Artykuł metodologiczny

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4338

⸱

28 listopada 2012

 ,  , 
1Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham , 2Department of Medicine, The University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Streszczenie

Procedury naczyniowe obejmujące anastomozy u myszy są powszechnie uważane za trudne i w dużym stopniu zależne od umiejętności poszczególnych chirurgów. Jest to w dużej mierze prawda, jednak istnieje szereg istotnych zasad, które mogą zmniejszyć trudność tych zabiegów i zwiększyć ich powtarzalność. Ortotopowy przeszczep aorty jest doskonałą procedurą do nauki tych zasad, ponieważ obejmuje tylko dwie anastomozy koniec-do-końca, ale wymaga dobrej techniki szycia i odpowiedniego obchodzenia się z naczyniami, aby zapewnić stały sukces. Procedura ta rozpoczyna się od pobrania odcinka aorty brzusznej od zwierzęcia dawcy, a następnie od przecięcia natywnej aorty u biorcy. Pobraną aortę umieszcza się następnie między przeciętymi końcami aorty biorcy i przyszywa za pomocą anastomoz koniec-do-końca. Pomyślne osiągnięcie tego celu wymaga wysokiego stopnia koncentracji, odpowiednich narzędzi, pewnej ręki oraz świadomości tego, jak łatwo można uszkodzić naczynia krwionośne myszy, co prowadzi do zakrzepicy. Nauka tych kluczowych zasad zajmuje większość czasu osób początkujących podczas nauki mikrochirurgii u małych gryzoni. W całym niniejszym protokole odwołujemy się do tych ważnych punktów. Model ten może być wykorzystany do badania chorób naczyniowych w różnych systemach eksperymentalnych1-8. W przedstawionym tutaj kontekście jest on najczęściej stosowany do badania naczyniowych powikłań potransplantacyjnych, częstego długoterminowego powikłania po przeszczepieniu narządów litego, w którym w obrębie allograftu dochodzi do hiperplazji intimy. Główną zaletą tego modelu jest to, że ułatwia on ilościowe analizy morfometryczne, a przeszczepione naczynie znajduje się bezpośrednio obok naczynia endogennego, które może służyć jako dodatkowa kontrola9. Technika opisana tutaj jest najczęściej stosowana u myszy o masie 18-25 gramów. Większość naszego doświadczenia zgromadziliśmy, pracując ze szczepami C57BL/6J, BALB/cJ oraz C3H/HeJ.

Protokół

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Procedury chirurgiczne, niezależnie od tego, jak starannie są przeprowadzane, powodują znaczny stres. Aby zminimalizować skutki takiego stresu i zmaksymalizować rezerwy organizmu, zwierzęta powinny przebywać w wiryarium przez co najmniej 72 hr przed zabiegiem10,11.
  2. Narzędzia chirurgiczne, gaza i tampony muszą być sterylne. Stosowanie sterylnych rękawiczek nie jest konieczne, pod warunkiem że tylko końcówki instrumentów dotykają szwów lub pola operacyjnego.
  3. W celu hemostazy kluczowe jest, aby nacisk zacisków był minimalny i niezbędny. Uszkodzenie naczynia spowodowane nadmiernym naciskiem lub gwałtownym obchodzeniem się z tkanką spowoduje zakrzepicę, co prowadzi do paraliżu tylnych kończyn, niedokrwienia jelit i śmierci w ciągu 24 hr. Stwierdzono, że zastosowanie zacisków o nacisku nieprzekraczającym 2 gm/cm2 eliminuje ten problem. Zaciski te wymieniono w Tabeli 1. Nacisk zacisków jest podany w specyfikacjach instrumentów produkowanych przez wysokiej jakości producentów narzędzi chirurgicznych. Zaobserwowano, że tanie zaciski lub zaciski jednorazowe uniwersalnie wywierają zbyt duży nacisk.
  4. Lokalizacja naczyń obocznych, a także wzajemne położenie aorty brzusznej i żyły głównej dolnej (IVC) są zależne od szczepu. Można również napotkać niewielkie różnice między poszczególnymi myszami, szczególnie w lokalizacji naczyń obocznych.

2. Operacja dawcy

  1. Myszy można znieczulić izofluranem (indukcja 1,5-2,5 %, podtrzymanie 1,0 % w powietrzu) lub pentobarbitalem (55-65 mg/kg). Pentobarbital narzuca ograniczenie czasowe (do 1,5 h), ale daje chirurgowi możliwość obracania zwierzęcia w celu lepszego dostępu, jeśli jest to wymagane. Czas znieczulenia można wydłużyć do 2 h, aplikując w razie potrzeby 2-3 krople środka znieczulającego na jelito lub wątrobę w trakcie operacji. Ketamina/ksylazyna (100 mg/kg masy ciała dla ketaminy i 7 mg/kg dla ksylazyny, ip) może być również stosowana przez doświadczonych chirurgów, którzy są w stanie zakończyć procedurę w ciągu 1 do 1,5 h, jednak ma ona węższy bezpieczny zakres dawek. W USA stosowanie pentobarbitalu stało się w ostatnich latach bardziej problematyczne ze względu na niedobory dostaw. Niezbędne jest monitorowanie głębokości znieczulenia, aby upewnić się, że jest ono wystarczające. Odruch uciskania palca u nogi jest najlepszym wskaźnikiem odpowiedniej głębokości, lecz należy również zwracać uwagę na częstotliwość oddychania oraz inne ruchy.
  2. Po indukcji znieczulenia należy użyć żelu depilacyjnego lub golarki, aby usunąć sierść z brzusznej strony brzucha.
  3. Umieść zwierzę na stole operacyjnym, używając taśmy laboratoryjnej, aby utrzymać je w pozycji z rozstawionymi kończynami. Metalowy stół operacyjny umożliwia zastosowanie pod nim mata grzewczej w celu zapewnienia stabilności temperatury podczas operacji. Temperaturę maty grzewczej, która jest urządzeniem klasy konsumenckiej do użytku domowego, kontrolujemy ręcznie. Temperaturę utrzymuje się w zakresie 35-38°. Metalowy stół operacyjny jest również łatwy do sterylizacji pomiędzy zabiegami.
  4. Zdezynfekuj obszar za pomocą środka odkażającego, takiego jak chlorheksydyna, a następnie przemyj etanolem. Powtórz tę procedurę trzy razy, aby zapewnić odpowiednią dezynfekcję. Pozwoli to również usunąć wszelkie pozostałe odcięte fragmenty sierści, jeśli są obecne.
  5. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie przez ścianę ciała, aby odsłonić trzewia jamy brzusznej.
  6. Używając patyczka watnego, odsuń trzewia na bok, aby odsłonić główne naczynia krwionośne brzucha. Trzewia umieszcza się na kawałku gazy nasączonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej, aby utrzymać ich wilgotność.
  7. Stosując rozwarstwianie tępym narzędziem, bardzo ostrożnie wypreparuj aortę brzuszną z otaczających ją tkanek. Zachowaj szczególną ostrożność podczas oddzielania naczynia od żyły głównej dolnej. Wystąpią jedna lub więcej odgałęzień, takich jak tętnica lędźwiowa, które należy ostrożnie unieść i wypalić. Wypreparowany odcinek aorty powinien znajdować się poniżej naczyń nerkowych i powyżej rozwidlenia aorty na tętnice udowe. Odcinek ten może służyć jako materiał donora dla maksymalnie dwóch biorców, w zależności od liczby naczyń odgałęziających i wielkości zwierzęcia donora.
  8. Zawieź szew tuż poniżej tętnic nerkowych oraz kolejny tuż powyżej rozwidlenia. Za pomocą nożyczek przetnij aortę, a następnie całkowicie wypłucz przeszczep roztworem soli fizjologicznej zawierającym 200 U/ml heparyny. Bardzo ostrożnie przytrzymaj jeden koniec naczynia i powoli wlewaj roztwór soli fizjologicznej tak, aby przepływał przez naczynie siłą grawitacji. Nie dopuść do przedostania się pęcherzyków powietrza do naczynia. Końcówki naczynia należy dotykać jak najmniej, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia intimy, co w późniejszym czasie spowoduje zakrzepicę. Usuń naczynie z pola operacyjnego i natychmiast umieść je w pojemniku z lodowatą solą fizjologiczną. Pozostaw zwierzę donora do upuszczenia krwi.

3. Operacja u biorcy

  1. Zanurz zwierzę w narkozie zgodnie z powyższą procedurą i nałóż żel depilacyjny lub użyj golarki, aby usunąć sierść z brzucha. Bezpośrednio przed nacięciem podajemy dawkę buprenorfiny podskórnie w ilości 0.1 mg/kg w celu zapewnienia analgezji.
  2. Zamocuj zwierzę na polu operacyjnym za pomocą taśmy laboratoryjnej. Zwierzę musi zostać umieszczone na ciepłym stole operacyjnym, co pomoże utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu.
  3. Nałóż do oczu maść oftalmiczną z gentamycyną, aby zapobiec ich wysychaniu.
  4. Zdezynfekuj brzuch, a następnie przemyj go etanolem. Powtórz tę procedurę trzy razy, aby zapewnić odpowiednią dezynfekcję.
  5. Przed przejściem do kolejnego kroku ponownie sprawdź głębokość znieczulenia.
  6. Wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej skóry i ściany ciała w dwóch etapach, uważając, aby nie uszkodzić tkanek znajdujących się poniżej.
  7. Wprowadź rozwieracz, aby utrzymać otwarte nacięcie brzuszne. Skieruj zestaw śrub w stronę tylnej części ciała, aby główna część zacisku nie przeszkadzała w pracy.
  8. Zmocz kwadrat sterylnej gazy solą fizjologiczną i połóż go na jelitach. Opierając palec delikatnie o gazę, wprowadź patyczek watny pod jelita i ostrożnie odsuń jelita na bok, tak aby spoczywały na gazie. Weź kolejny kawałek gazy, połóż go na jelitach i zmocz solą fizjologiczną.
  9. Usuń wszelką tkankę tłuszczową pokrywającą aortę i żyłę główną dolną (IVC). Czyń to delikatnie; IVC jest bardzo krucha.
  10. Za pomocą pęsety ostrożnie oddziel aortę podnerkową od IVC. Oczyść obszar wystarczająco duży, aby zmieściły się dwa zaciski z odpowiednim odcinkiem naczynia pomiędzy nimi, tak aby po podziale pozostało wystarczająco dużo naczynia do przyszycia przeszczepu. Podczas preparowania szukaj odgałęzień naczyń; jeśli to konieczne, koaguluj je kauteryzatorem o niskiej temperaturze.
  11. Załóż zacisk naczyniowy tuż poniżej tętnicy nerkowej oraz drugi tuż nad rozwidleniem.
  12. Przetnij aortę. Końce aorty zazwyczaj się cofają, pozostawiając przestrzeń około 5 mm. Sprawdź hemostazę. Jeśli zaciski działają prawidłowo, po przecięciu powinna wydostać się tylko niewielka ilość krwi. Jeśli krwawienie trwa, sprawdź zaciski, aby upewnić się, że nic im nie przeszkadza. Należy pamiętać, że żaden fragment aorty nie jest usuwany; zostaje ona jedynie podzielona.
  13. Przepłucz przecięte końce solą fizjologiczną z heparyną (200 U/ml), a następnie usuń nadmiar roztworu za pomocą tamponu.
  14. Zamocuj przeszczep w miejscu za pomocą trzech szwów przerywanych na każdym końcu. Przyszyj najpierw jedną stronę anastomozy na każdym końcu, a następnie uzupełnij resztę szwem ciągłym lub kolejnymi szwami przerywanymi. Wystarczające jest zastosowanie siedmiu do ośmiu szwów przerywanych. W przypadku stosowania szwu ciągłego upewnij się, że ściany naczyń pozostają rozluźnione i nie powodujesz zwężenia w miejscu anastomozy.
  15. Ostrożnie zdejmij zacisk z końca kranialnego i sprawdź, czy nie ma przecieków w liniach szwów. Niewielkie przesiąkanie jest dopuszczalne, pod warunkiem że ustąpi w ciągu około minuty. Jeśli wyciek jest większy, można zastosować pojedynczy szew w celu zatamowania krwawienia.
  16. Delikatnie uciśnij aortę powyżej miejsca anastomozy zwilżonym aplikatorem watnym, a następnie zdejmij drugi zacisk. Kilkukrotnie delikatnie uciśnij i puść, sprawdzając, czy aorta wydaje się drożna. Przeszczep zostanie natychmiast ukrwiony, a widoczne powinno być tętno.
  17. Usuń gazę pokrywającą jelita i przesuń je z powrotem na miejsce. Unikaj skręcenia jelit i zachowaj prawidłową orientację anatomiczną.
  18. Zamknij warstwę mięśniową, używając nici 5-0 Vicryl.
  19. Zamknij skórę, używając nici 5-0 lub 6-0 prolene.
  20. Przed zakończeniem znieczulenia podaj myszy podskórnie karprofen w dawce 5 mg/kg, aby wzmocnić analgezję.
  21. Podaj myszy podskórnie 0.5-0.8 ml soli fizjologicznej.
  22. Umieść mysz w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji. Monitoruj ją uważnie podczas wybudzania, aby upewnić się, że przebiega ono prawidłowo. 2-3 h po operacji mysz powinna zachowywać się stosunkowo normalnie. W 12 h po zabiegu podaj zwierzęciu buprenorfinę podskórnie w dawce 2 mg/kg w celu zapewnienia analgezji. Jeśli w dowolnym momencie zwierzę przyjmie wymuszoną pozycję (zgarbienie), wydaje dźwięki lub wykazuje ograniczony zakres ruchu, zbadaj przyczynę problemu. Jeśli nie można ustalić i wyeliminować jednoznacznej przyczyny, zwierzę należy uśpić zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Po 24 h zwierzę powinno otrzymać kolejną dawkę karprofenu podskórnie w ilości 5 mg/kg. Paraliż kończyn tylnych wskazuje na niepowodzenie anastomozy lub wystąpienie zakrzepu; w takiej sytuacji zwierzę należy uśpić.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przeszczep aorty. Białe strzałki wskazują linie szwów. Przejezdny przeszczep wykazuje widoczne tętno. Rysunek 2 obrazuje typowy eksperyment, w którym monitorowano przeżywalność biorców przez okres 56 dni. Jedna grupa składała się z myszy biorców typu dzikiego (C57BL/6 x FVB) z przeszczepioną aortą BALB/c. Druga grupa, oznaczona jako „KO”, składa się z biorców (C57BL/6 x FVB) z niedoborem ekspresji hemooksygenazy-1, co prowadzi do zakrzepicy przeszczepów w ciągu 24 h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Modele mysie w transplantacji aorty oferują szereg zalet, ponieważ myszy są bardzo dobrze zdefiniowane immunogenetycznie9,12,13 i można je łatwo modyfikować w celu zmiany ekspresji specyficznych genów, jeśli jest to pożądane. Jak wspomniano we wstępie, chirurgia naczyniowa u myszy jest trudniejsza niż w większości modeli ze względu na rozmiar naczyń. Nawet duże tętnice, takie jak aorta, mają zazwyczaj średnicę wewnętrzną nie większą niż 100-200 μm, więc manipulowanie tymi naczyniami wymaga znacznych umiejętnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była finansowana ze środków podstawowych zasobów NIH P30 O'Brien center (DK 079337).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klemmy naczynioweFine Science Tools00396-01 (Rozmiar B-1)
Pincety DumontFine Science Tools11293-00
Nici mikrochirurgiczne z igłą 10-0AROSurgicalTK-107038
Nożyczki prosteRoboz Surgical Instrument Co.RS-5620
Kauteryzator niskotemperaturowyBeaver-Visitec International8441000
Hak samopodtrzymującyWorld Precision Instruments14240

Bibliografia

  1. Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
  2. Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis. J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).
  3. Calise, D., et al. Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease. Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).
  4. Thomsen, M., et al. An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection. Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).
  5. Benza, R. L., George, J. F. Aortic graft transplantation in mice. J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).
  6. Chereshnev, I., et al. Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation. The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).
  7. Cho, H. R., et al. Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice. J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).
  8. Zhong, R. Organ transplantation in mice: current status and future prospects. Microsurgery. 19, 52-55 (1999).
  9. George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).
  10. Gorska, P. Principles in laboratory animal research for experimental purposes. Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).
  11. Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. Effects of shipping on the immune function in mice. Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).
  12. Sun, H., et al. Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation. Microsurgery. 18, 368-371 (1998).
  13. Chen, B., et al. Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation. Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).
  14. Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl. Proc. 5, 733-735 (1973).
  15. Chang, E. I., et al. Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels. Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

T tnica g wna myszyzespolenie koniec do ko camodel choroby naczyniowejnaczyniowa choroba po przeszczepieniuhiperplazja intimyanaliza morfometrycznatechnika mikrochirurgicznas l fizjologiczna z heparynprocedura kauteryzacji

Powiązane artykuły