W niniejszym raporcie przedstawiamy etapy barwienia i analizy w badaniu fenotypowania przeprowadzonym na świeżej krwi pełnej w celu zliczenia głównych populacji leukocytów wrodzonych i adaptacyjnych. Kładziemy szczególny nacisk na kwestie związane z wykonywaniem tych procedur w kontekście wieloośrodkowego badania klinicznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kriokonserwacja leukocytów krwi obwodowej jest szeroko stosowana w celu zachowania komórek do oceny odpowiedzi immunologicznej w badaniach klinicznych i oferuje wiele zalet w zakresie łatwości oraz standaryzacji ocen immunologicznych, jednak w przypadku niektórych subpopulacji komórek, takich jak granulocyty, limfocyty B i komórki dendrytyczne, zaobserwowano szkodliwe skutki tego procesu 1-3. Analiza świeżych leukocytów daje dokładniejszy obraz stanu komórek in vivo, ale często jest trudna do przeprowadzenia w kontekście dużych badań klinicznych. Testy na świeżych komórkach zależą od zaangażowania i ram czasowych ochotników, a jeśli są czasochłonne, ich zastosowanie może być niepraktyczne ze względu na godziny pracy wymagane od personelu laboratoryjnego. Dodatkowo, gdy badania są prowadzone w wielu ośrodkach, laboratoria dysponujące zasobami i szkoleniem niezbędnym do przeprowadzenia analiz mogą nie znajdować się w wystarczającej bliskości od ośrodków klinicznych. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy 11-kolorowy panel barwienia przeciwciałami, który może być stosowany z probówkami Trucount (Becton Dickinson; San Jose, CA) do fenotypowania i zliczania głównych populacji leukocytów we krwi obwodowej, dostarczając bardziej rzetelnych informacji specyficznych dla typów komórek niż badania takie jak morfologia krwi (CBC) lub analizy z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych paneli przeznaczonych do probówek Trucount, które barwią tylko kilka typów komórek. Procedura barwienia jest prosta, wymaga jedynie 100 μl świeżej krwi pełnej i trwa około 45 minut, co czyni ją wykonalną dla standardowych laboratoriów przetwarzających krew. Została ona zaadaptowana z karty danych technicznych probówek BD Trucount (wersja 8/2010). Koktajl przeciwciał barwiących można przygotować wcześniej w dużych ilościach w centralnym laboratorium analitycznym i wysłać do laboratoriów przetwarzających w poszczególnych ośrodkach. Zabarwione probówki można utrwalić i zamrozić w celu wysyłki do centralnego laboratorium analitycznego w celu przeprowadzenia wielokolorowej cytometrii przepływowej. Dane uzyskane z tego panelu barwiącego mogą być wykorzystane do śledzenia zmian w stężeniach leukocytów w czasie w odniesieniu do interwencji i mogą być łatwo rozwinięte w celu oceny stanów aktywacji specyficznych, interesujących typów komórek. W niniejszym raporcie prezentujemy procedurę stosowaną przez techników laboratoriów przetwarzających krew do barwienia świeżej krwi pełnej oraz kroki niezbędne do analizy tych zabarwionych próbek w centralnym laboratorium analitycznym wspierającym wieloośrodkowe badanie kliniczne. Film szczegółowo przedstawia procedurę wykonywaną w kontekście pobrania krwi do badania klinicznego w ramach HIV Vaccine Trials Network (HVTN).
Protokół
Uwaga: Aby chronić przeciwciała sprzężone z fluoroforem przed światłem, należy przeprowadzić wszystkie etapy w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy wyłączonym oświetleniu.
1. Przygotowanie panelu barwienia przeciwciałami
- Panel barwienia przeciwciałami znajduje się w Tabeli 1. Stężenie przeciwciał należy określić poprzez miareczkowanie z użyciem krwi pełnej, korzystając z tej samej aparatury do cytometrii przepływowej oraz procedur, które będą stosowane podczas analizy barwionych próbek fenotypowych.
- Po ustaleniu odpowiednich mian barwienia, należy połączyć wszystkie przeciwciała w jednej probówce z zakrętką. Dodać bufor do płukania w cytometrii przepływowej (PBS Dulbecco z 2% inaktywowanym termicznie płodową surowicą bydlęcą), aby doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl. Skalować objętość mieszaniny zgodnie z liczbą barwionych próbek. Mieszaninę tę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie osiem tygodni.
2. Barwienie
- Jeśli pobrana krew ma zostać wykorzystana do innych celów poza niniejszym badaniem, należy odstawić alikwot, podczas gdy pozostałą krew poddaje się bardziej wrażliwym czasowo procedurom. Alikwot można przechowywać w temperaturze pokojowej do 4 hr po wenipunkcji bez znaczącej utraty komórek.
- Należy sprawdzić, czy na dnie probówki Trucount znajduje się nienaruszony osad kulek, a następnie opisać probówkę, aby zidentyfikować barwioną próbkę. W badaniach klinicznych HVTN do opisywania i śledzenia barwionych próbek wykorzystuje się Laboratory Data Management System (Frontier Science and Technology Research Foundation; Amherst, NY).
- Należy zapisać numery partii i daty ważności wszystkich odczynników. Należy zapisać liczbę kulek w probówce Trucount podaną przez producenta na opakowaniu probówek; należy upewnić się, że numer partii na opakowaniu jest zgodny z numerem partii na probówce.
- Stosując pipetowanie odwrotne, należy precyzyjnie nanieść 100 μl krwi pełnej do probówki Trucount, tuż nad metalowy ogranicznik. Należy unikać rozmazywania krwi po ściankach probówki.
- Stosując standardową technikę pipetowania (dodnie), należy nanieść 100 μl zmieszanego panelu przeciwciał barwiących (patrz Tabela 1) do probówki Trucount. Należy zakręcić probówkę i mieszać na wirówce typu vortex z niską prędkością przez około 15 sec. Należy wizualnie sprawdzić probówkę, aby upewnić się, że osad kulek został całkowicie rozpuszczony.
- Probówkę Trucount należy inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (15-30 °C) w ciemności.
- W razie potrzeby należy rozcieńczyć alikwot 10× roztworu FACS Lysing do stężenia 1X za pomocą diH2O. Do probówki należy dodać 900 μl 1× roztworu FACS Lysing.
- Należy zakręcić probówkę i dokładnie mieszać na wirówce typu vortex z niską prędkością przez około 15 sec. Należy mocno docisnąć zakrętkę do pozycji blokady na probówce i uszczelnić ją folią laboratoryjną.
- Probówkę należy przechowywać w temperaturze od -65 °C do -95 °C do czasu przygotowania próbki do wysyłki do centralnego laboratorium analitycznego lub do analizy wewnętrznej. Próbki są stabilne na tym etapie przez co najmniej cztery tygodnie. W przypadku natychmiastowej wysyłki lub analizy ten krok można pominąć.
3. Wysyłka
Uwaga: Poniższe instrukcje wykorzystują izolowany system transportowy firmy Saf-T-Pak, Inc., zaprojektowany specjalnie do transportu zwolnionych z przepisów substancji biologicznych kategorii B zgodnie z regulacjami Międzynarodowego Zrzeszenia Transportu Powietrznego (IATA). Jeśli analiza próbek odbywa się w tym samym miejscu, w którym przeprowadzono barwienie, należy przejść do sekcji 4.
- Próbki można wysłać natychmiast po barwieniu lub po zamrożeniu w temperaturze od -65 °C do -95 °C. Każdą probówkę należy całkowicie owinąć folią i umieścić w pudełku na zabarwione preparaty. Pudełko z zabarwionymi preparatami należy umieścić w szczelnym worku polietylenowym z materiałem absorbującym.
- Szczelny worek polietylenowy wraz z zawartością należy umieścić w worku Tyvek i zamknąć, usuwając z niego jak najwięcej powietrza.
- Pakiet z preparatem (preparat w opakowaniu wtórnym) należy umieścić w wewnętrznym brązowym pudełku.
- Wewnętrzne brązowe pudełko należy umieścić w styropianowej skrzyni, mocując je w zagłębieniu, aby zapobiec przemieszczaniu.
- Styropianową skrzynię należy wypełnić suchym lodem (około 8 kg) i szczelnie zamknąć pokrywą.
- Pudełko transportowe należy starannie zakleić taśmą i wysłać jako Substancję Biologiczną, Kategoria B (UN3373) z odpowiednimi oznaczeniami Suchego Lodu (UN1845), zgodnie z instrukcjami IATA PI-650.
- Po otrzymaniu próbki są przechowywane w temperaturze od -65 °C do -95 °C do momentu analizy.
4. Rozmrażanie i analiza cytometryczna
- Wyjmij zabarwioną próbkę z zamrażarki i rozmroź ją w temperaturze pokojowej w ciemności przed pomiarem na cytometrze przepływowym. W przypadku pomiaru więcej niż jednej próbki, ustandaryzuj proces dla wszystkich probówek, wprowadzając rozstęp w rozmrażaniu, tak aby żadna z probówek nie pozostawała w temperaturze pokojowej dłużej niż 1 hr.
- Próbki należy analizować przy użyciu cytometru przepływowego z czterema laserami wyposażonego w odpowiednie filtry, takiego jak BD LSR II. Do gromadzenia danych należy zastosować standardowe metody kalibracji cytometru oraz kompensacji fluorescencji 4.
Uwaga: Podczas zbierania danych nie należy ustawiać progów dla rozproszenia światła przedniego (forward scatter) ani bocznego (side scatter) 5. Kuleczki Trucount mogą znajdować się poniżej najniższego możliwego ustawienia progu dla tych parametrów, co spowodowałoby pominięcie części kuleczek podczas analizy. Jeśli instrument wymaga ustawienia progu, należy ustawić najniższy możliwy próg dla kanału Am Cyan. Ponieważ leukocyty CD45+ barwione tym panelem będą dodatnie w kanale Am Cyan, a kuleczki Trucount również fluorescują w tym kanale, powinno to zapewnić właściwe zebranie wszystkich istotnych danych.
- Przed nałożeniem na cytometr przepływowy wymieszaj próbkę w probówce na wirówce typu vortex przez 5 sec. Kuleczki Trucount wykazują silną fluorescencję w wielu kanałach. Podczas pomiaru wyznacz bramkę dla kuleczek, identyfikując populację silnie dwudodatnią dla PE Cy5 i APC (dwa kolory, które najłatwiej odróżniają kuleczki od komórek, mogą się różnić w zależności od aparatury). Wybierz bramkę kuleczek jako bramkę stopu i rejestruj dane do momentu pozyskania co najmniej 20 000 kuleczek.
- Przeanalizuj dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, np. FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Rysunek 1 przedstawia schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych populacji leukocytów z reprezentatywnego pobrania krwi kontrolnej.
5. Obliczenia Trucount
- Każda probówka Trucount zawiera liofilizowany osad kulek fluorescencyjnych. Po dodaniu cieczy do probówki i wymieszaniu na wortexie, kulki powinny zostać równomiernie rozłożone w całej próbce. Liczba kulek w osadzie nieznacznie różni się w zależności od numeru partii i jest podana na worku do przechowywania probówek.
- Należy wyznaczyć bramki dla kulek Trucount oraz populacji komórek, jak pokazano na Rysunku 1, aby określić liczbę zdarzeń dla każdej populacji. Porównanie liczby zdarzeń w bramce kulek z całkowitą liczbą kulek pierwotnie znajdujących się w probówce pozwoli określić stosunek pobranej próbki, co następnie można wykorzystać do obliczenia bezwzględnego stężenia (t.j. komórek/μl) dla każdej populacji. W tym celu można zastosować następujące równanie: Stężenie komórek (# komórek/μl krwi pełnej)= [# zdarzeń populacji/(# zdarzeń kulek/# całkowitych kulek w osadzie)]/100 μl.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Schemat bramkowania wykorzystany do analizy głównych populacji leukocytów, przedstawiający reprezentatywne dane od zdrowego ochotnika. A) Kuleczki Trucount (i) są bramkowane i wykluczane z populacji komórek. Wyodrębniono granulocyty (ii), a limfocyty i monocyty podzielono na 3 populacje: limfocyty CD14 negatywne (iii), wszystkie komórki CD14 negatywne (iv) oraz nie-limfocyty (v). B) Limfocyty CD14 negatywne są bramkowane w celu rozróżnienia limfocytów T CD4+ (vi), limfocytów T CD8+ (vii), limfocytów B (viii), komórek NK CD56 bright (ix), komórek NK CD56 dim (x) oraz komórek NK CD56 negatywnych (xi). C) Wszystkie komórki CD14 negatywne są bramkowane w celu rozróżnienia mieloidalnych (xii) i plazmacytoidalnych (xiii) komórek dendrytycznych. D) Nie-limfocyty są bramkowane w celu rozróżnienia monocytów nieklasycznych (xiv), pośrednich (xv) i klasycznych (xvi). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.
Bardziej specyficzne subpopulacje komórek, które nie zostały przedstawione na Rysunku 1 (np. komórki NKT lub neutrofile), mogą być również rozróżnione przy użyciu prezentowanego przez nas panelu, a schemat bramkowania można rozszerzyć lub zmodyfikować w zależności od konkretnych potrzeb badania. Niektóre przedstawione kroki bramkowania są specyficzne dla tej metody. Warto zauważyć, że wokół kulek Trucount wyznacza się bramkę włączenia i bramkę wykluczenia, które są nałożone na siebie – jedna służy do bramkowania kulek w celu ich przeliczenia, a druga do wykluczenia kulek z analizy komórkowej (Rysunek 1A). Ponadto, ponieważ limfocyty, monocyty i granulocyty nie są tak łatwo rozróżnialne w krwi pełnej, jak w mononuklearnych komórkach krwi obwodowej za pomocą rozpraszania przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter), często konieczne jest bramkowanie tych komórek z wykorzystaniem ekspresji CD45 i rozpraszania bocznego (Rysunek 1A). Zanieczyszczające granulocyty (zakreślone okręgiem), których nie udało się oddzielić od limfocytów i monocytów za pomocą CD45 i rozpraszania bocznego, są na niektórych wykresach rozróżnialne dzięki wysokiej ekspresji CD16 (Rysunek 1C i Rysunek 1D). Liczba zanieczyszczających granulocytów jest zazwyczaj niewielka i nie zakłócają one bramkowania monocytów i komórek NK.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym raporcie przedstawiamy metodę opartą na kuleczkach do wyliczania populacji leukocytów w świeżej krwi pełnej za pomocą cytometrii przepływowej oraz omawiamy parametry niezbędne do jej zastosowania w wieloośrodkowym badaniu klinicznym z centralną analizą próbek. Metoda ta opiera się na protokole BD Trucount i go optymalizuje, umożliwiając jego niezawodne zastosowanie w warunkach wieloośrodkowego badania klinicznego. Test barwienia jest prosty i trwa około 45 minut, co sprawia, że może być on wykonywany przez t...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Jessice Jones, Ericie Clark, Constance Ducar, Donnie Smith, Royowi Lewisowi, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devinowi Adamsowi, Coreyowi McBainowi oraz Stephenowi Voghtowi za pomoc w opracowaniu tej metody, manuskryptu i filmu.
Niniejsza praca była wspierana przez grant CAVD 38645 Fundacji Billa i Melindy Gates (M.J.M.) oraz granty Narodowych Instytutów Zdrowia UM1 AI068618 i U01 AI069481 (M.J.M.). E.A-N. jest wspierany przez grant NIH T32 AI007140. Dziękujemy James B. Pendleton Charitable Trust za hojną darowiznę sprzętu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do zliczania bezwzględnego Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X roztwór lizujący do FACS | BD Biosciences | 349202 | |
| Kategoria B &System transportu zwolnionego z przepisów ADR, izolowany | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| przeciwciało monoklonalne anty-CD45 AmCyan | BD Biosciences | 339192 | |
| przeciwciało monoklonalne anty-CD3 znakowane FITC | BD Biosciences | 349201 | |
| przeciwciało monoklonalne CD8 PerCp-Cy 5.5 | BD Biosciences | 341051 | |
| przeciwciało monoklonalne CD4 znakowane Alexa Fluor 700 | BD Biosciences | 557922 | |
| przeciwciało monoklonalne przeciwko ECD HLA-DR | Beckman Coulter | IM3636 | |
| przeciwciało monoklonalne anty-CD14 v450 | BD Biosciences | 560349 | |
| przeciwciało monoklonalne anty-CD19 znakowane PE | BD Biosciences | 555413 | |
| przeciwciało monoklonalne CD16 APC-H7 | BD Biosciences | 560195 | |
| przeciwciało monoklonalne CD56 PE-Cy7 | BD Biosciences | 335791 | |
| przeciwciało monoklonalne anty-CD11c znakowane APC | BD Biosciences | 559877 | |
| przeciwciało monoklonalne CD123 PE-Cy5 | BD Biosciences | 551065 |
Bibliografia
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
