Szybkie i wydajne generowanie neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie wielomianowej płytki

Podsumowanie

Protokoły różnicowania neuronów pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSC) są często czasochłonne i wymagają znacznych umiejętności hodowli komórek. W tym przypadku dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytki z wieloma tytułami, umożliwiając proste, szybkie i wydajne generowanie ludzkich neuronów w kontrolowany sposób.

Streszczenie

Istniejące protokoły generowania neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są często uciążliwe, ponieważ są to wieloetapowe procedury polegające na izolacji i ekspansji nerwowych komórek prekursorowych, przed końcowym różnicowaniem. W porównaniu z tymi czasochłonnymi podejściami, odkryliśmy niedawno, że połączone hamowanie trzech szlaków sygnałowych, TGFβ / SMAD2, BMP / SMAD1 i FGF / ERK, sprzyja szybkiej indukcji neuroektodermy z hPSC, a następnie natychmiastowemu różnicowaniu się w funkcjonalne neurony. W tym przypadku dostosowaliśmy naszą procedurę do nowatorskiego formatu płytek z wieloma titrami, aby jeszcze bardziej zwiększyć jej odtwarzalność i zapewnić kompatybilność z aplikacjami o średniej przepustowości. Składa się z czterech dni tworzenia neuroektodermy w unoszących się kulach (ciałach embrionalnych), po których następują kolejne cztery dni różnicowania się w neurony w warunkach przylegania. Większość komórek uzyskanych za pomocą tego protokołu wydaje się być dwubiegunowymi neuronami czuciowymi. Co więcej, procedura jest wysoce wydajna, nie wymaga szczególnych umiejętności specjalistycznych i opiera się na prostym, chemicznie zdefiniowanym pożywce z opłacalnymi małymi cząsteczkami. Ze względu na te cechy, procedura może służyć jako użyteczna platforma do dalszych badań funkcjonalnych, a także do podejść przesiewowych opartych na komórkach, wymagających ludzkich neuronów czuciowych lub neuronów dowolnego typu.

Wprowadzenie

hPSC, składające się z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych pochodzących z zarodków (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), są pluripotencjalne, co oznacza, że mogą dać początek różnym liniom komórkowym in vitro ^1-2. Do tej pory z hESC wyprowadzono wiele zróżnicowanych typów komórek, co potwierdza pogląd, że komórki te stanowią cenne narzędzia do badań naukowych i badań przesiewowych opartych na komórkach oraz są obiecujące dla terapii opartych na komórkach.

Protokoły różnicowania neuronów dla hESC są zazwyczaj skomplikowane i czasochłonne, ponieważ często opierają się najpierw na indukowaniu ogólnego losu neuronów, następnie ręcznej izolacji neuronalnych komórek progenitorowych, a następnie na końcowym różnicowaniu do danego typu neuronu będącego przedmiotem zainteresowania^3-6. Pod pewnymi względami ta złożoność nie jest zaskakująca i nieunikniona, biorąc pod uwagę, że takie najnowocześniejsze protokoły ukierunkowanego różnicowania mają tendencję do stopniowego naśladowania wczesnego rozwoju człowieka, który sam w sobie jest niezwykle złożony. Z drugiej strony, może to również częściowo odzwierciedlać nasz brak zrozumienia podstawowych procesów molekularnych, co skutkuje protokołami różnicowania, które wciąż są dalekie od pełnej optymalizacji.

Jeśli chodzi o konwersję niezróżnicowanych hPSC do neuroektodermy, Pera i in. stwierdzili, że tłumienie sygnalizacji BMP / SMAD1/5/8 zwiększa indukcję neuronalną hESC⁷. Ponadto wykazano, że inaktywacja sygnalizacji SMAD2/3 sprzyja tworzeniu neuroektodermy⁸. W związku z tym połączona inaktywacja tych dwóch szlaków prowadzi do bardziej efektywnej indukcji neuronalnej hPSC^4,9. Niedawno wykazaliśmy, że trzeci szlak sygnałowy, FGF/ERK, służy jako silny represor najwcześniejszych etapów zaangażowania neuroektodermalnego w hESC. I odwrotnie, jednoczesne tłumienie wszystkich tych trzech szlaków prowadzi do niemal jednorodnej konwersji hESC do neuroektodermy w ciągu zaledwie czterech dni¹⁰. Następnie, w ciągu ośmiu dni, zaobserwowano wysoce efektywne różnicowanie końcowe w funkcjonalne neurony. Uzyskane neurony były prawdopodobnie neuronami czuciowymi obwodowego układu nerwowego, co może częściowo wyjaśniać ich szybkie pochodzenie¹⁰. Zaburzenia w utrzymaniu neuronów czuciowych są uważane za przyczynę niektórych zaburzeń u ludzi, takich jak rodzinna dysautonomia¹¹. Dla modelowania takich chorób w oparciu o technologię hiPSC¹², dla dalszej charakterystyki funkcjonalnej, a także do celów aplikacyjnych niewymagających żadnego szczególnego typu neuronów, ta procedura różnicowania może stanowić użyteczną podstawę.

Jednak strategia różnicowania, którą pierwotnie zastosowaliśmy, obejmowała tworzenie ciał embrionalnych (EB) z kępek kolonii hESC¹⁰, co spowodowało dość dużą niejednorodność pod względem rozmiarów EB, a także wydawało się zagrażać efektywności tworzenia neuronów w niektórych liniach komórkowych. Ponadto, ze względu na niejednorodność rozmiarów EB, zdolność do systematycznego testowania wpływu dodatkowych czynników wzrostu lub małych cząsteczek w trakcie i po powstaniu neuronów wydawała się nieco zagmatwana.

W tym raporcie dostosowaliśmy naszą poprzednią procedurę do techniki opartej na agregacji o średniej przepustowości, wymuszonej agregacji, aby generować EB w sposób wysoce kontrolowany pod względem wielkości, jak pokazano również w innych kontekstach¹³. Następnie EB wygenerowane w studzienkach w kształcie litery V na 96-dołkowych płytkach przeniesiono do 96-dołkowych płytek o bardzo niskim przyłączeniu w kształcie litery U, aby zainicjować tworzenie neuroektodermy w zawiesinie. Cztery dni później EB można było wysiać, dając początek terminalnie zróżnicowanym neuronom o wysokiej wydajności i jednorodności. Alternatywnie, EB dnia 4 zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki i posiane jako takie, co spowodowało powstanie monowarstw ludzkich neuronów o niskiej gęstości. Do tej pory uzyskano spójne wyniki dla dwóch niezależnie wyprowadzonych linii hESC, HuES6 i NCL3.

Jako warunek wstępny, pomyślne utworzenie EB było ściśle uzależnione od użycia syntetycznego polimeru, polialkoholu winylowego (PVA), wraz z inhibitorem ROCK Y-27632, o którym wiadomo, że sprzyja przeżyciu hESC^13-14. W rezultacie, jednorodność EB utworzonych w płytkach 96-V została znacznie zwiększona w porównaniu z tworzeniem EB jako kultur masowych opartych na technikach losowego podziału. System ten zapewnia zatem znacznie ulepszoną platformę do tworzenia neuroektoderm w hodowli zawiesiny, a następnie wysoce kontrolowanego tworzenia neuronów w warunkach przylegania.

Protokół

1. Przygotowanie płytek i mediów pokrytych matrżelem

1. Stwierdzono, że Matrigel jest preferowanym substratem do przyłączania różnicujących się EB, a także sprzyja efektywnemu wzrostowi neuronów z tych¹⁰.
   1. Rozmrozić 10 ml Matrigel przez noc na lodzie.
   2. Następnego dnia rozcieńczyć galaretowaty Matrigel dwiema objętościami lodowatego DMEM/F-12 i przygotować porcje 1 ml w wstępnie schłodzonych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml, które mogą być przechowywane zamrożone w temperaturze -20 °C.
   3. Zdecyduj się na format płytki do różnicowania neuronów. Na przykład, jako punkt wyjścia, zalecamy przeprowadzenie początkowej rundy różnicowania w formacie 12-dołkowym. Schłodzić wstępnie cztery 12-dołkowe płytki w temperaturze 4 °C. Rozpuścić jedną porcję zamrożonego Matrigelu, dodając 9 ml wstępnie schłodzonego DMEM/F-12, a następnie pipetować w górę i w dół, aż cały wstępnie rozcieńczony Matrigel rozmrozi się i rozpuści.
   4. Następnie przenieść zawartość do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml DMEM/F-12 na lodzie (końcowe rozcieńczenie Matrigel: 1:75). Następnie dodać 0,5 ml rozcieńczonego Matrigelu do każdego dołka z wstępnie schłodzonych płytek 12-dołkowych. Owiń talerze Parafilm i odstaw na noc w temperaturze RT.
   5. Następnego dnia przenieś płytki do 4 °C. Powlekane płytki można przechowywać przez kilka tygodni przed użyciem.
2. media

EB pożywka formująca (~15 ml potrzebne do przeprowadzenia różnicowania na jednej 96-dołkowej płytce - patrz Tabela 1 i schemat na Rysunku 2):
DMEM/F-12 z 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng/ml FGF2
10 μM Y-27632
1x PenStrepGln

Podłoże różnicujące (~30 ml potrzebne do przeprowadzenia różnicowania na jednej 96-dołkowej płytce, a następnie tworzenie neuronów na jednej 12-dołkowej płytce pokrytej Matrigel, patrz Tabela 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% BSA
0,5 μM PD0325901
15 μM SB431542
0,5 μM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Wymuszona formacja EB

1. Uprawiaj hPSC w preferowanych warunkach bez karmnika. Używamy pożywki kondycjonowanej MEF na płytkach 6-dołkowych^pokrytych Matrigelem 15. Jednak inne systemy hodowli, takie jak domowe lub komercyjne podłoża zdefiniowane, również powinny działać. W momencie rozpoczęcia eksperymentu różnicowania hPSC powinny być subkonfluentne i aktywnie rosnąć.
2. Mechanicznie usuń spontanicznie zróżnicowane kolonie za pomocą sterylnej plastikowej końcówki pipety pod mikroskopem stereoskopowym.
3. Umyj pozostałe niezróżnicowane kolonie za pomocą PBS i strawij do pojedynczych komórek za pomocą Akutazy zawierającej 1X Y-27632. Osadzać pojedyncze komórki przez wirowanie przy 200 x g przez 2 minuty, ponownie zawiesić w małej objętości pożywki tworzącej EB i oznaczyć miano komórek za pomocą hematocytometru.
4. Dodać podwielokrotność komórek do pozostałej pożywki do tworzenia EB, aby uzyskać miano między 40 000 a 80 000 komórek na ml.
5. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 μl na dołek do płytki dolnej 96 V, co daje od 4 000 do 8 000 komórek na studzienkę. Obracać 96-dołkową płytkę w wirówce z odchylaną płytką o masie 400 x g przez 1 minutę, aby zebrać komórki na dnie studzienek i przenieść do inkubatora do hodowli komórkowych. EB uformują się z dnia na dzień, jak pokazano na rysunku 1.

3. Indukcja neuroektodermy

1. Następnego dnia (dzień 0) należy pobrać EBs z płytki 96V pod mikroskopem stereoskopowym i przenieść w małej objętości do 3,5 cm naczynia bakteryjnego zawierającego 2 ml pożywki różnicującej. Delikatnie mieszaj naczynie przez kilka sekund, aby umyć EBs.
2. Dodać 100 μl pożywki różnicującej na dołek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U o bardzo niskim mocowaniu. Pod mikroskopem stereoskopowym przenieś EB w małych objętościach z naczynia do mycia do studzienek 96U (jeden EB na studzienkę). Umieść płytkę 96U w inkubatorze do hodowli komórkowych na 4 dni, aby umożliwić tworzenie neuroektodermy.

4. Powstawanie neuronów

1. W dniu 4 przygotować naczynie do mycia jak w kroku 3.1 i dodatkowo umieścić DMEM/F-12 we wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem za pomocą pożywki różnicującej (1 ml na studzienkę).
2. Poszycie EB
   1. Zbierz EB z płytki 96U, umyj je jak powyżej i ostrożnie wysiewaj je jeden po drugim do dołków 12-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem (około 8 EB na dołek): EB powinny być równomiernie rozmieszczone w dołkach, aby umożliwić niezakłócony wzrost neuronów w ciągu następnych dni (patrz obraz "dzień 5" na rysunku 2).
   2. Przed przeniesieniem 12-dołkowej płytki z powrotem do inkubatora należy pozostawić EB luźno przymocowane przez około 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie przenieść 12-dołkową płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych. Neurony wyrosną z platerowanych EB w sposób promienisty w ciągu najbliższych 4 dni, jak pokazano na rysunku 2 (obraz "dzień 8" po prawej).

5. Tworzenie neuronów jako monowarstwy

1. Alternatywnie do etapów opisanych w pkt 4), w 4. dniu procedury należy pobrać EB do 3,5 cm naczynia bakteryjnego zawierającego 2 ml pożywki różnicującej, następnie przenieść EB w małej objętości do naczynia zawierającego PBS, a następnie do innego naczynia zawierającego Accutase.
2. Pozostawić do wytrawienia do pojedynczych komórek, odwirować przy 200 x g przez 2 minuty, ponownie zawiesić w małej objętości pożywki różnicującej i określić miano komórek za pomocą hematocytometru. Dostosuj miano do 1-2X10⁶ komórek na ml za pomocą pożywki różnicującej (bez Y-27632).
3. Umieścić komórki we wstępnie ogrzanej, 12-dołkowej płytce pokrytej Matrigelem (1 ml na dołek) i przenieść do inkubatora do hodowli komórkowych. Tworzenie neuronów w postaci monowarstw zaobserwowano między 7 a 8 dniem (ryc. 3C). Należy jednak zauważyć, że ten jednowarstwowy wariant procedury nie jest w pełni zoptymalizowany pod względem przeżywalności komórek i najbardziej odpowiedniego substratu.

Wyniki

W naszym poprzednim raporcie, podobnie jak wiele innych, EB z hPSC mogą być generowane po prostu przez ponowne powlekanie agregatów po rutynowym dzieleniu hPSC na płytki o niskim przyleganiu¹⁰. Zwykle skutkuje to szerokim rozkładem wynikowych rozmiarów EB (rysunek 1C, u góry). Innym problemem wynikającym z tego jest to, że EB utrzymywane w zawiesinie mają tendencję do agregacji ze sobą, co prowadzi do jeszcze większej niejednorodności rozmiarów EB. Aby obejść te problemy, podjęliśmy próbę wyge...

Dyskusja

Większość protokołów różnicowania obejmujących tworzenie EB z hPSC, w tym nasza wcześniej opublikowana procedura¹⁰, opiera się na ręcznym lub wspomaganym enzymatycznie zbieraniu hESC w postaci agregatów, co nieuchronnie prowadzi do niejednorodności wielkości EB. Fakt ten prowadzi do zmienności wydajności różnicowania w przypadku niektórych linii komórkowych, co utrudnia systematyczne analizy, w szczególności w średniej skali przepustowości. Co więcej, ręczna sekcja jest pracochłonna, co samo w sobie zagraża sk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Zobacz tekst, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obchodzenia się
z DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poli(alkohol winylowy)	Sigma	363170	Rozpuścić w 0,4% w DMEM/F-12 za pomocą ultradźwiękowej łaźni wodnej / unikać przegrzania / może być przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C przez kilka tygodni
N2 Suplement	Life Technologies	17502-048	100X, przechowywać jako zamrożone podwielokrotności
B27 Suplement	Life Technologies	12587-010	50X, przechowywać jako zamrożone podwielokrotności
Surowica bydlęca	Albumina Sigma	A1595	10% = 500X, przechowywać jako zamrożone podwielokrotności
L-Glutaminy z penicyliną / Streptomycyną	PAA	P11-013	Lub równoważne
FGF2	Peprotech	100-18B	Rozpuścić w 10 μ g / ml w 0,1% BSA / PBS = 1000X, przechowywać jako zamrożone podwielokrotności
ROCK inhibitor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Rozpuścić w 10 mM w DMSO = 1000X, przechowywać jako zamrożone podwielokrotności
PBS	PAA	H15-002	Lub równoważne
Accutase	PAA	L11-007
96-dołkowe płytki z dnem w kształcie litery V	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	Rozpuszczać w ilości 0,5 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w postaci zamrożonych podwielokrotności
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	rozpuszczać w 15 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w postaci zamrożonych podwielokrotności
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	rozpuszczać w 0,5 mM w DMSO = 1000X, przechowywać jako zamrożone porcje
96-dołkowe płytki o ultraniskim mocowaniu z dnem w kształcie litery U Corning		7007
beta-III Tubulina przeciwciało (mysz)	Sigma	T8660	zastosowanie w stosunku 1:1000
beta-III Przeciwciało tubulinowe (królik)	Covance	PRB-435P	zastosowanie w 1:2000
BRN3A (POU4F1) przeciwciało	Santa Cruz	sc-8429	zastosowanie w 1:500
Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt.