkę rozproszenia światła w przód (FSC) względem rozproszenia światła bocznego (SSC) (R2), aby wykluczyć zanieczyszczenia i agregaty. Zwróć uwagę na brak martwych komórek na ostatnim wykresie w tym panelu. Model najlepiej dopasowany dla profilu proliferacji PKH26 (kolumna 3) wykazał pojedynczy peak z RCS = 2,1 (Donicor 6, Tabela 3), co wskazuje na dobrą symetrię; posłużył on do zdefiniowania pozycji rodzicielskiej i początkowej szerokości peaku dla analizy próbki stymulowanej z tego zestawu danych (Panel B). Panel B. Replikat alikwoty komórek barwionych PKH26 hodowano z anty-CD3 i IL-2 przez 96 h i bramkowano w ten sam sposób, co w Panelu A. Model z pływającą pozycją peaku i pływającą szerokością peaku zapewnił najlepsze dopasowanie dla tych danych z RCS = 1,3 (Donicor 6, Tabela 3). Panel C. Ten sam plik danych co w Panelu A przeanalizowano bez użycia danych 7-AAD. Gdy do częściowego wykluczenia martwych komórek i agregatów użyto pierwotnej bramki FSC vs. SSC (R2), a do wyboru zdarzeń CD3-dodatnich bramki wtórnej (R3), pozostała niewielka resztkowa populacja martwych komórek (0,2% zdarzeń bramkowanych). Model najlepiej dopasowany wykazał pojedynczy peak z RCS = 2,2. Panel D. Ten sam plik danych co w Panelu B poddano bramkowaniu analogicznie jak w Panelu C. Zwróć uwagę na większą resztkową populację martwych komórek w próbce stymulowanej (1,29% zdarzeń bramkowanych) przy tej strategii bramkowania. Modelem najlepiej dopasowanym był model z pływającą pozycją peaku i pływającą szerokością peaku (RCS = 1,3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Analiza cytometrii przepływowej; analiza danych komórek barwionych PKH26; żywotność, detekcja CD3, kompensacja.
Rysunek 4. Wpływ wyboru fluorochromu i stężenia barwnika na możliwość immunofenotypowania limfocytów znakowanych PKH26. hPBMC wyizolowano z krwi po 24 godzinach i znakowano PKH26 zgodnie z opisem w Kroku 1, z wyjątkiem tego, że barwienie przeprowadzono w polistyrenowych probówkach o okrągłym dnie 12 x 75 mm zamiast stożkowych probówek z polipropylenu 12 x 75 mm. Bezpośrednio po znakowaniu PKH26 komórki poddano przeciwbarwieniu z użyciem wskazanych odczynników do immunofenotypowania i oceny żywotności, a następnie analizowano na cytometrze przepływowym LSRFortessa, stosując strategię bramkowania z Rysunku 3A i następującą konfigurację optyczną: laser 488 nm: FSC-A (488 nm); SSC-A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP); PKH26-A (575/26 BP); 7-AAD-A lub PerCP-A (695/40 BP). Laser 640 nm: APC-A lub TOPRO-3-A (670/14 BP). Kompensację kolorów wykonano w czasie akwizycji danych przy użyciu oprogramowania BD DiVa. „Auto” oznacza autofluorescencję kontroli bez przeciwciał w odpowiednim oknie widmowym (APC dla paneli A i B, PerCP dla paneli C i D). Dla odniesienia nałożono dane z kontroli PKH26neg (Tabela 1, probówka 7) (szare wypełnione histogramy, kolumna 5). Żywotność po barwieniu była podobna dla wszystkich próbek (88-92%). Panel A. Komórki znakowane PKH26 w stężeniu końcowym 2 μM poddano przeciwbarwieniu za pomocą anty-CD3-FITC, anty-CD4-APC oraz 7-AAD (probówka 8 z Tabeli 3). Po bramkowaniu żywotnych (7-AADneg) limfocytów CD3pos (kolumna 1) i wykluczeniu debris oraz agregatów na podstawie FSC i SSC (patrz Rysunek 3A), oceniono intensywność PKH26 w połączeniu z APC CD4 (kolumny 2 i 3). Niezależnie od tego, czy dane były niekompensowane (kolumna 2), czy kompensowane (kolumna 3), ta kombinacja fluorochromów zapewniła dobrą rozdzielczość między limfocytami T CD4pos a limfocytami T CD4neg, co potwierdzono zarówno w kontroli bez przeciwciał (autofluorescencyjnej) (probówka 6 z Tabeli 1; kolumna 4), jak i na dwukolorowym wykresie CD3 vs. CD4 (kolumna 6). Panel B. Zastosowanie tej samej kombinacji fluorochromów co w panelu A, ale zwiększenie końcowego stężenia PKH26 do 4 μM, nie wpłynęło negatywnie na możliwość rozróżnienia limfocytów T CD4pos od limfocytów T CD4neg. Panel C. Powtórzoną alikwot komórek niezależnie znakowanych PKH26 w stężeniu końcowym 2 μM poddano przeciwbarwieniu za pomocą anty-CD3-FITC, anty-CD4-PerCP oraz TOPRO-3. Po bramkowaniu żywotnych (TOPRO-3neg) limfocytów CD3pos (kolumna 1) i wykluczeniu debris oraz agregatów na podstawie FSC i SSC (patrz Rysunek 3A), oceniono intensywność PKH26 w połączeniu z anty-CD4-PerCP (kolumny 2 i 3). Znaczny overlap widmowy PKH26 do kanału PerCP jest widoczny w danych niekompensowanych (kolumna 2), a rozdzielczość między zdarzeniami PKH26pos CD4pos a PKH26pos CD4neg jest marginalna po zastosowaniu kompensacji (porównaj kolumnę 3 z kontrolą bez przeciwciał/autofluorescencyjną pokazaną w kolumnie 4). Panel D. Przy zwiększeniu stężenia PKH26 do 4 μM nie jest już możliwe zastosowanie kombinacji fluorochromów z panelu C. Overlap widmowy PKH26 do kanału PerCP przekracza intensywność sygnału z CD4 (kolumna 2), a zdarzeń CD4pos PKH26pos nie można już odróżnić od limfocytów T CD4neg PKH26pos (kolumna 3 vs. kolumna 4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Histogramy cytometrii przepływowej; analiza proliferacji komórek, barwnik PKH26; stymulowane vs. niestymulowane.
Rysunek 5. Wpływ wyboru modelu proliferacji na jakość dopasowania profili rozcieńczania barwnika. Komórki hPBMC znakowano barwnikiem PKH26 (końcowe stężenie komórek: 3x107/ml; końcowe stężenie barwnika: 10 μM). Po 96 h hodowli w obecności (stymulowane) lub przy braku (niestymulowane) przeciwciał anty-CD3 i IL-2, komórki zebrano i poddano barwieniu kontrastowemu przeciwciałami anty-CD3-FITC, anty-CD19-APC oraz 7-AAD, a następnie analizowano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (szczegółowe metody opisano w Referencji 13). Kompensacja kolorów była wykonywana podczas akwizycji danych przy użyciu wbudowanych układów kompensacyjnych. Panel A. Profil intensywności PKH26 z niestymulowanej 96-godzinnej hodowli od Dawcy 5, umiarkowanego respondenta, wyznaczono za pomocą bramkowania zgodnie z Rysunkiem 3A i wykorzystano do dostarczenia programowi ModFit Proliferation Wizard wstępnej oceny położenia i szerokości piku reprezentującego niepodzielone komórki macierzyste. Panel B. Profil intensywności PKH26 z równoległej stymulowanej 96-godzinnej hodowli przeanalizowano, korzystając z wstępnych szacunków z Panelu A oraz czterech różnych kombinacji ustawień „Proliferation Wizard”, odpowiadających stałej lub zmiennej intensywności piku oraz stałej lub zmiennej szerokości piku dla kolejnych pokoleń potomnych, jak pokazano. Jak podsumowano w Tabeli 3, model, który zapewnił najlepsze dopasowanie do obserwowanych danych (najniższa zredukowana wartość chi-kwadrat; RCS), był kombinacją „zmienna/zmienna”, w której dopuszczono zmianę nie tylko pozycji piku, ale także odchyleń standardowych piku pokoleń potomnych (RCS = 1.5). Ten sam model zapewnił najlepsze dopasowanie dla Dawcy 6, silnego respondenta (Rysunek 3B oraz Tabela 3).

Diagramy i wykresy z cytometrii przepłyewej przedstawiające analizę stosunku Treg:Teff oraz wyniki indeksu proliferacji.
Rycina 6. Dodanie drugiego barwnika do śledzenia komórek upraszcza rozróżnianie między efektorowymi a regulacyjnymi limfocytami T w teście supresji metodą cytometrii przepłyewej (adaptacja z Ref. 18). Limfocyty po usunięciu monocytów, przygotowane z filtrów leukaferezy TRIMA, barwiono przeciwciałami anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7 oraz anti-CD25-APC, a następnie sortowano metodą przepływową na populacje komórek efektorowych (Teff; CD4pos CD127bright CD25dim), regulacyjnych (Treg; CD4pos CD127dim CD25pos) i akcesoryjnych (CD4neg). Posortowane komórki Treg oznakowane barwnikiem CellVue Claret (końcowe stężenie komórek: 1x106/ml; końcowe stężenie barwnika: 1 μM) oraz posortowane komórki Teff oznakowane CFSE (końcowe stężenie komórek: 5 × 107/ml; końcowe stężenie barwnika: 5 μM) współhodowano w różnych stosunkach w obecności anti-CD3, anti-CD28 i napromieniowanych komórek akcesoryjnych. Po 96 h hodowle zebrano, zabarwiono wtórnie przeciwciałami anti-CD4-PE-Cy7 oraz barwnikiem LIVE/DEAD Fixable Violet, a następnie analizowano na cytometrze przepływowym LSRII; kompensację kolorystyczną przeprowadzono podczas akwizycji danych przy użyciu oprogramowania BD DiVa (szczegóły, w tym kontrole kompensacji, znajdują się w Referencji 18). Indeksy Proliferacji dla Teff i Treg modelowano zgodnie z opisem w Kroku 4, używając narzędzia Proliferation Wizard w programie ModFit LT3.3. Punkty danych na panelach B i C reprezentują średnią ± 1 odchylenie standardowe z próbek wykonanych w trzech powtórzeniach. Panel A. Przedstawiono reprezentatywne dane dla jednej z trzech próbek powtórzonych przy stosunku Treg:Teff wynoszącym 0,25:1. Odczynnik LIVE/DEAD Fixable Violet zastosowano do wykluczenia martwych komórek (R1, wykres w lewym górnym rogu; komórki akcesoryjne = czerwono-brązowe, nieżywe Teff = szare i nieżywe Treg = czerwone) ze wszystkich pozostałych wykresów danych. Barwienie CellVue Claret wykorzystano do odróżnienia żywych Treg (R4, wykres po prawej stronie w centrum; niebieskie) od żywych, ale silnie proliferujących Teff (R5, wykres po prawej stronie w centrum; zielone). Jednoparametrowy profil proliferacji CFSE dla Teff (wykres w lewym dolnym rogu) wygenerowano poprzez bramkowanie komórek, które były CFSEpos (R5), CD4pos (R3), żywe (nie R1) i posiadały właściwości rozproszenia charakterystyczne dla limfocytów (R2). Jednoparametrowy profil proliferacji CellVue Claret dla Treg wygenerowano poprzez bramkowanie komórek, które były CellVue Claretpos (R4), CD4pos (R3), żywe (nie R1) i posiadały właściwości rozproszenia charakterystyczne dla limfocytów (R2). Zwróć uwagę na szeroki obszar limfocytów (R2), zdefiniowany tak, aby objął blasty limfocytarne. Należy również zauważyć, że całkowita liczba komórek do zebrania zależy od najniższej częstotliwości występowania interesującej nas populacji. W eksperymencie dotyczącym proliferacji komórek, gdzie interesująca populacja może być rozłożona w szerokim zakresie intensywności reprezentującym od siedmiu do ośmiu generacji, należy zebrać dużą liczbę komórek, aby dokładnie zamodelować i obliczyć liczbę komórek w każdej generacji. Podczas badania rzadkich komórek może być konieczne niemal całkowite opróżnienie probówki z próbką, aby zebrać maksymalną możliwą liczbę zdarzeń. W przypadku próbki pokazanej tutaj, działanie to pozwoliło na zebranie łącznie ~25 000 zdarzeń, z czego 11 923 stanowiły Teff (Indeks Proliferacji 3,85), a 1 380 stanowiły Treg (Indeks Proliferacji 1,83). Panel B. Zgodnie z oczekiwaniami, zwiększenie proporcji Treg w współhodowlach prowadziło do silniejszej supresji proliferacji komórek Teff. Podobne wyniki uzyskano zarówno dla Treg barwionych CellVue Claret (linia ciągła>), jak i niebarwionych (linia przerywana>), co wskazuje, że barwienie barwnikiem śledzącym CellVue Claret nie wpłynęło na potencjał Treg. Panel C. Treg są względnie anergiczne i, zgodnie z oczekiwaniami, nie proliferowały podczas inkubacji z anti-CD3, anti-CD28 i komórkami akcesoryjnymi wobec braku komórek Teff (stosunek Treg:Teff 1:0). Jednak wraz ze wzrostem proporcji Teff obecnych we współhodowlach (t.j. wraz ze spadkiem stosunku Treg:Teff), zakres proliferacji Treg również wzrastał. Ogólnie większe słupki błędów dla tych danych odzwierciedlają przynajmniej częściowo ograniczony zakres proliferacji, co prowadzi do zebrania mniejszej liczby zdarzeń w stosunku do Teff i większej niepewności w modelowaniu liczby komórek w każdej generacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Nr probówki (Cel)PKH26Przeciwciała7-AAD
1 (Konfiguracja, kompensacja)---
2 (Konfiguracja, kompensacja)+--
3 (Konfiguracja, kompensacja)--+
4 (kompensacja)-CD8-FITCb-
5 (kompensacja)-CD8-APCb-
6 (kontrola bez przeciwciał)+-+
7 (kontrola bez barwnika śledzącego)-CD3-FITC CD4-APC lub CD19-APCc+
8 (kontrola T0)+CD3-FITC CD4-APC lub CD19-APCc+

Tabela 1. Kontrole konfiguracji instrumentua. a Wymienione kontrole są odpowiednie dla 4-kolorowego testu monitorowania proliferacji limfocytów T CD4 z użyciem: PKH26 (barwnik proliferacyjny), CD3-FITC (marker pan-T), CD4-APC (marker limfocytów T pomocniczych), 7-aminoaktynominy D (7-AAD; wykluczanie martwych komórek). b Jaśniejsze zamienniki dla CD3-FITC i CD4-APC (lepsza zdolność wykrywania błędów kompensacji). c Rysunek 3: CD3-FITC i CD19-APC. d Rysunek 4: CD3-FITC i CD4-APC.

Typ komórekKońcowe stężenie komórekKońcowe stężenie barwnikaReferencja
hPBMCb1 x 107/ml2 μM PKH6710,17
5 x 106/ml2 μM PKH2612
3 x 107/ml10 μM PKH2613
5 x 107/ml30 μM PKH2618
1 x 106/ml1 μM CellVue Claretc18
3 x 107/ml4 μM CellVue Claret13
5 x 107/ml5 μM CellVue Claret18
Komórki w hodowli5 x 105/ml0.1 μM PKH26 (komórki gruczołu piersiowego 1°)8
1 x 107/ml15 μM PKH26 (U937)18
1 x 107/ml12.5 -15 μM PKH26 (U937)15
1 x 107/ml1 μM PKH67 (K562)18
1 x 107/ml1 μM PKH67 (linie komórek T)9
1 x 107/ml10 μM CellVue Claret (YAC-1)23

Tabela 2. Warunki niezakłócającego barwienia błony barwnikiema. a Adaptowano i zaktualizowano na podstawie Ref. 18. b Użyto płukania przy niskiej prędkości (300 x g), aby zminimalizować zanieczyszczenie płytkami krwi. c Komórki Treg (limfocyty CD4posCD25posCD127neg wyizolowane metodą sortowania przepływowego).

  Ustawienia modeluWyniki modelu
DarczyńcaPróbaPołożenie pikuSDPołożenie rodzicielskieRodzicielskie SDLiczba dopasowanych pikówRCSPIPF
5NiepobudzonaZmienneZmienne2094.515.11.00
5PobudzonaStałeStałe2094.57353.931
5PobudzonaZmienneStałe2094.58194.330
5PobudzonaStałeZmienne2099.261.93.830
5PobudzonaZmienneZmienne2099.071.53.729
6NiepobudzonaZmienneZmienne2054.012.11.00
6PobudzonaStałeStałe2054.06426.660
6PobudzonaZmienneStałe2054.07127.460
6PobudzonaStałeZmienne2058.666.96.862
6PobudzonaZmienneZmienne2056.561.36.559

Tabela 3. Wpływ modelu proliferacji na dobroć dopasowania (RCS) oraz wskaźniki proliferacji a. a Barwienie próbek, gromadzenie danych i bramkowanie zgodnie z opisem w Rysunku 3A i B.

Dyskusja

Metody opisane w niniejszym opracowaniu są tymi, które w naszych laboratoriach najskuteczniej zapewniają optymalne wyniki przy znakowaniu hPBMC przy użyciu barwników membranowych13,16,18 oraz przy fenotypowaniu subpopulacji limfocytów i śledzeniu ich proliferacji przy użyciu barwników membranowych lub białkowych2,11,13,16,18. Jak pokazano na rysunkach 1 i 2, jasne i jednorodne znakowanie najłatwiej uzyskać poprzez ograniczenie obecności soli fizjologicznych i zastosowanie techniki mieszania, która skutkuje szybką, homogeniczną ekspozycją wszystkich komórek na to samo stężenie barwnika. Ponieważ barwienie barwnikami membranowymi polega na wbudowywaniu się w dwuwarstwę lipidową, inne zmienne zmieniające stężenie wolnego barwnika mogą również wpływać na wydajność znakowania. Na przykład znakowanie w polistyrenowych probówkach z okrągłym dnem skutkuje mniej wydajnym wypłukiwaniem soli przed resuspensją w Diluent C, a także obniżeniem stężenia wolnego barwnika ze względu na adsorpcję barwnika na ściankach probówki, szczególnie przy niższych stężeniach barwnika. Oba czynniki mają tendencję do wywoływania szerszego rozkładu barwienia niż w przypadku znakowania w polipropylenowych probówkach z dnem stożkowym (rysunki 3, 4 oraz nieopublikowane wyniki). Wiek i rodzaj próbki mogą również wpływać na szerokość piku, nawet przy zastosowaniu zoptymalizowanych procedur barwienia. Na przykład wartości CV dla limfocytów PKH26pos wyizolowanych ze świeżo pobranej krwi mieszczą się w zakresie 14-20% (rysunek 3, Ref. 13 i nieopublikowane wyniki), podczas gdy wartości CV dla limfocytów wyizolowanych z próbek krwi 24-godzinnych lub filtrów do aferezy TRIMA mieszczą się w zakresie 25-30% (rysunek 4 i Ref. 18).

Jednorodność barwienia oraz stopień, w jakim nieżywe komórki mogą zostać wykluczone z analizy, wpływają na to, czy w profilu rozcieńczania barwnika widoczne są rozróżnialne piki komórek potomnych, co z kolei wpływa na wybór modelu proliferacji dopasowanego do zaobserwowanych danych (Rysunki 5 i 6). Chociaż w niniejszym opisie jako przykład oprogramowania służącego do generowania takich wskaźników jak indeks proliferacji (Proliferation Index) i częstotliwość prekursorów (Precursor Frequency) wykorzystano ModFit (Verity Software House, Topsham, ME) (Rysunki 3, 5 i 6; Tabela 3), inne pakiety oprogramowania również zawierają moduły do analizy danych o proliferacji. Należą do nich FCSExpress (De Novo Software, Los Angeles, CA) oraz FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR). Wszystkie te programy wykorzystują nieliniową analizę najmniejszych kwadratów, aby iteracyjnie znaleźć najlepsze dopasowanie do surowych danych poprzez zmianę położenia, wysokości i SD (lub szerokości) pików Gaussa reprezentujących kolejne pokolenia potomne. Indeks proliferacji (PI) i częstotliwość prekursorów (PF) są najczęściej stosowanymi miarami zakresu proliferacji. PI, zgodnie z definicją w ModFit, jest miarą wzrostu liczby komórek w czasie trwania analizy, analogicznie do „indeksu stymulacji” w teście wbudowywania tymidyny. PF określa frakcję komórek w populacji początkowej, które odpowiedziały na bodziec poprzez proliferację. Zaleca się jednak ostrożność podczas analizy literatury, ponieważ terminologia różni się w zależności od pakietu oprogramowania (np. FlowJo i ModFit stosują różne definicje i obliczenia dla pojęcia „indeks proliferacji”)22.

Kluczowe kwestie omówione tutaj w kontekście znakowania i analizy proliferacji za pomocą barwników błonowych występują również podczas stosowania barwników białkowych. Na przykład, aby uzyskać jednorodne rozmieszczenie i rozróżnialne piki komórek potomnych przy użyciu CFSE (Rysunek 6)2-4,13,18,24, należy zwrócić szczególną uwagę na technikę mieszania oraz na wykluczenie komórek martwych i obumierających. Ważny jest również odpowiedni dobór fluorochromów do fenotypowania i oceny żywotności, aby uniknąć nadmiernego nakładania się widm oraz niemożności rozpoznania komórek pozytywnych pod kątem przeciwciał, szczególnie w przypadku barwników białkowych emitujących w zakresie widzialnym, takich jak CFSE2-4,11,13,16,18. Zmniejszenie stężenia barwnika śledzącego redukuje problemy z kompensacją w sąsiednich kanałach spektralnych, ale ogranicza również liczbę podziałów komórkowych, które można monitorować, zanim intensywność świecenia komórek potomnych zacznie nakładać się na autofluorescencję. Alternatywnie, zastosowanie nowszych barwników do śledzenia komórek, takich jak emitujący w dalekiej czerwieni CellVue Claret (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lub emitujący w kolorze fioletowym CellTrace Violet (Life Technologies, Grand Island, NY), może zmniejszyć problemy z kompensacją (Rysunek 6). Wreszcie, choć barwniki błonowe zazwyczaj wykazują mniejszą toksyczność11,26, możliwe jest nadmierne oznakowanie komórek barwnikami z obu grup. Dlatego zawsze konieczne jest zweryfikowanie, czy zastosowane stężenie barwnika śledzącego nie zmieniło funkcjonalności śledzonych komórek (Rysunek 6)3,13,16,18.

Oświadczenia

K. Humphrey, J.D. Tario, Jr. oraz P.K. Wallace otrzymali do oceny przedkomercyjne odczynniki do śledzenia komórek od firm Life Technologies, Inc. i BD Biosciences. A.D. Bantly i J.S. Moore otrzymali do oceny przedkomercyjne odczynniki do śledzenia komórek od Life Technologies, Inc. oraz finansowanie od PTI Research, Inc. na przedkomercyjną charakterystykę różnych barwników do śledzenia komórek CellVue. K. Muirhead jest zatrudniony w SciGro, Inc., która świadczy usługi konsultacyjne dla Phanos Technologies, Inc. (właściciela barwników PKH i CellVue) oraz zapewnia wsparcie techniczne dla Sigma-Aldrich i Molecular Targeting Technologies, Inc. (dystrybutorów tych barwników).
Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Sigma-Aldrich.

Podziękowania

Autorzy chcieliby w szczególności podziękować następującym osobom za ich wkład techniczny i intelektualny w opracowanie tych metod na przestrzeni lat: Bruce Bagwell (Verity Software House), Nadège Bercovici (IDM), Lizanne Breslin (Zynaxis Cell Science oraz PTI Research), Brian Gray (PTI Research), Jan Fisher (Dartmouth Medical School), Alice Givan (Dartmouth Medical School), Betsy Ohlsson-Wilhelm (SciGro, Inc.) oraz Mary Waugh (Dartmouth Medical School). Chciałyby również podziękować studentom klasy Bowdoin z 2006 roku uczestniczącym w corocznych kursach Metod Badań i Zastosowań Cytometrii Przepływowej, którzy wygenerowali dane przedstawione na Rycini 2.

Cytometria przepływowa została przeprowadzona w Laboratorium Cytometrii Przepływowej Instytutu Nowotworów Roswell Park, które powstało częściowo dzięki grantom na sprzęt z programu NIH Shared Instrument Program i otrzymuje wsparcie z grantu Core Grant (5 P30 CA016056-29) z National Cancer Institute dla Instytutu Nowotworów Roswell Park, a także w Laboratorium Zasobów Cytometrii Przepływowej i Sortowania Komórek Centrum Nowotworów Abramson Uniwersytetu Pensylwanii, które powstało częściowo dzięki grantom na sprzęt z programu NIH Shared Instrument Program i otrzymuje wsparcie z grantu NIH #2P30 CA016520 z National Cancer Institute. Prace przedstawione na Rysunkach 3 i 5 były również częściowo wspierane przez grant SBIR EB00228 z National Institutes of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) przyznany dla PTI Research, Inc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nabyte komercyjnie
7-aminoaktynomicyna Dfigure-materials-1 Sigma-AldrichA9400
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)figure-materials-2 Sigma-AldrichA4503
Surowica płodowa bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Life Technologies14175-079wolny od wapnia i magnezu, bez czerwieni fenolowej
Globuliny ludzkie IgG z frakcji Cohn II i IIIfigure-materials-3 Sigma-AldrichG-4386
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD3-FITCBD Biosciences349201Stężenie nasycenia wyznaczone metodą miareczkowania laboratoryjnego
przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD4-APCBD Biosciences340672Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego
Przeciwciało mysie przeciw ludzkiemu CD4-PECy7BD Biosciences348799Stężenie nasycenia określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD8-FITCBD Biosciences347313Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego
przeciwciało mysie anty-ludzkie CD8-APCCaltag (Life Technologies)MHCD0805Stężenie nasycenia określone za pomocą miareczkowania laboratoryjnego
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD19-APCCaltag (Life Technologies)MHCD1905Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD25-APCBD Biosciences340938Stężenie nasycenia określone metodą miareczkowania laboratoryjnego
Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD127-PEBD Biosciences557938Stężenie nasycenia wyznaczone metodą miareczkowania laboratoryjnego
Przeciwciało mysie anty-ludzkie CD3eBiosciences16-0037-851,0 mg/mL; bez azotku
Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD28eBiosciences16-0289-851,0 mg/mL; bez azotku
bufor fosforanowo-solnyGibco21300-058
zestaw do znakowania komórek czerwoną fluorescencją PKH26 zawierający PKH26 w stężeniu 10-3M w EtOH oraz rozcieńczalnik C (Diluent C)figure-materials-4 Sigma-AldrichPKH26GL-1KT
lub
MINI26-1KT		Procedury opisane w kroku 1 mają zastosowanie również do zestawów zawierających PKH67 lub inne barwniki CellVue
Zestaw do znakowania komórek fluorochromem CellVue Claret w zakresie czerwieni dalekiej, zawierający 10-3M CellVue Claret w EtOH oraz rozcieńczalnik Diluent Cfigure-materials-5 Sigma-AldrichMINCLARET-1KT lub MIDCLARET-1KT
5-(i-6)-karboksyfluoresceiny diestrynian, ester sukcynimidylowy (CFDA-SE)Invitrogen (Life Technologies)C34554Niefluorescencyjny; rozszczepiany przez esterazy błonowe do formy fluorescencyjnego, aminoreaktywnego estru karboksyfluoresceiny z sukcynimidem (CFSE)
LIVE/DEAD Fixable VioletInvitrogen (Life Technologies)L34955
Sterylne probówki stożkowe 12x75 mm
probówki polipropylenowe & zaślepki 		VWR60818-102Zapewnia lepszą efektywność barwienia membranowego barwnikiem (zredukowana adsorpcja barwnika; mniejsza utrata komórek podczas aspiracji supernatantu)
12x75 mm z okrągłym dnem
probówki polistyrenowe		Becton Dickinson21008-936
Cytometr przepływowy BD BioscienceFACSCalibur
LSRFortessa
Dowolny cytometr zdolny do detekcji FITC, PKH26 i 7-AAD (odpowiednio wzb. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm i 655 nm) oraz APC (wzb. 633-640 nm; em. 660 nm)
Cytometr przepływowy Beckman CoulterLSRII CyAnDowolny cytometr zdolny do detekcji FITC, PKH26 i 7-AAD (odpowiednio: wzb. 488 nm; em. 520 nm, 567 nm i 655 nm) oraz APC (wzb. 633–640 nm; em. 660 nm)
Przygotowane w laboratorium
7-aminoaktynominycyna D,
stężony roztwór zapasowy		Brak danychNA1 mg/mL w PBS. Zamrozić w alikwotach i przechowywać w temperaturze -20 °C.
7-aminoaktynomycyna D,
roztwór roboczy		Brak danychND100 μg/mL w PBS; przygotowywać codziennie z mrożonego roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/ml.
Blokowanie IgGNDNDHBSS + 10 mg/mL ludzkie globuliny IgG (frakcja Cohn II i III) + 10 mg/mL BSA.

Bibliografia

  1. Poon, R. Y., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Bagwell, C. B., Muirhead, K. A. Use of PKH Membrane Intercalating Dyes to Monitor Cell Trafficking and Function. Living Color: Flow Cytometry and Cell Sorting Protocols. Diamond, R. A., DeMaggio, S. , Springer-Verlag. New York, NY. 302-352 (2000).
  2. Wallace, P. K., Muirhead, K. A. Cell Tracking 2007: A Proliferation of Probes and Applications. Immunol. Invest. 36, 527-562 (2007).
  3. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2, 2057-2067 (2007).
  4. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  5. Bolton, D. L., Minang, J. T., Trivett, M. T., Song, K., Tuscher, J. J., Li, Y., Piatak, M., O'Connor, D., Lifson, J. D., Roederer, M., Ohlen, C. Trafficking, Persistence, and Activation State of Adoptively Transferred Allogeneic and Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones during Acute and Chronic Infection of Rhesus Macaques. J. Immunol. 184, 303-314 (2010).
  6. Juopperi, T. A., Sharkis, S. J. Isolation of Quiescent Murine Hematopoietic Stem Cells by Homing Properties. Meth. Mol. Biol. 430, 21-30 (2008).
  7. Kusumbe, A. P., Bapat, S. A. Cancer stem cells and aneuploid populations within developing tumors are the major determinants of tumor dormancy. Cancer Res. 69, 9245-9253 (2009).
  8. Pece, S., Tosonim, D., Confalonieri, S., Mazzarol, G., Vecchi, M., Ronzoni, S., Bernard, L., Viale, G., Pelicci, P. G., Fiore, P. P. D. i Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content. Cell. 140, 62-73 (2010).
  9. Gertner-Dardenne, J., Poupot, M., Gray, B. D., Fournié, J. -J. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol. Invest. 36, 665-685 (2007).
  10. Bercovici, N., Givan, A. L., Waugh, M. G., Fisher, J. L., Vernel-Pauillac, F., Ernstoff, M. S., Abastado, J. P., Wallace, P. K. Multiparameter precursor analysis of T-cell responses to antigen. J. Immunol. Methods. 276, 5-17 (2003).
  11. Givan, A. L., Fisher, J. L., Waugh, M. G., Bercovici, N., Wallace, P. K. Use of cell-tracking dyes to determine proliferation precursor frequencies of antigen-specific T cells. Methods Mol. Biol. 263, 109-124 (2004).
  12. Schwaab, T., Tretter, C. P., Gibson, J. J., Cole, B. F., Schned, A. R., Harris, R., Fisher, J. L., Crosby, N., Stempkowski, L. M., Heaney, J. A., Ernstoff, M. S. Tumor-related immunity in prostate cancer patients treated with human recombinant granulocyte monocyte-colony stimulating factor (GM-CSF). Prostate. 66 (6), 667-674 (2006).
  13. Bantly, A. D., Gray, B. D., Breslin, E., Weinstein, E. G., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Moore, J. S. CellVue Claret, a New Far-Red Dye, Facilitates Polychromatic Assessment of Immune Cell Proliferation. Immunol. Invest. 36, 581-605 (2007).
  14. Givan, A. L. A flow cytometric assay for quantitation of rare antigen-specific T-cells: using cell-tracking dyes to calculate precursor frequencies for proliferation. Immunol. Invest. 36, 563-580 (2007).
  15. Tario, J. D., Gray, B. D., Wallace, S. S., Muirhead, K. A., Ohlsson-Wilhelm, B. M., Wallace, P. K. Novel lipophilic tracking dyes for monitoring cell proliferation. Immunol Invest. 36, 861-885 (2007).
  16. Wallace, P. K., Tario, J. D. Jr, Fisher, J. L., Wallace, S. S., Ernstoff, M. S., ,, Muirhead, K. A. Tracking Antigen-Driven Responses by Flow Cytometry: Monitoring Proliferation by Dye Dilution. Cytometry. 73, 1019-1034 (2008).
  17. Barth, R. J., Fisher, D. A., Wallace, P. K., Channon, J. Y., Noelle, R. L., Gui, J., Ernstoff, M. S. A Randomized Trial of Ex vivo CD40L Activation of a Dendritic Cell Vaccine in Colorectal Cancer Patients: Tumor-Specific Immune Responses Are Associated with Improved Survival. Clin. Cancer Res. 16, 5548-5556 (2010).
  18. Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M., Wallace, P. K. Tracking Immune Cell Proliferation and Cytotoxic Potential Using Flow Cytometry. Meth. Mol. Biol. 699, 119-164 (2011).
  19. Fuse, S., Underwood, E. Simultaneous Analysis of In Vivo CD8+ T Cell Cytotoxicity Against Multiple Epitopes using Multicolor Flow Cytometry. Immunol. Invest. 36, 829-845 (2007).
  20. Schütz, C., Fleck, M., Mackensen, A., Zoso, A., Halbritter, D., Schneck, J. P., Oelke, M. Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells. Blood. 111, 3546-3552 (2008).
  21. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev. Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  22. Roederer, M. Interpretation of cellular proliferation data: Avoid the panglossian. Cytometry. 79A, 95-101 (2011).
  23. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. J. Vis. Exp. (44), e2259(2010).
  24. PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits for General Cell Membrane Labeling [Internet]. , Sigma-Aldrich. Available from: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/mini26bul.Par.0001.File.tmp/mini26bul.pdf (2012).
  25. Houlihan, D. D., Newsome, P. N. Critical Review of Clinical Trials of Bone Marrow Stem Cells in Liver Disease. Gastroenterology. 135, 438-450 (2008).
  26. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory. T Cells. Immunol. Invest. 36, 607-628 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytometria przep ywowabarwniki b onowebarwniki bia kowekompensacja kolor woprogramowanie do modelowania pik wprofil rozcie czania barwnikasubpopulacje kom rek odporno ciowychprzeciwcia a fluorescencyjne

Powiązane artykuły