Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istniejące protokoły generowania neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) są często żmudne, ponieważ stanowią wieloetapowe procedury obejmujące izolację i ekspansję komórek prekursorowych neuronów przed końcowym różnicowaniem. W porównaniu z tymi czasochłonnymi podejściami odkryliśmy niedawno, że połączona inhibicja trzech szlaków sygnalizacyjnych: TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 oraz FGF/ERK, promuje szybką indukcję neuroektodermy z hPSCs, a następnie bezpośrednie różnicowanie w funkcjonalne neurony. W niniejszej pracy dostosowaliśmy naszą procedurę do nowego formatu płytek wielodobunkowych, aby dodatkowo zwiększyć jej powtarzalność i uczynić ją kompatybilną z zastosowaniami o średniej przepustowości. Obejmuje ona cztery dni formowania neuroektodermy w formie pływających sfer (ciał embrionalnych), po których następują kolejne cztery dni różnicowania w neurony w warunkach adhezyjnych. Większość komórek uzyskanych za pomocą tego protokołu wydaje się być bipolarnymi neuronami sensorycznymi. Ponadto procedura jest wysoce wydajna, nie wymaga specjalistycznych umiejętności i opiera się na prostym, chemicznie zdefiniowanym medium z kosztowo efektywnymi małymi cząsteczkami. Dzięki tym cechom procedura ta może służyć jako użyteczna platforma do dalszych badań funkcjonalnych, a także do metod przesiewowych opartych na komórkach, wymagających ludzkich neuronów sensorycznych lub neuronów dowolnego typu.
Wprowadzenie
hPSC, obejmujące pochodzące z embrionów ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) oraz indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), są pluripotencjalne, co oznacza, że mogą dawać początek różnym liniom komórkowym in vitro 1-2. Do tej pory z hESC wyprowadzono liczne zróżnicowane typy komórek, co potwierdza tezę, że komórki te stanowią cenne narzędzia w badaniach naukowych i podejściach do przesiewu komórkowego, a także dają nadzieję na zastosowanie w terapiach komórkowych.
Protokoły różnicowania neuronalnego dla hESC są zazwyczaj złożone i czasochłonne, ponieważ często opierają się na wstępnym indukowaniu ogólnego przeznaczenia neuronalnego, a następnie na manualnej izolacji progenitorów neuronalnych i późniejszym różnicowaniu końcowym w konkretny, interesujący badacza typ neuronu3-6. W pewnym sensie ta złożoność nie jest zaskakująca i jest nieunikniona, biorąc pod uwagę, że tak zaawansowane protokoły kierowanego różnicowania mają tendencję do stopniowego naśladowania wczesnego rozwoju człowieka, który sam w sobie jest niezwykle złożony. Z drugiej strony może to częściowo odzwierciedlać nasz brak zrozumienia podstawowych procesów molekularnych, co skutkuje protokołami różnicowania, które wciąż są dalekie od pełnej optymalizacji.
W odniesieniu do konwersji niezróżnicowanych hPSCs w neuroektodermę, Pera et al. wykazali, że supresja sygnalizacji BMP / SMAD1/5/8 zwiększa indukcję neuronalną hESCs7. Ponadto wykazano, że inaktywacja sygnalizacji SMAD2/3 sprzyja tworzeniu neuroektodermy8. W związku z tym jednoczesna inaktywacja tych dwóch szlaków wykazuje tendencję do prowadzenia do bardziej efektywnej indukcji neuronalnej hPSCs4,9. Niedawno wykazaliśmy, że trzeci szlak sygnalizacyjny, FGF/ERK, służy jako silny represor najwcześniejszych etapów zaangażowania w kierunku neuroektodermy w hESCs. I odwrotnie, jednoczesna represja wszystkich trzech tych szlaków prowadzi do niemal homogenicznej konwersji hESCs w neuroektodermę w ciągu zaledwie czterech dni10. Następnie w ciągu ośmiu dni zaobserwowano wysoce efektywne różnicowanie terminalne w funkcjonalne neurony. Uzyskane neurony były prawdopodobnie neuronami sensorycznymi obwodowego układu nerwowego, co może częściowo wyjaśniać szybkość ich pochodzenia10. Defekty w utrzymaniu neuronów sensorycznych uznaje się za przyczynę niektórych ludzkich schorzeń, takich jak rodzinna dysautonomia11. Ta procedura różnicowania może stanowić przydatną podstawę do modelowania takich chorób w oparciu o technologię hiPSC12, do dalszej charakterystyki funkcjonalnej, a także do celów aplikacyjnych niewymagających konkretnego typu neuronów.
Jednak strategia różnicowania, którą pierwotnie zastosowaliśmy, polegała na tworzeniu ciałek zarodkowych (EB) z agregatów kolonii hESC10, co skutkowało znaczną heterogenicznością rozmiarów EB, a także zdawało się obniżać wydajność tworzenia neuronów w niektórych liniach komórkowych. Co więcej, ze względu na niejednolitość rozmiarów EB, możliwość systematycznego testowania wpływu dodatkowych czynników wzrostu lub małych cząsteczek w trakcie i po tworzeniu neuronów wydawała się być w pewnym stopniu zaburzona.
W niniejszym raporcie dostosowaliśmy naszą poprzednią procedurę do techniki o średniej przepustowości, opartej na wymuszonej agregacji, aby generować ciała embrionalne (EBs) w sposób ściśle kontrolowany pod względem wielkości, co wykazano również w innych kontekstach13. Następnie EBs wygenerowane w studzienkach w kształcie litery V płytek 96-dołkowych przeniesiono do płytek 96-dołkowych o kształcie litery U z ultra-niskim przytwieraniem, aby zainicjować tworzenie neuroektodermy w zawiesinie. Po czterech dniach EBs można było wysiać, co prowadziło do powstania terminalnie zróżnicowanych neuronów z wysoką wydajnością i jednorodnością. Alternatywnie, EBs z czwartego dnia poddano dysocjacji do pojedynczych komórek i wysiano w ten sposób, co zaowocowało powstaniem monowarstw ludzkich neuronów o niskiej gęstości. Spójne wyniki uzyskano do tej pory przy użyciu dwóch niezależnie wyprowadzonych linii hESC: HuES6 oraz NCL3.
Jako warunek wstępny, pomyślne tworzenie ciał embrioidalnych (EB) było ściśle zależne od zastosowania syntetycznego polimeru, alkoholu poliwinylowego (PVA), wraz z inhibitorem ROCK Y-27632, który jest znany z promowania przeżywalności hESC13-14. W rezultacie jednorodność EB utworzonych w płytkach 96-V została znacznie zwiększona w porównaniu do tworzenia EB jako kultur masowych w oparciu o techniki losowego rozdzielania. System ten zapewnia zatem znacznie lepszą platformę do tworzenia neuroektodermy w kulturze zawiesinowej, a następnie wysoce kontrolowanego różnicowania neuronów w warunkach adhezyjnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie płytek pokrytych Matrigelem oraz pożywek
- Przygotowanie płytek powlekanych Matrigelem. Wykazano, że Matrigel jest preferowanym podłożem do przywierania różnicujących się ciałek zarodkowych (EB) oraz wspomaga efektywny wzrost neuronów z tych struktur10.
- Rozmrozić 10 ml Matrigelu przez noc na lodzie.
- Następnego dnia rozcieńczyć galaretowaty Matrigel dwukrotnością objętości lodowatego DMEM/F-12 i przygotować alikwoty po 1 ml w schłodzonych probówkach stożkowych o pojemności 15 ml, które można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
- Wybrać format płytki do różnicowania neuronalnego. Na przykład, jako punkt wyjścia, zaleca się przeprowadzenie pierwszej serii różnicowania w formacie 12 dołków. Wychłodzić cztery płytki 12-dołkowe w temperaturze 4 °C. Rozmrozić jedną alikwotę zamrożonego Matrigelu, dodając 9 ml schłodzonego DMEM/F-12, a następnie pipetować w górę i w dół, aż cały uprzednio rozcieńczony Matrigel zostanie rozmrożony i rozpuszczony.
- Następnie przenieść zawartość do nowej probówki 50 ml zawierającej 15 ml DMEM/F-12 na lodzie (końcowe rozcieńczenie Matrigelu: 1:75). Następnie dodać 0,5 ml rozcieńczonego Matrigelu do każdego dołka schłodzonych płytek 12-dołkowych. Owinąć płytki Parafilmem i pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.
- Następnego dnia przenieść płytki do temperatury 4 °C. Powlekane płytki można przechowywać przez kilka tygodni przed użyciem.
- Pożywki
Pożywka do tworzenia EB (~15 ml potrzebnych do przeprowadzenia różnicowania w jednej płytce 96-dołkowej - patrz Tabela 1 oraz schemat na Rysunku 2):
DMEM/F-12 z 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng/ml FGF2
10 μM Y-27632
1x PenStrepGln
Pożywka do różnicowania (~30 ml potrzebnych do przeprowadzenia różnicowania w jednej płytce 96-dołkowej, a następnie do formowania neuronów w jednej 12-dołkowej płytce powlekanej Matrigelem, patrz Tabela 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% BSA
0,5 μM PD0325901
15 μM SB431542
0,5 μM Dorsomorfiny
1x PenStrepGln
2. Wymuszona indukcja ciał embrioidalnych (EB)
- Hodować hPSC w preferowanych warunkach bez użycia komórek karmiarek. My stosujemy pożywkę warunkowaną MEF na płytkach 6-dołkowych powlekanych Matrigel15. Jednak inne systemy hodowli, takie jak własne lub komercyjne pożywki zdefiniowane, również powinny być skuteczne. W momencie rozpoczynania eksperymentu z różnicowaniem hPSC powinny być subkonfluencyjne i aktywnie rosnąć.
- Mechanicznie usunąć spontanicznie zróżnicowane kolonie za pomocą sterylnego plastikowego końcówki pipety pod mikroskopem stereoskopowym.
- Przemyć pozostałe niezróżnicowane kolonie PBS, a następnie rozbić do pojedynczych komórek za pomocą Accutase zawierającego 1X Y-27632. Odwirować pojedyncze komórki przy 200 x g przez 2 min, zawiesić ponownie w małej objętości pożywki do formowania EB i oznaczyć miano komórek za pomocą hematocytometru.
- Dodać alikwot komórek do pozostałej pożywki do formowania EB, aby uzyskać miano od 40 000 do 80 000 komórek na ml.
- Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl na dołek do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, co daje od 4 000 do 8 000 komórek na dołek. Wirować płytkę 96-dołkową w wirówce do płytek z koszyczkami wahadłowymi przy 400 x g przez 1 min, aby zebrać komórki na dnie dołków, a następnie przenieść do inkubatora do hodowli komórkowych. EB utworzą się w ciągu nocy, jak pokazano na Rysunku 1.
3. Indukcja neuroektodermy
- Następnego dnia (dzień 0) zebrać ciała embrionalne (EBs) z płytki 96V pod mikroskopem stereoskopowym i przenieść je w niewielkich objętościach do szalki bakteriologicznej o średnicy 3,5 cm zawierającej 2 ml pożywki różnicującej. Delikatnie wstrząsać szalką przez kilka sekund, aby wypłukać EBs.
- Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z półkolistym dnem (U-bottom) o ultra-niskim przywieraniu dodać 100 μl pożywki różnicującej. Pod mikroskopem stereoskopowym przenieść EBs w niewielkich objętościach z szalki do płukania do studzienek 96U (jedno EB na studzienkę). Umieścić płytkę 96U w inkubatorze do hodowli komórkowej na 4 dni, aby umożliwić formowanie się neuroektodermy.
4. Formowanie neuronów
- W dniu 4. przygotować naczynie do płukania zgodnie z krokiem 3.1, a dodatkowo zastąpić DMEM/F-12 w uprzednio ogrzanej płytce 12-dołkowej pokrytej Matrigelem pożywką do różnicowania (1 ml na dołek).
- Wysiewanie ciał embrioidalnych (EB)
- Zebrać EB z płytki 96U, przepłukać je w opisany wyżej sposób i ostrożnie wysiać pojedynczo do dołków płytki 12-dołkowej pokrytej Matrigelem (około 8 EB na dołek): EB powinny być równomiernie rozłożone w dołkach, aby umożliwić niezakłócony wzrost neuronów w kolejnych dniach (patrz obraz „day 5” na Rysunku 2).
- Przed przeniesieniem płytki 12-dołkowej z powrotem do inkubatora pozwolić EB na luźne przytwierdzenie się przez około 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie ostrożnie przenieść płytkę 12-dołkową do inkubatora do hodowli komórkowych. Neurony będą wyrastać z wysianych EB w sposób radialny w ciągu następnych 4 dni, co pokazano na Rysunku 2 (obraz „day 8” po prawej stronie).
5. Tworzenie neuronów w formie monowarstw
- Jako alternatywę dla kroków z punktu 4), w 4. dniu procedury zebrać ciała embrioidalne (EBs) do szalki bakterii o średnicy 3,5 cm zawierającej 2 ml medium różnicującego, następnie przenieść EBs w niewielkiej objętości do szalki z PBS, a potem do kolejnej szalki zawierającej Accutase.
- Poddać trawieniu do uzyskania pojedynczych komórek, odwirować przy 200 x g przez 2 min, resuspendować w niewielkiej objętości medium różnicującego i oznaczyć miano komórek za pomocą hematocytometru. Dostosować miano do 1-2X106 komórek na ml, używając medium różnicującego (bez Y-27632).
- Wysiać komórki na uprzednio ogrzanej płytce 12-dołkowej pokrytej Matrigelem (1 ml na dołek) i przenieść do inkubatora do hodowli komórkowych. Formowanie się neuronów w postaci monowarstw zaobserwowano między 7. a 8. dniem (Rysunek 3C). Należy jednak zaznaczyć, że ten wariant procedury z monowarstwą nie został w pełni zoptymalizowany pod kątem przeżywalności komórek i najodpowiedniejszego podłoża.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W naszym poprzednim raporcie, zgodnie z wieloma innymi doniesieniami, ciała embroidalne (EBs) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) można było generować po prostu poprzez ponowne wysiewanie agregatów podczas rutynowego pasażowania hPSCs do naczyń o niskim stopniu przywierania10. Zazwyczaj skutkuje to szerokim rozkładem wielkości otrzymanych EBs (Ryc. 1C, góra). Kolejnym problemem wynikającym z tej metody jest tendencja EBs utrzymywanych w zawiesinie do agregowania się ze ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Większość protokołów różnicowania obejmujących tworzenie EB z hPSC, w tym nasza wcześniej opublikowana procedura10, opiera się na ręcznym lub wspomaganym enzymatycznie pozyskiwaniu hESC w formie agregatów, co nieuchronnie prowadzi do heterogeniczności rozmiarów EB. Fakt ten powoduje zmienność w wydajności różnicowania w przypadku niektórych linii komórkowych, co utrudnia systematyczne analizy, szczególnie w skali średniej przepustowości. Ponadto ręczna dyssekcja jest pracochłonna, co samo w sobie ogranicza ska...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana przez Max Planck Society.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | Szczegóły dotyczące obchodzenia się z odczynnikiem znajdują się w tekście |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(alkohol winylowy) | Sigma | 363170 | Rozpuścić w stężeniu 0,4% w DMEM/F-12 przy użyciu ultradźwiękowej kąpieli wodnej / unikać przegrzewania / można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni |
| Suplement N2 | Life Technologies | 17502-048 | 100X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| Suplement B27 | Life Technologies | 12587-010 | 50X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| Swojska albumina surowicza (BSA) | Sigma | A1595 | 10% = 500X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| L-glutamina z penicyliną i streptomycyną | PAA | P11-013 | Lub odpowiednik |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Rozpuścić w stężeniu 10 μg/ml w 0,1% BSA / PBS = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| Inhibitor ROCK Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Rozpuścić w stężeniu 10 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| PBS | PAA | H15-002 | Lub odpowiednik |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery V | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Rozpuścić w stężeniu 0,5mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | rozpuścić w stężeniu 15 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| Dorsomorfina | Santa Cruz | sc-200689 | rozpuścić w stężeniu 0,5 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach |
| Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery U o ultra-niskiej adhezji | Corning | 7007 | |
| Przeciwciało przeciwko beta-III tubulinie (mysie) | Sigma | T8660 | stosować w rozcieńczeniu 1:1000 |
| Przeciwciało przeciwko beta-III tubulinie (królicze) | Covance | PRB-435P | stosować w rozcieńczeniu 1:2000 |
| Przeciwciało przeciwko BRN3A (POU4F1) | Santa Cruz | sc-8429 | stosować w rozcieńczeniu 1:500 |
| Tabela 1. Specyficzne odczynniki i sprzęt. |
Bibliografia
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
