$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie nanoemulsji przesuwającej fazę (PSNE)
- Rozpuścić 11 mg DPPC oraz 1,68 mg DSPE-PEG2000 w chloroformie
- Odparować rozpuszczalnik organiczny, aby utworzyć suchy film lipidowy w szklanej kolbie okrągłodennej
- Suszyć film lipidowy w desykatorze przez noc
- Rehydratować film lipidowy przy użyciu 5,5 ml fosforanowego buforu solnego (PBS)
- Podgrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C do momentu rozpuszczenia filmu lipidowego, okresowo mieszając na wortexie
- Przenieść roztwór lipidowy do fiolki o pojemności 7 ml
- Sonicować roztwór lipidowy przez 2 min przy amplitudzie 20%
- Podzielić roztwór do dwóch fiolek po 2,5 ml każda (pozostałe 0,5 ml odrzucić)
- Dodać 2,5 ml PBS do każdej fiolki
- Umieścić każdą fiolkę w łaźni lodowo-wodnej o temperaturze 0 °C
- Dodać 50 μl DDFP do każdej fiolki
- Sonicować każdą fiolkę w łaźni lodowo-wodnej, stosując następujące ustawienia: amplituda 25%, tryb impulsowy (10 s włączenia, 50 s przerwy), całkowity czas włączenia 60 s
- Przenieść roztwory PSNE do fiolek scyntylacyjnych o pojemności 20 ml
- Dodać 5 ml PBS do każdej fiolki, aby uzyskać końcową objętość 10 ml
- Złożyć ekstruder zgodnie z instrukcją producenta
- Przepłukać każdą część wodą dejonizowaną
- Umieścić stalową płytkę podporową w centrum podstawy wspornika filtra
- Umieścić stalową siatkę na wierzchu stalowej płytki podporowej
- Za pomocą pęsety umieścić membranę odpływową ekstrudera (stroną błyszczącą do góry) na stalowej siatce
- Za pomocą pęsety umieścić filtr ekstrudera (stroną błyszczącą do góry) na membranie odpływowej
- Ostrożnie nałożyć małą uszczelkę O-ring na filtr, a następnie umieścić termobarel i górną część ekstrudera nad podstawą wspornika
- Najpierw częściowo dokręcić każdą nakrętkę motylkową, a następnie całkowicie dokręcić nakrętki ręcznie w sposób naprzemienny
- Podłączyć ekstruder do linii z azotem
- Aby przygotować ekstruder, pipetować 10 ml wody dejonizowanej do górnego otworu na próbkę, zamknąć otwarcie i dokręcić zawór odpowietrzający
- Powoli otworzyć linię z azotem, aby zwiększyć ciśnienie, wymuszając przepływ próbki przez membrany, a następnie zebrać próbkę z rurki wylotowej
- Po użyciu rozłożyć urządzenie w kolejności odwrotnej, przepłukać części ekstrudera wodą dejonizowaną i wyrzucić filtr membranowy oraz membranę odpływową
- W przypadku kropli o rozmiarze 100 nm, wstępnie przygotować PSNE, ekstrudując 10 razy przez filtr 200 nm
- Ekstrudować PSNE 16 razy przez filtr 100 nm lub 200 nm, aby uzyskać wąski rozkład wielkości
2. Przygotowanie hydrożelu poliakrylamidowego zawierającego PSNE
- Przygotować 24% roztwór BSA, rozcieńczając 1,2 g proszku BSA w 5 ml wody dejonizowanej
- Przygotować 10% roztwór APS, rozcieńczając 0,1 g proszku APS w 1 ml wody dejonizowanej
- W następującej kolejności zmieszać w plastikowej komorze: 2,1 ml roztworu akryloamidu, 1,2 ml buforu Tris, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% roztworu BSA oraz 3,6 ml wody dejonizowanej
- Podgrzać do 40 °C i pozostawić w próżni na 1 hr
- Dodać 480 μl PSNE i dokładnie wymieszać, delikatnie obracając plastikową komorę
- Dodać 12 μl TEMED i umieścić komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 12 °C na 2 hr
3. Reprezentatywne wyniki
Schemat układu do eksperymentów ultradźwiękowych z wykorzystaniem fantomów z hydrożelu naśladującego tkankę przedstawiono na Rysunku 1. Niniejszy protokół pozwala na otrzymanie kropel perfluorowęglowodanów powlekanych lipidami o wąskim rozkładzie wielkości, które pozostają stabilne w roztworze przez co najmniej tydzień. Rozkład wielkości zmierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) przedstawiono na Rysunku 2 dla PSNE otrzymanych przy użyciu filtrów 100 i 200 nm. Efektywna średnica PSNE w czasie, zmierzona metodą dynamicznego rozpraszania światła, została zestawiona w Tabeli 1, co dowodzi, że PSNE są stabilne przez co najmniej tydzień. Obrazy PSNE w trybie B przed i po waporyzacji w hydrożelu poliakryloamidowym przedstawiono na Rysunku 3. Ponadto na Rysunku 4 pokazano zmianę chorobową powstałą w wyniku 15 s ogrzewania za pomocą HIFU w hydrożelu poliakryloamidowym zawierającym albuminę i PSNE. Asymetryczny kształt zmiany jest wynikiem ogrzewania przedogniskowego, które występuje z powodu obecności chmury pęcherzyków na drodze wiązki ultradźwiękowej. Należy zauważyć, że ogrzewanie przedogniskowe i powstawanie zmian wynikające z rozproszenia fal przez pęcherzyki można zminimalizować poprzez zmniejszenie transmitowanej mocy akustycznej.
Rysunek 1. Schematyczny rysunek konfiguracji eksperymentalnej dla doświadczeń ultradźwiękowych z wykorzystaniem hydrożeli imitujących tkankę.
Rycina 2. Rozkład wielkości PSNE przeciskanego przez filtry 100 nm lub 200 nm, zmierzony metodą dynamicznego rozpraszania światła. Jednostki osi rzędnych opierają się na intensywności światła rozpraszanego przez cząstki o określonej wielkości w stosunku do całkowitej intensywności światła rozpraszanego przez próbkę.
Rycina 3. Obrazy w trybie B (a) przed i (b) po waporyzacji PSNE w hydrożelu poliakrylamidowym. Strzałka wskazuje obszar ogniskowania, w którym w wyniku waporyzacji PSNE powstała chmura pęcherzyków.
Rysunek 4. Obrazy hydrożelu poliakrylamidowego zawierającego albuminę i PSNE (a) przed oraz (b) po odparowaniu i sonikacji za pomocą HIFU, wykazujące powstanie zmiany w wyniku nagrzewania indukowanego ultradźwiękami. Częstotliwość centralna ultradźwięków wynosiła 3.3 MHz. Sygnał ultradźwiękowy składał się z początkowego impulsu o długości 30 cykli i mocy 6.4 W w celu odparowania PSNE, po którym natychmiast nastąpiło 15 s ciągłego promieniowania ultradźwiękowego o mocy 0.77 W.
| Dni po ekstruzji | Ekstruzja przez filtr 200 nm | Ekstruzja przez filtr 100 nm |
| Śr. średnica (nm) | Odch. std. (nm) | Śr. średnica (nm) | Odch. std. (nm) |
| 1 | 182.9 | 4.9 | 118.0 | 0.9 |
| 7 | 177.7 | 2.5 | 124.8 | 3.1 |
Tabela 1. Średnica średnia i odchylenie standardowe PSNE w pierwszym i siódmym dniu po ekstruzji z użyciem filtrów 100 nm i 200 nm.