Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie luminescencji Czerenkowa (CLI) w monitorowaniu terapii nowotworowej

13.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4341

⸱

13 listopada 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology and Bio-X Program Canary Cancer at Stanford for Cancer Early Detection, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym materiale opisano zastosowanie obrazowania luminescencji Czerenkowa (CLI) do monitorowania przedklinicznego leczenia nowotworów. Metoda ta wykorzystuje promieniowanie Czerenkowa (CR) oraz obrazowanie optyczne (OI) do wizualizacji sond znakowanych izotopowo, stanowiąc tym samym alternatywę dla PET w przedklinicznym monitorowaniu terapeutycznym i przesiewaniu leków.

Streszczenie

W obrazowaniu molekularnym tomografia emisyjna pozytonów (PET) oraz obrazowanie optyczne (OI) są dwiema najważniejszymi, a tym samym najszerzej stosowanymi modalnościami1-3. PET charakteryzuje się doskonałą czułością i możliwością kwantyfikacji, natomiast OI wyróżnia się brakiem promieniowania, stosunkowo niskim kosztem, krótkim czasem skanowania, wysoką przepustowością oraz szeroką dostępnością dla badaczy podstawowych. Jednakże obie modalności mają również swoje wady. PET cechuje się niską rozdzielczością przestrzenną i wysokimi kosztami, podczas gdy OI jest ograniczone głównie do zastosowań przedklinicznych ze względu na ograniczoną penetrację tkanek oraz znaczne rozproszenie sygnałów optycznych w grubości żywych tkanek.

Niedawno, dzięki odkryciu obrazowania luminescencji Czerenkowa (CLI)4-6, powstał pomost między PET a OI. CLI jest nową metodą obrazowania, która wykorzystuje promieniowanie Czerenkowa (CR) do obrazowania radionuklidów za pomocą instrumentów OI. Rosyjski laureat Nagrody Nobla, Alekseyevich Czerenkow i jego współpracownicy odkryli CR w 1934 roku. Jest to forma promieniowania elektromagnetycznego emitowanego, gdy naładowana cząstka porusza się z prędkością nadświetlną w ośrodku dielektrycznym7,8. Cząstka naładowana, niezależnie od tego, czy jest to pozyton czy elektron, zaburza pole elektromagnetyczne ośrodka poprzez przemieszczanie elektronów w jego atomach. Po ustąpieniu zaburzenia emitowane są fotony, gdy przemieszczone elektrony wracają do stanu podstawowego. Przykładowo, oszacowano, że jeden rozpad 18F generuje średnio 3 fotony w wodzie5.

Od momentu swojego powstania metoda CLI była badana pod kątem zastosowań w szerokim zakresie badań przedklinicznych, w tym m.in. w obrazowaniu guzów in vivo, obrazowaniu genów reporterowych, opracowywaniu radiotracerów oraz obrazowaniu multimodalnym4,5,9,10,11. Główną przyczyną sukcesu metody CLI jest fakt, że nowa technologia ta wykorzystuje niski koszt i szeroką dostępność OI do obrazowania radionuklidów, które wcześniej obrazowano jedynie za pomocą droższych i mniej dostępnych modalności obrazowania nuklearnego, takich jak PET.

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wykorzystania CLI do monitorowania terapii lekami przeciwnowotworowymi. Nasz zespół zbadał niedawno to nowe zastosowanie i potwierdził jego wykonalność w badaniu typu proof-of-concept12. Wykazaliśmy, że CLI i PET wykazują doskonałe korelacje w różnych ksenoprzeszczepach nowotworowych i przy użyciu różnych sond obrazujących. Jest to zgodne z nadrzędną zasadą CR, zgodnie z którą CLI w rzeczywistości wizualizuje te same radionuklidy co PET. Jako czynnik terapeutyczny wybraliśmy Bewacyzumab (Avastin; Genentech/Roche), ponieważ jest on dobrze znanym inhibitorem angiogenezy13,14. Przewiduje się, że rozwój tej technologii w najbliższej przyszłości może mieć znaczący wpływ na przedkliniczny rozwój leków, screening, a także monitorowanie terapii u pacjentów otrzymujących leczenie.

Protokół

1. Model nowotworowy

  1. Hodować komórki H460 (American Type Culture Collection) w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen Life Technologies). Należy zaznaczyć, że wybór linii komórkowych, pożywek hodowlanych, miejsc inokulacji, liczby ksenoprzeszczepów na mysz oraz inne kwestie powinny być dostosowane do celów konkretnego badania. W tym przypadku przedstawiamy jedynie jeden konkretny projekt badawczy w celu ilustracji.
  2. Utrzymywać linie komórkowe w atmosferze nawilżonej z 5% CO2 w temperaturze 37 °C i wymieniać pożywkę na świeżą co drugi dzień.
  3. Po utworzeniu się monowarstwy komórek o 75% konfluencji, odłączyć monowarstwę za pomocą trypsyny i zdysocjować komórki do zawiesiny jednokomórkowej w celu dalszej hodowli.
  4. Zawiesić około 1 × 106 komórek H460 w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; Invitrogen) i zaimplantować podskórnie w lewym i prawym barku myszy nude (samice myszy nude atymiczne (nu/nu), w wieku 4 - 6 tygodni, Charles River Laboratories, Inc.).
  5. Pozostawić guzy do urośnięcia do objętości 150 - 200 mm3. W przypadku ksenoprzeszczepów guzów H460 osiągnięcie takiej wielkości zajmuje około 2 tygodni. Do monitorowania wielkości guzów stosuje się standardowy pomiar suwmiarką.
  6. Gdy guzy osiągną optymalną wielkość, myszy z guzami są gotowe do rozpoczęcia leczenia oraz obrazowania in vivo za pomocą PET i CLI.

2. PET

  1. Przeprowadź badania PET zgodnie z poniższym harmonogramem lub jego wariantem, w zależności od konkretnego projektu (Rysunek 1)12. Na opracowanie harmonogramu może wpływać szereg czynników, w tym między innymi wybór linii komórkowych ksenoprzeszczepów nowotworowych, leków przeciwnowotworowych oraz schematów dawkowania. W tym miejscu przedstawiamy tylko jeden konkretny harmonogram obrazowania. Badania CLI należy przeprowadzić zgodnie z tym samym harmonogramem co badania PET, przy czym CLI wykonuje się bezpośrednio po odpowiadającym mu badaniu PET. Należy również zaznaczyć, że celem badań PET jest przede wszystkim walidacja wyników CLI. W przypadku użytkowników, którzy chcą wykorzystać instrumenty OI wyłącznie do obrazowania sond znakowanych izotopowo, badanie PET nie jest konieczne. Jeśli jednak pożądana jest walidacja za pomocą PET, należy podkreślić, że instrumenty PET i CLI muszą znajdować się w bardzo bliskiej odległości, aby walidacja zakończyła się sukcesem ze względu na krótki okres półtrwania 18F (109,77 min).
  2. Podziel myszy na grupy badawcze i kontrolne (n ≥ 3 w każdej). Myszy w grupie badawczej poddaj leczeniu poprzez 2 iniekcje bevacizumabu w dawce 20 mg/kg w dniu 0 i 2. Dzień 0 definiuje pierwsza iniekcja. Należy pamiętać, że w dniu -1 należy przeprowadzić skan wstępny za pomocą PET i CLI.
  3. Badanie PET małych zwierząt u myszy z nowotworem należy przeprowadzić przy użyciu skanera dla modeli gryzoni R4 (Siemens Medical Solutions USA, Inc.).
  4. Zanurz wszystkie myszy w znieczuleniu 2% izofluranu (Aerrane; Baxter) i wstrzyknij 3'-deoksy-3'-18F-fluorotymidynę (18F-FLT; 7,3 - 8,0 MBq [198 - 215 μCi]) do żyły ogonowej. Sondę PET należy rozcieńczyć w PBS przed iniekcją.
  5. Po 1 h ponownie znieczul myszy, a następnie umieść znieczulone zwierzęta w pozycji brzusznej w pobliżu centrum pola widzenia skanera PET dla małych zwierząt.
  6. Wykonaj trzy minutowe skany statyczne i zrekonstruuj obrazy za pomocą dwuwymiarowego algorytmu oczekiwania maksymalnego z uporządkowanymi podzbiorami (OSEM). Korekcja tła nie jest konieczna.
  7. Wyznacz obszary zainteresowania (ROI; 5 pikseli dla przekrojów czołowych i poprzecznych) nad nowotworami na obrazach czołowych całego ciała skorygowanych o rozpad izotopu. Wyznacz maksymalną liczbę zliczeń na piksel na minutę z ROI i przelicz na zliczenia na mililitr na minutę, korzystając ze stałej kalibracyjnej. Przy założeniu gęstości tkanki 1 g/ml, przelicz ROI na zliczenia na gram na minutę. Wyznacz wartości %ID/g pochodzące z ROI obrazu, dzieląc zliczenia na gram na minutę przez dawkę wstrzykniętą. Korekcja tłumienia nie jest konieczna.

3. CLI

  1. CLI należy przeprowadzić przy użyciu systemu IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Pozyskiwanie i analiza obrazów powinny być wykonane za pomocą oprogramowania Living Image 3.0 (Caliper Life Sciences). Obrazowanie spektralne z rozdzielczością długości fali należy przeprowadzić przy użyciu 18-elementowego zestawu filtrów emisji wąskopasmowej (490 - 850 nm). Ponownie, w przypadku każdej myszy, należy wykonać CLI bezpośrednio po PET, aby zminimalizować stopień rozpadu promieniotwórczego, jeśli badania PET są uwzględnione w protokole.
  2. Umieścić zwierzęta w komorze światłoszczelnej w znieczuleniu izofluranem. W celu zwiększenia przepustowości można umieścić jednocześnie kilka myszy.
  3. Pozyskać obrazy przy czasie ekspozycji 3 min (f/stop=1, binning=4). Do pozyskiwania wszystkich obrazów należy zastosować te same ustawienia oświetlenia (napięcie lampy, filtry, f/stop, pola widzenia, binning). Do obliczenia natężenia sygnału tkanki tła należy wykorzystać obszar skóry grzbietowej. Znormalizować emisję fluorescencji do wartości fotonów na sekundę na centymetr kwadratowy na steradian (p/s/cm2/sr).

4. Reprezentatywne wyniki

Porównanie wizualne obrazów CLI i PET można przeprowadzić w łatwy sposób. Po ujednoliceniu paska skali dla obrazów z tej samej modalności i zestawieniu obrazów CLI oraz PET obok siebie, na tym reprezentatywnym panelu (Rysunek 2A) można zauważyć, że zarówno CLI, jak i PET wykazały znacząco zmniejszone sygnały z ksenoprzeszczepów H460 u myszy leczonych w okresie od czasu przed leczeniem do 3. dnia, co sugeruje istotny efekt terapeutyczny. Dla porównania, u myszy nieleczonych w tym samym okresie czasu obserwowano sygnały od umiarkowanie zwiększonych do niezmienionych (dane nie zostały przedstawione). Już sama inspekcja wizualna pozwala zauważyć dobrą zgodność między kontrastami guzów wizualizowanymi za pomocą CLI i PET. W rzeczywistości korelacja wizualna ta posiada wystarczającą rozdzielczość, aby ukazać centralną martwicę guza wtórną do zastosowanego schematu leczenia przeciwnowotworowego (należy porównać obrazy CLI i PET z 3. dnia). W celu walidacji wyników obrazowania można przeprowadzić analizy ilościowe i analizę korelacji.

Ilościowa analiza obrazów CLI oraz PET i proste dopasowanie za pomocą regresji liniowej wykazały, że obie metody wykazują rzeczywiście doskonałą korelację (Rysunek 2B, R2=0,9309 dla grupy leczonej badanej za pomocą 18F-FLT). Co istotne, we wszystkich naszych badaniach obrazowych CLI i PET z wykorzystaniem różnych modeli nowotworowych i różnych leków przeciwnowotworowych nachylenia dopasowań są również niezwykle zbliżone, co sugeruje doskonałe dopasowanie regresji liniowej nawet w przypadku zagregowania wszystkich danych (dane nie pokazano). Oba reprezentatywne obrazy zostały zaadaptowane z naszej poprzedniej publikacji12.

Schemat osi czasu wzrostu guza u myszy obejmujący wstrzykiwanie komórek, leczenie lekiem, PET oraz analizę CLI.
Rycina 1. Schemat projektu eksperymentalnego badań PET i CLI. Guzy wszczepiono obustronnie w okolicy barku i pozwolono im urosnąć do 150-200 mm3, a myszy z guzami poddano obrazowaniu in vivo za pomocą PET i CLI w dniach -1, 1 i 3. Leczenie bevacizumabem przeprowadzono poprzez 2 iniekcje w dawce 20 mg/kg w dniach 0 i 2.

Schematy obrazowania CLI i PET; wykres obrazowania optycznego w porównaniu do PET; równanie y=0,0005910x+0,1764.
Rysunek 2. (A) Obrazy CLI i PET in vivo myszy z ksenoprzeszczepami H460 leczonych Bevacizumabem przed leczeniem (skan wstępny) oraz po leczeniu (dzień 3). (B) Odpowiadająca analiza ilościowa wyników CLI i PET (n=3) oraz ich korelacje. Obrazy zaadaptowane z (6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CLI wyłania się jako obiecująca technika obrazowania molekularnego, która znalazła zastosowanie w wielu badaniach z zakresu nauk podstawowych, a nawet w praktyce klinicznej4,5,15,16,17. Główne zalety CLI w porównaniu z tradycyjnymi metodami obrazowania nuklearnego, takimi jak PET, wynikają z wykorzystania instrumentów OI, które są łatwiejsze w obsłudze, charakteryzują się krótkim czasem akwizycji i wysoką przepustowością, są znacznie tańsze i bardziej dostępne dla badaczy. Ponadto tym, co odróżnia CLI od ogóln...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Przyznajemy, że wsparcie dla niniejszych badań zapewnili National Cancer Institute (NCI) w ramach grantu R01 CA128908 oraz Stanford Medical Scholar Research Fellowship. Nie zgłoszono żadnych innych potencjalnych konfliktów interesów związanych z tym artykułem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa H460American Type Culture CollectionNumer ATCC: HTB-177
Pożywka RPMI 1640Invitrogen Life Technologies12633-012
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen Life Technologies10091-148
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen Life Technologies15640-055
Bufor fosforanowo-solny (PBS)Invitrogen Life Technologies10010-023
Samicze myszy nagiątne atymiczneCharles River Laboratories, Inc.Kod szczepu: 088
Bewacyzumab (Avastin)Genentech/RocheN/D
MicroPET Rodent R4Siemens Medical Solutions USA, Inc.N/D
Izofluran (Aerrane)BaxterNumer Baxter: AHN3637
IVIS SpectrumCaliper Life SciencesN/D

Bibliografia

  1. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219 (2), 316(2001).
  2. Chen, K., Chen, X. Positron emission tomography imaging of cancer biology: current status and future prospects. Semin. Oncol. 38 (1), 70(2011).
  3. Solomon, M., Liu, Y., Berezin, M. Y., et al. Optical imaging in cancer research: basic principles, tumor detection, and therapeutic monitoring. Med. Princ. Pract. 20 (5), 397(2011).
  4. Liu, H., Ren, G., Miao, Z., et al. Molecular Optical Imaging with Radioactive Probes. PLoS One. 5 (3), e9470(2010).
  5. Robertson, R., Germanos, M. S., Li, C., et al. Optical imaging of Cerenkov light generation from positron-emitting radiotracers. Phys. Med. Biol. 54 (16), N355(2009).
  6. Xu, Y., Liu, H., Cheng, Z. Harnessing the power of radionuclides for optical imaging: Cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 52 (12), 2009(2011).
  7. Cerenkov, P. Visible emission of clean liquids by action of g-radiation. Dokl Akad Nauk SSSR. 2, 451(1934).
  8. Cerenkov, P. A. Visible radiation produced by electrons moving in a medium with velocities exceeding that of light. Phys Rev. 52 (4), 0378(1937).
  9. Boschi, F., Calderan, L., D'Ambrosio, D., et al. In vivo 18F-FDG tumour uptake measurements in small animals using Cerenkov radiation. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 38 (1), 120(2011).
  10. Liu, H., Ren, G., Liu, S., et al. Optical imaging of reporter gene expression using a positron-emission-tomography probe. J. Biomed. Opt. 15 (6), 060505(2010).
  11. Park, J. C., Yu, M. K., An, G. I., et al. Facile preparation of a hybrid nanoprobe for triple-modality optical/PET/MR imaging. Small. 6 (24), 2863(2010).
  12. Xu, Y., Chang, E., Liu, H., et al. Proof-of-concept study of monitoring cancer drug therapy with cerenkov luminescence imaging. J. Nucl. Med. 53 (2), 312(2012).
  13. Ellis, L. M. Bevacizumab. Nat. Rev. Drug Discov. , Suppl S8. (2005).
  14. Hochster, H. S. Bevacizumab in combination with chemotherapy: first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer. Semin. Oncol. 33, Suppl 5 . 10. (2006).
  15. Dothager, R. S., Goiffon, R. J., Jackson, E., et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: a novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems. PLoS One. 5 (10), e13300(2010).
  16. Hu, Z., Liang, J., Yang, W., et al. Experimental Cerenkov luminescence tomography of the mouse model with SPECT imaging validation. Opt. Express. 18 (24), 24441(2010).
  17. Park, J. C., Il An, G., Park, S. I., et al. Luminescence imaging using radionuclides: a potential application in molecular imaging. Nucl. Med. Biol. 38 (3), 321(2011).
  18. Holland, J. P., Normand, G., Ruggiero, A., et al. Intraoperative imaging of positron emission tomographic radiotracers using Cerenkov luminescence emissions. Mol. Imaging. 10 (3), 177(2011).
  19. Intraoperative imaging of tumors using Cerenkov luminescence endoscopy: a feasibility experimental study. J. Nucl. Med. Liu, H., Carpenter, C. M., Jiang, H., et al. , (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie optycznepozytonowa tomografia emisyjnaksenoprzeszczepy guzówleczenie bevacizumabemPET dla małych zwierzątsystem IVUS Spectrumoprogramowanie Living Imageprotokoły bezpieczeństwa radiologicznego
Obrazowanie luminescencji Czerenkowa (CLI) w monitorowaniu terapii nowotworowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.