Test plackowy dla mysiego norowirusa

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowego oznaczania cząstek zakaźnych norowirusa mysiego (MNV), który jest jedynym norowirusem efektywnie replikującym się w hodowlach komórkowych. Metoda płytkowa wykorzystuje tropizm MNV do makrofagów mysich i może zostać dostosowana do analizy próbek biologicznych lub środowiskowych zawierających MNV.

Streszczenie

Musi norowirus (MNV) jest jedynym przedstawicielem rodzaju Norovirus, który efektywnie namnaża się w hodowlach tkankowych ^{1, 2}. Podczas infekcji MNV-1 mysich komórek dendrytycznych lub makrofagów obserwuje się lizę komórek oraz efekt cytopatyczny (CPE) ¹. Właściwość ta MNV-1 może być wykorzystana do ilościowego oznaczenia liczby cząsteczek zakaźnych w danej próbce poprzez wykonanie testu plackowego ¹. Test plackowy opiera się na zdolności MNV-1 do lizy komórek i tworzenia w zwartym monowarstwie komórek ubytków, nazywanych plakami ³.

Do wykrywania infekcji wirusowych w hodowlach tkankowych, pobranych tkankach, próbkach klinicznych i środowiskowych można stosować wiele technik, jednak nie wszystkie z nich mierzą liczbę cząsteczek zakaźnych (np. qRT-PCR). Jednym ze sposobów ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa jest wykonanie testu plackowego ³, który zostanie szczegółowo opisany poniżej. Wariantem testu plackowego dla MNV jest test ognisk fluorescencyjnych, w którym antygen MNV jest barwiony immunofluorescencyjnie w monowarstwach komórkowych ⁴. Ten test może być szybszy, ponieważ ekspresja antygenu wirusowego poprzedza powstanie placków. Jest on również przydatny do miareczkowania wirusów niezdolnych do tworzenia placków. Jednak test ognisk fluorescencyjnych wymaga dodatkowych zasobów ponad te niezbędne w teście plackowym, takich jak przeciwciała oraz mikroskop do zliczania jednostek tworzących ogniska. Zakaźny MNV można również ilościowo oznaczyć poprzez wyznaczenie 50% zakaźnej dawki dla hodowli tkankowej (TCID₅₀) ³. Test ten mierzy ilość wirusa wymaganą do wywołania efektu cytopatycznego (CPE) w 50% inokulowanych komórek hodowli tkankowej poprzez miareczkowanie punktu końcowego ⁵. Jednak jego granica wykrywalności jest wyższa w porównaniu z testem plackowym ⁴.

W niniejszym artykule opisujemy protokół testu plackowego, który może być wykorzystany do skutecznego oznaczenia liczby zakaźnych cząsteczek MNV obecnych w próbkach biologicznych lub środowiskowych ^{1, 4, 6}. Metoda ta opiera się na przygotowaniu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych próbek zawierających MNV, które są wykorzystywane do inokulacji monowarstwy komórek podatnych (linie komórkowe makrofagów mysich RAW 264.7). Wirusowi pozwala się przytwierdzić do monowarstwy komórek przez określony czas, a następnie jest on odessany przed pokryciem komórek mieszaniną agarozy i pożywki hodowlanej. Agar umożliwia rozprzestrzenianie się potomstwa wirusa na sąsiednie komórki, ograniczając jednocześnie rozprzestrzenianie się do komórek oddalonych. W rezultacie zakażone komórki ulegają lizie i tworzą w monowarstwie ubytki znane jako placki. Po dostatecznym rozprzestrzenieniu się wirusa placki stają się widoczne po zabarwieniu komórek barwnikami, takimi jak czerwień neutralna, błękit metylenowy lub fiolet krystaliczny. Przy niskich rozcieńczeniach każdy plack pochodzi od jednej zakaźnej cząsteczki wirusa i jej potomstwa, które rozprzestrzeniło się na sąsiednie komórki. Zatem policzenie liczby placków pozwala obliczyć jednostki tworzące placki (PFU) obecne w nierozcieńczonej próbce ³.

Protokół

1. Hodowla linii komórkowej makrofagów RAW 264.7

1. Hodować komórki RAW 264.7 (ATCC, katalog # TIB-71) w pożywce DMEM-10, składającej się z DMEM z wysoką zawartością glukozy z dodatkiem 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (< 10 EU/ml), 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM nieessentialnych aminokwasów oraz 2 mM L-glutaminy. Komórki zazwyczaj hoduje się w kolbach do hodowli tkanek o powierzchni 175 cm², zawierających 35 ml pożywki na kolbę, inkubując je w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli tkanek. Można jednak użyć kolby o dowolnym rozmiarze, stosując objętość pożywki odpowiednią dla wielkości danej kolby.
2. W celu pasażowania komórek: odessać starą pożywkę, dodać do komórek 10 ml świeżej pożywki DMEM-10, a następnie zebrać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek. Następnie resuspendować komórki do postaci homogenicznego roztworu, pobierając je do pipety 10 ml i energicznie przeciskając komórki przez końcówkę pipety przyciśniętą do dna kolby. Powtórzyć tę czynność co najmniej 3 razy, aż komórki przestaną tworzyć skupiska. Zweryfikować za pomocą mikroskopii świetlnej, czy uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie przenieść 1 ml (rozcieńczenie 1:10 lub ~1x10⁷ komórek) – 2 ml (rozcieńczenie 1:5 lub ~2x10⁷ komórek) zawiesiny komórkowej do nowej kolby 175 cm² i uzupełnić objętość pożywki do 35 ml.
3. Pasażować komórki, gdy osiągną niemal pełną konfluencję (~1x10⁸ komórek łącznie na kolbach 175 cm²): co trzy dni przy rozcieńczeniu 1:10 lub co dwa dni przy rozcieńczeniu 1:5. Przed pasażowaniem sprawdzić morfologię komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Większość komórek powinna być okrągła i nieaktywowana. Komórki aktywowane charakteryzują się obecnością ziarnistości i/lub wydłużoną, wrzecionowatą morfologią z wypustkami. Nie dopuszczać do przerośnięcia hodowli, ponieważ takie komórki zazwyczaj nie tworzą plamków. Monitorować numer pasażu i regularnie rozpoczynać hodowlę od nowa, rozmrażając alikwot komórek z niższym numerem pasażu. (Przyjmujemy 30. pasaż jako wartość graniczną).

2. Zakażanie komórek RAW 264.7 inokulum MNV

1. Wysiać komórki RAW 264.7 na płytki 6-dołkowe (średnica 3,5 cm) w gęstości 1x10⁶ żywych komórek/ml w pożywce DMEM-10, dodając 2 ml tej zawiesiny do każdego dołka. Ważne jest, aby równomiernie rozłożyć komórki w dołkach poprzez co najmniej 10-krotne ręczne kołysanie płytkami lub za pomocą aparatu do kołysania przez ok. 10 min. Nie należy kręcić płytkami, ponieważ spowoduje to skupienie się komórek w centrum dołka. Płytki należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek (w temperaturze 37 °C i 5% CO₂). Pozostawić komórki do przyczepienia się przez noc lub przez co najmniej 4 h w 37 °C. Dla testu plackowego komórki powinny osiągnąć 60 - 80% konfluencji i być równomiernie rozmieszczone w całym dołku.
2. Następnego dnia przygotować inokulum wirusowe, które może pochodzić z zainfekowanych MNV komórek hodowlanych, z homogenizatów tkanek lub próbek kału od myszy zainfekowanych MNV. W przypadku próbek tkanek, kawałki tkanki wielkości ziarna grochu homogenizuje się w probówkach z nakrętką o pojemności 2 ml zawierających sterylną krzemionkową kulkę w 1 ml DMEM-10 za pomocą homogenizatora tkanek (np. MagnaLyser; Roche). W przypadku próbek kału, nie więcej niż 3 pellety kału należy zhomogenizować w 1 ml pożywki. Wszystkie próbki są następnie zamrażane (w -80 °C) i raz rozmrażane przed wykonaniem testu plackowego.
3. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia inokulum wirusowego w kompletnej pożywce DMEM-5, która składa się z DMEM/High glucose, 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (< 10 EU/ml), 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM niezbędnych aminokwasów, 2 mM L-glutaminy.
4. Dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne przygotowuje się na płytkach 24-dołkowych: za pomocą pipety wielokanałowej (repeatera) dozuje się 1,35 ml pożywki do wielu dołków, rozcieńczenie 10^-1 wykonuje się poprzez zmieszanie 1,35 ml pożywki i 0,15 ml próbki zawierającej wirusa, a następnie 0,15 ml rozcieńczenia 10^-1 dodaje się do 1,35 ml pożywki, aby uzyskać rozcieńczenie 10^-2 i tak dalej. Ważne jest zmienianie końcówek przy każdym nowym rozcieńczeniu. Do jednoczesnego rozcieńczania wielu próbek można użyć pipety wielokanałowej, gdzie dwie końcówki mieszczą się w jednym dołku płytki 24-dołkowej, przenosząc całkowitą objętość 0,15 ml na dołek (patrz Rycina 3A).
5. Typowy zakres rozcieńczeń dla homogenizatów tkanek i treści kału wynosi od 10^-1 do 10^-3. Jednak placki z tych próbek mają tendencję do bycia mniejszymi w porównaniu z plackami z próbek hodowli tkankowych. Ponadto w niektórych przypadkach konieczne jest 100-krotne rozcieńczenie próbek kału, aby wystarczająco rozcieńczyć toksyczne składniki kału, które mogłyby zniszczyć monowarstwę komórek, utrudniając tym samym liczenie placków. Zakres rozcieńczeń lizatów z hodowli tkankowych zależy od interesującego punktu czasowego w cyklu życia wirusa. W szczycie infekcji może być wymagane rozcieńczenie do 10^-9.
6. Po przygotowaniu rozcieńczeń seryjnych, płytki 6-dołkowe zawierające monowarstwy RAW 264.7 (z sekcji 2.1) należy opisać nazwą próbki i nanoszonymi rozcieńczeniami. Usuwając pożywkę z jednej płytki na raz (poprzez wylanie lub odessanie), należy natychmiast dodać 0,5 ml rozcieńczonej próbki do dołka, a następnie powtórzyć to w dołku dubletowym, zanim przejdzie się do kolejnego rozcieńczenia. Po dodaniu wszystkich 3 rozcieńczeń do jednej płytki, należy ręcznie przechylać płytkę w przód i w tył, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały pokryte. Należy operować jedną płytką na raz, aby zapobiec wysychaniu komórek.
7. Po dodaniu 0,5 ml rozcieńczeń do każdego dołka, ułożyć płytki pionowo w stos i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Ponieważ objętość dodana do każdego dołka nie jest wystarczająca do całkowitego pokrycia monowarstwy, płytki należy delikatnie przechylać ręcznie w przód i w tył co 10-15 min lub umieścić na aparacie do kołysania (~18 oscylacji na min). Zapobiega to wysychaniu komórek.

3. Przygotowanie warstwy agarozy o niskiej temperaturze topnienia (SeaPlaque)

Uwaga: zaleca się wcześniejsze przygotowanie kilku butelek z autoklawowanym agaroza SeaPlaque. Agaroza może zostać ponownie roztopiona w kuchence mikrofalowej przed użyciem.

1. Oblicz ilość warstwy przykrywającej (overlay) wymaganą dla całkowitej objętości płytek przed zakończeniem 1-godzinnej inkubacji. Potrzebna objętość to 2 ml/dołek lub 12 ml/płytka 6-dołkowa. Przygotuj osobno agarozę (patrz sekcja 3.2) oraz pożywkę (patrz sekcja 3.3).
2. Aby przygotować agarozę, zawieś 3 g agarozy SeaPlaque w całkowitej objętości 100 ml wody destylowanej (3% w/v) w szklanej butelce. Autoklawuj przez 20-30 min. (Jeśli agaroza została przygotowana wcześniej, ponownie ją rozpuść w mikrofalówce). Ważne jest, aby doprowadzić agarozę SeaPlaque do temperatury 42 °C w kąpieli wodnej przed użyciem, ponieważ zbyt gorąca agaroza zniszczy komórki. Upewnij się, że poziom wody jest równy lub wyższy od poziomu agarozy, aby uniknąć niepożądanego zastygnięcia.
3. Aby przygotować pożywkę: sporządź 100 ml pożywki 2x MEM, składającej się z 2x MEM, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (< 10 EU/ml), 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny oraz 4 mM L-glutaminy. Doprowadź pożywkę do temperatury 37 °C w kąpieli wodnej.
4. Wymieszaj agarozę SeaPlaque oraz pożywkę 2x MEM w sterylnej butelce w stosunku 1:1 bezpośrednio przed nałożeniem na zainfekowane monowarstwy komórek. Jeśli wymagane jest więcej niż 200 ml warstwy przykrywającej, rozdziel objętość do wielu butelek i przechowuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do momentu użycia.
5. Po zakończeniu 1-godzinnej inkubacji (patrz sekcja 2.7), odessaj inokulum z każdego dołka. Powoli dodaj 2 ml warstwy przykrywającej do krawędzi każdego dołka, przykładając końcówkę pipety do ścianki dołka. Jednocześnie można przetwarzać do 5 płytek, aby zapobiec wysychaniu komórek.
6. Pozostaw warstwę przykrywającą do zastygnięcia przez około 10 min w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem płytek pionowo w inkubatorze do hodowli tkanek. Inkubuj płytki przez 48 hr w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.
7. Po okresie inkubacji płytki są słabo widoczne gołym okiem, dlatego sprawdź niebarwione płytki pod kątem obecności płytek wirusowych. Jeśli płytki nie są widoczne, inkubuj przez dodatkowe 4 hr i sprawdź ponownie. Maksymalny czas inkubacji nie powinien jednak przekraczać 72 hr.

4. Wizualizacja placków za pomocą barwienia czerwienią neutralną

1. Aby zwizualizować plaki, przygotowuje się roztwór barwiący z czerwienią neutralną, dodając 3 ml czerwieni neutralnej (0,33% w/v w DPBS; Sigma, katalog nr N2889) do każdych 97 ml 1x PBS (klasa do hodowli tkankowych, wolny od Mg^2+- i Ca^2+-; Gibco, katalog nr 10010). Należy obliczyć objętość roztworu barwiącego z czerwienią neutralną potrzebną do eksperymentu: na każdą płytkę 6-dołkową wymagane jest 12 ml roztworu barwiącego. Następnie do każdego dołka dodaje się 2 ml. Chociaż niektóre protokoły testów plackowych wymagają usunięcia zlewku agarozy z dołków, w niniejszym protokole roztwór barwiący z czerwienią neutralną dodaje się bezpośrednio na warstwę agarozy.
2. Po jednej godzinie inkubacji w 37 °C należy sprawdzić, czy plaki są widoczne, gdy roztwór barwiący z czerwienią neutralną wciąż znajduje się w dołkach. Jeśli plaki nie są wyraźnie widoczne, należy kontynuować barwienie przez kolejną godzinę. Inkubację kontynuuje się do momentu pojawienia się plaków. (Uwaga: Barwienie trwające powyżej 3 h nie jest optymalne; jeśli po 3 h barwienia w próbce kontrolnej dodatniej nie są widoczne żadne plaki, oznacza to, że test plackowy nie przebiegł prawidłowo). Po zakończeniu barwienia należy odessać roztwór barwiący z czerwienią neutralną, dbając o to, aby nie naruszyć zlewku agarozy, a następnie przejść do liczenia plaków.
3. Plaki liczy się, kładąc płytkę odwróconą do góry dnem na stole świetlnym i zaznaczając kropką policzone plaki, aby uniknąć wielokrotnego liczenia tych samych obiektów. Należy wybrać rozcieńczenie do liczenia plaków w dołkach, w których plaki są wyraźnie oddzielone (t.j. nie ma wizualnych dowodów na zlewanie się plaków). Jeśli to możliwe, należy policzyć plaki dla dwóch rozcieńczeń. Należy zauważyć, że wielkość plaka może różnić się w zależności od szczepów MNV, inokulum wirusowego oraz stanu komórek RAW 264.7 podczas testu plackowego.
4. Jeśli w dołku nie są widoczne żadne plaki, oznacza to, że w próbce nie było wirusa lub jego ilość była poniżej granicy wykrywalności testu plackowego. W takim przypadku dołki barwią się na czerwono, podobnie jak inne dołki zawierające plaki. Alternatywnie, brak plaków obserwuje się również wtedy, gdy w danym rozcieńczeniu znajduje się zbyt wiele cząsteczek wirusa. Prowadzi to do lizy całej monowarstwy, a dołki przybierają kolor pomarańczowy/żółty.
5. Oblicz miana wirusa. Zsumuj liczbę plaków w obu dołkach dla jednego rozcieńczenia i pomnóż przez czynnik rozcieńczenia (t.j. 1 ml, jeśli 2 dołki zostały zainfekowane objętością 0,5 ml). Pozwoli to wyznaczyć liczbę jednostek tworzących plaki (PFU) w objętości inokulum 1 ml. Na przykład na Rysunku 4 przy rozcieńczeniu 10^-2 jeden dołek (oznaczony jako „II”) ma 14 plaków, a drugi dołek (oznaczony jako „V”) ma 17 plaków. Zatem miano wirusa wyniesie 14x10² + 17x10² = 3 100 (3,1x10³) pfu/ml.

5. Reprezentatywne wyniki

Zakaźne cząsteczki MNV-1 można ilościowo określić za pomocą testu plackowego, zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia studzienkę z monowarstwą komórek RAW 264.7 bezpośrednio przed zakażeniem, natomiast Rysunek 2B pokazuje trzy widoczne placki oznaczone rzymskimi cyframi I, II i III w studzience. Poszczególne etapy testu przedstawiono na Rysunkach 3A do F. Rysunek 3A pokazuje przygotowanie serii rozcieńczeń 10-krotnych próbki zawierającej wirusa. Rysunek 3B przedstawia przenoszenie rozcieńczeń do dubletowych studzienek płytki 6-dołkowej. Rysunek 3C pokazuje urządzenie do kołysania wykorzystywane do inkubacji komórek RAW 264.7 z inokulum w temperaturze pokojowej przez 1 hr. Rysunek 3D przedstawia nakładanie mieszaniny SeaPlaque:MEM na komórki. Rysunek 3E pokazuje płytkę w temperaturze pokojowej w celu utwardzenia warstwy nakładki, a Rysunek 3F przedstawia barwienie komórek 0,01% roztworem czerwieni neutralnej po 48 hr. Po barwieniu komórek przez 1-3 hr i odessaniu roztworu barwiącego czerwienią neutralną, placki stają się widoczne i mogą zostać policzone (Rysunek 4).

Rycina 1. Schemat protokołu testu plackowego MNV.

Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy studzienki z monowarstwą przed infekcją oraz po powstaniu placków. A) Komórki RAW 264.7 hodowano przez noc i obrazowano pod mikroskopem świetlnym przy 20-krotnym powiększeniu. B) Komórki zabarwiono 0,01% roztworem czerwieni neutralnej po 48 h infekcji i zwizualizowano pod mikroskopem świetlnym przy 4-krotnym powiększeniu. Rzymskie cyfry I, II i III wskazują trzy widoczne placki.

Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy poszczególnych etapów testu plackowego. A) Przygotowanie inokulum MNV-1 w rozcieńczeniach 10-krotnych. B) Dodanie inokulum do monowarstw komórkowych w dubletach dołków. C) Inkubacja komórek i inokulum przy kołysaniu przez 1 hr w temperaturze pokojowej. D) Przykrycie komórek mieszanką SeaPlaque agarose i podłoża 2x MEM w stosunku 1:1. E) Inkubacja płytek przez 10 min w temperaturze pokojowej w celu zestalenia warstwy przypowierzchniowej. F) Barwienie komórek roztworem barwiącym neutral red 48 hr po infekcji.

Rysunek 4. MNV-1 tworzy placki w monowarstwach komórkowych. Przedstawiona jest reprezentatywna płytka do testu plackowego 48 h po infekcji, ukazująca placki wybarwione roztworem czerwieni neutralnej po 1 h inkubacji. Płytka zawiera dublety dołków dla trzech 10-krotnych rozcieńczeń. Dołki oznaczone rzymskimi cyframi I i IV odpowiadają rozcieńczeniu 10-1; II i V odpowiadają rozcieńczeniu 10-2; III i VI odpowiadają rozcieńczeniu 10-3. Miano wirusa w próbce wskazano poniżej (szczegóły obliczeń znajdują się w sekcji 4.5).

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda testu plackowego dla MNV-1 jest sposobem ilościowego oznaczenia zakaźnych cząsteczek MNV. Przestrzegając kroków analizy zilustrowanych na Rysunku 3, można uzyskać powtarzalne miana wirusa. Granica wykrywalności testu zależy od zastosowanego rozcieńczenia początkowego. Przy zastosowaniu rozcieńczenia próbki 1:10, opisanego powyżej, granica wykrywalności testu plackowego wynosi 10 pfu (tj. 1 placka widoczna przy rozcieńczeniu 10^-1). Ponieważ każda placka reprezentuje pojedynczego wirusa, test plackowy może być również wykorzystany do oczyszczania populacji klonalnych MNV poprzez wycinanie izolowanych plackek i ich pasażowanie zgodnie z wcześniejszym opisem ¹. Dodatkowo oczyszczanie plackowe może służyć do oddzielenia pojedynczej populacji wirusa od mieszanych populacji wirusowych. Ograniczeniem stosowania testu plackowego do wykrywania infekcji MNV jest fakt, że nie wszystkie szczepy MNV tworzą placki ⁴. Jednakże możliwe może być przełamanie braku zdolności niektórych szczepów MNV izolowanych od zwierząt do tworzenia plackek poprzez seryjne pasażowanie tych wirusów w hodowlach tkankowych ⁷. Alternatywą dla testu plackowego jest pomiar cząsteczek zakaźnych za pomocą techniki TCID₅₀ ^{3, 4}. Analiza ta określa ilość wirusa niezbędną do wywołania CPE w 50% inokulowanych komórek hodowli tkankowej po rozcieńczeniach końcowych i w przypadku MNV trwa 1 tydzień ⁴. Oprócz tego, że test TCID₅₀ jest wolniejszy niż test plackowy, jest on również mniej czuły (granica wykrywalności = 200 TCID₅₀/ml) ze względu na toksyczność próbek tkankowych dla komórek RAW 264.7 ⁴.

Choć krytyczne etapy zostały opisane w treści protokołu, poniższa sekcja stanowi podsumowanie ułatwiające rozwiązywanie problemów. Najbardziej krytycznym krokiem w protokole jest zapewnienie żywotności komórek RAW 264.7 przez cały czas trwania testu, aby umożliwić replikację wirusa. Można to monitorować na każdym etapie testu za pomocą mikroskopii świetlnej. Żywotność komórek zapewnia się na dwa sposoby. Po pierwsze, należy zadbać o to, aby komórki nie wyschły podczas manipulowania płytkami. W związku z tym płytki są inokulowane pojedynczo, kołysane podczas okresu infekcji i powinny pozostać zamknięte, gdy nie są używane. Po drugie, roztwory dodawane do komórek powinny być wyrównane do temperatury ~37 °C. Ponadto dla ogólnego stanu zdrowia komórek RAW 264.7 kluczowe jest utrzymywanie ich w pożywce zawierającej serum o niskiej zawartości endotoksyn (< 10 EU/ml), co ogranicza aktywację komórek. Dodatkowo zaobserwowaliśmy wyższy odsetek niepowodzeń w teście plackowym przy użyciu komórek z pasażu 30 lub wyższego. Choć prawdopodobnie będzie się to różnić w zależności od laboratorium, ważne jest uwzględnienie kontroli dodatniej (np. próbki o znanym mianie wirusa), aby zapewnić powtarzalność mian, szczególnie przy użyciu komórek RAW 264.7 z wyższych pasażów. Aby ograniczyć stosowanie komórek z wyższych pasaży, zaleca się zamrożenie fiolek z komórkami z wczesnych pasaży bezpośrednio po otrzymaniu komórek RAW 264.7 i częste rozpoczynanie nowej hodowli z rozmrożonych fiolek. Ponowne rozpoczęcie hodowli z komórek z niskiego pasażu będzie pomocne również wtedy, gdy komórki wykażą zmienione właściwości, takie jak brak adhezji, zmiany w morfologii komórek (np. z okrągłych na wrzecionowate i rozprzestrzeniające się) lub gdy wykryto zakażenie mycoplasma. Innym ważnym punktem, na który należy zwrócić uwagę, jest zapewnienie wymiany końcówek pipet między próbkami oraz podczas rozcieńczania. Zapewni to dokładność rozcieńczeń seryjnych i zapobiegnie kontaminacji krzyżowej między próbkami. Jedynym etapem protokołu, w którym można ponownie użyć tej samej końcówki pipety, jest dodawanie rozcieńczeń seryjnych tej samej próbki do dołków. W takim przypadku należy zacząć od najbardziej rozcieńczonego inokulum do najmniej rozcieńczonego, energicznie pipetując w górę i w dół podczas pobierania nowego rozcieńczenia.

Protokół testu plackowego dopuszcza kilka modyfikacji. Jedną z modyfikacji, którą można zastosować w przypadku brakku wystarczającej liczby komórek do zaszczepienia studzienek w dublecie, jest zaszczepienie tylko jednej studzienki dla każdego rozcieńczenia. Jednakże, ponieważ objętość inokulum wynosi 0,5 ml, liczbę placków należy wówczas pomnożyć przez współczynnik 2, aby znormalizować wynik do pfu/ml. Test plackowy można również dostosować do użycia z dowolną inną adherentną linią komórkową zdolną do wspierania replikacji MNV, co zostało opisane dla mysiej linii komórkowej mikrogleju BV-2 ⁸. Inne możliwe do wdrożenia modyfikacje to adaptacje opisane w protokołach testów plackowych opracowanych dla innych wirusów. W przypadku MNV z sukcesem zaimplementowano już następujące modyfikacje: zastosowanie metylocelulozy zamiast agarozy Sea Plaque ⁹ oraz barwienie komórek fioletem krystalicznym lub błękitem metylenowym zamiast czerwienią neutralną ^{10, 11}.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można łatwo dostosować w zależności od potrzeb do ilościowego oznaczania innych wirusów tworzących plakietki lub zastosować go do innych wirusów wywołujących infekcje lityczne w komórkach RAW 264.7, co czyni go użytecznym narzędziem do ogólnego oznaczania ilości zakaźnych cząsteczek wirusowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicylina i streptomycyna	Hyclone	SV30010
10 mM Nieessentialne aminokwasy	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamina	Hyclone	SH30034.01
Płodowa surowica bydlęca	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Agaroza do metod płytek (Sea Plaque Agarose)	Lonza	50100
Czerwień neutralna 0,33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
Kuleczki cyrkonowe/krzemionkowe 1,0 mm	BioSpec Products	11079110z
Wstrząsarka Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Urządzenie Magna Lyser	Roche	03358968001
Linia komórkowa Raw 264.7	ATCC	TIB-71
Inkubator do hodowli tkankowych	Sanyo	MCO-18AIC