Artykuł metodologiczny

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju danio pręgowanego

DOI:

10.3791/4350

⸱

28 września 2012

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę fotoaktywowanego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFP) w żywym zarodku danio pręgowanego i dalszego śledzenia fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologicznych w komórce leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w organizmie żywego kręgowca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriogeneza to dynamiczny proces, który najlepiej badać za pomocą technik pozwalających na dokumentowanie zmian rozwojowych in vivo. Zastosowanie genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych okazało się cenną strategią wyjaśniania dynamicznych procesów morfogenetycznych zachodzących w nienaruszonym organizmie. W ciągu ostatniej dekady rozwój fotoaktywowanych i fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych otworzył możliwość zbadania losu dyskretnych subpopulacji znakowanych białek1. W przeciwieństwie do białek fotoaktywowanych, fotokonwertowalne białka fluorescencyjne (PCFP) są łatwo śledzone i obrazowane w ich natywnym stanie emisyjnym przed fotokonwersją, co ułatwia identyfikację i wybór regionów za pomocą kontroli optycznej. PCFP, takie jak Kaede2, KikGR3, Dendra4 i EosFP5, mogą być przesunięte z zielonego na czerwony po wystawieniu na działanie światła UV lub niebieskiego dzięki sekwencji tripeptydowej Hisa-Tyra-Gly'ego, która tworzy zielony chromofor, który może zostać fotoprzekształcony w czerwony przez katalizowaną światłem eliminację β, a następnie rozszerzenie systemu sprzężonego z π3. PCFP i ich warianty monomeryczne są użytecznymi narzędziami do śledzenia komórek6-10 i badania dynamiki białek odpowiednio11-14. W ostatnich latach PCFP ulegały ekspresji w różnych modelach zwierzęcych, takich jak danio pręgowany6, kurczak7,8 i mysz9,10 w celu śledzenia losu komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół specyficznej dla komórki fotokonwersji PCFP w żywym zarodku danio pręgowanego i dalszego śledzenia fotokonwertowanych białek w późniejszych stadiach rozwoju. Metodologia ta umożliwia badanie, w sposób specyficzny dla tkanki, zdarzeń biologicznych komórek leżących u podstaw morfogenezy w modelu zwierzęcym danio pręgowanego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie zarodków do testu fotokonwersji

Po skrzyżowaniu transgenicznych danio pręgowanego wykazujących PCFP, wybierane są najjaśniejsze, czyli homozygotyczne zarodki, które są hodowane w temperaturze 28,5 °C aż do pożądanego stadium embrionalnego15.

Uwaga 1: Ta preselekcja pozwoli na skanowanie zarodków za pomocą niskiej mocy lasera, zapobiegając w ten sposób fototoksyczności i fotowybielaniu.

Uwaga 2: Sugerujemy używanie światła o niskiej intensywności podczas wizualizacji zarodków i utrzymywanie ich w ciemnych warunkach ze względu na wysoką wrażliwość PCFP, takich jak Kaede i KikGR, na ekspozycję na światło, w tym światło dzienne.

2. Osadzanie

  1. W szklanym pojemniku z wodą jajeczną zdechorionować zarodki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą kleszczy.
  2. Znieczulenie zarodków poprzez przeniesienie zdekorionowanego zarodka do 0,16 mg/ml roztworu trikainy (etylester kwasu 3-aminobenzoesowego, Sigma-Aldrich) (40 μl roztworu podstawowego 4 mg/ml w 1 ml pożywki E3 1X).

Uwaga 1: Przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety lub końcówki (P1000), aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia zarodków.

Uwaga 2: Młode zarodki z dekorionacją nie powinny być wystawiane na działanie powietrza ani podnoszone na styk woda/powietrze, ponieważ jaja łatwo pękają pod wpływem naprężeń mechanicznych.

  1. Przenieść znieczulony zarodek na pokrywę szalki hodowlanej i utrzymywać zarodek w możliwie najmniejszej objętości pożywki.
  2. Przenieść zarodek do agarozy przez pipetowanie zarodka z 1% agarozą o niskiej temperaturze topnienia (LMA, Lonza) w temperaturze 30 °C zawierającej 0,16 mg/ml trikainy i umieścić go na szkle nakrywkowym naczynia hodowlanego ze szklanym dnem (MatTek Corp., Ashland, MA, USA). Następnie zorientuj zarodek za pomocą gładkiej plastikowej końcówki (np. naciętej końcówki do pipety Microloader, Eppendorf) i, gdy LMA ulegnie polimeryzacji, przykryj agarozę roztworem trikainy o stężeniu 0,16 mg/ml.

Uwaga 1: Rozpuść 1% LMA w temperaturze 60 °C i utrzymuj stopioną agarozę w temperaturze 30 °C.

3. Konwersja zdjęć

  1. Na odwróconym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w źródło laserowe o długości fali 405 nm, 488 nm i 561 nm, takim jak Zeiss LSM 710, wizualizuj próbkę za pomocą skanu z-Stack obejmującego całą strukturę próbki, która ma być fotokonwertowana i śledzona później za pomocą lasera 488 nm (tj. laser Ar o mocy 30 mW, o intensywności 5-7%, detektor ustawiony na 493-540 nm) i lasera 561 nm (tj., laser DPSS 561 o mocy 10 mW, o intensywności 7-9%, detektor ustawiony na 587-651) w celu skanowania tkanki/narządu w poszukiwaniu odpowiednio zielonej i czerwonej fluorescencji białek fotokonwertowalnych.

Uwaga 1: Do skanowania przed fotokonwersją użyliśmy obiektywu Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Uwaga 2: Zawsze skanuj w poszukiwaniu czerwonej fluorescencji przed eksperymentem, aby wykluczyć, że przypadkowo wygenerowany czerwony PCFP jest obecny.

  1. Wybierz narzędzie Szeregi czasowe i ustaw na 2 cykle bez interwału (jeden dla pre- i jeden dla post-konwersji zdjęć).
  2. Wybierz narzędzie Regiony i zdefiniuj jeden lub więcej obszarów zainteresowania (ROI) do konwersji zdjęć.

Uwaga 1: Zalecamy najpierw określić precyzję, z jaką obszar faktycznie przekonwertowany przez laser skanujący w ROI odpowiada ROI wybranemu w oprogramowaniu, mierząc obszar fotokonwertowanej tkanki/komórek we wszystkich trzech kierunkach (xy i z) w stałej próbce, gdzie nie oczekuje się ruchu komórki lub białka. W przypadku ustawień opisanych w tej aplikacji zwrot z inwestycji odpowiadał obszarowi fotokonwersji z dużą precyzją, ale zależy to od użytego celu i ilości lasera zastosowanego do fotokonwersji. Rozmiar ROI można zmniejszyć do rozmiaru pojedynczej komórki w zależności od apertury numerycznej obiektywu, współczynnika powiększenia i ilości światła laserowego używanego do fotokonwersji.

  1. Wybierz narzędzie Wybielanie i ustaw na rozpoczęcie wybielania po zeskanowaniu 1 z 2. Do fotokonwersji użyliśmy lasera diodowego o długości fali 405 nm o mocy 30 mW i starannie zoptymalizowaliśmy go pod kątem minimalnej ilości światła laserowego niezbędnego do pełnej fotokonwersji, którą osiąga się głównie poprzez zmianę intensywności światła laserowego, iteracji skanowania zwrotu z inwestycji i czasu piksela (tj. prędkości skanowania).

Uwaga 1: Do fotokonwersji użyliśmy obiektywu Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Uwaga 2: Moc lasera i liczba iteracji muszą być określone empirycznie dla każdego ustawienia eksperymentalnego i powinny zapewnić pełną fotokonwersję z zielonego na czerwony PCFP w ramach ROI przy minimalnej niezbędnej ilości światła laserowego, aby zmniejszyć fototoksyczność. Zalecamy rozpoczęcie testów z wykorzystaniem niskiej mocy lasera (np. 3%, co odpowiada 0,03 mW w planie obiektywu) w połączeniu z małą liczbą iteracji (np. 20), a następnie zwiększanie mocy lasera aż do osiągnięcia pełnej fotokonwersji, która w naszych rękach wynosiła 10% mocy lasera (co odpowiada 0,1 mW w planie obiektywu). W tych warunkach wszystkie badane zarodki przeżyły plan leczenia. Niemniej jednak zaobserwowaliśmy, że błona żółtkowa jest wrażliwa na impulsy laserowe i może łatwo ulec uszkodzeniu, powodując śmierć zarodka. Z tego powodu śmiertelność zarodka po fotokonwersji może być spowodowana, jeśli położenie tkanki docelowej jest zbliżone do ciała żółtka.

  1. Zeskanuj próbkę za pomocą z-Stack za pomocą laserów dla 488 nm i 561 nm, aby uwidocznić pozostałą zieloną i fotokonwertowaną czerwoną fluorescencję PCFP.

Uwaga 1: Do skanowania po fotokonwersji użyliśmy Plan-Apochromatu 20x/NA 0.8.

4. Usuń zarodek z agarozy

  1. Wyrzuć roztwór i ostrożnie usuń zarodek z 1% LMA za pomocą igły lub gładkiej plastikowej końcówki.
  2. Utrzymuj zarodek w wodzie jajowej w ciemności w temperaturze 28,5 °C do pożądanego etapu rozwojowego.

Uwaga 1: Ważne jest, aby zarodki kontynuowały swój rozwój w wodzie jajowej, szczególnie w pierwszych dniach rozwoju, podczas przedłużania ciała embrionalnego. Rzeczywiście, niektóre tkanki/narządy embrionalne zmieniają pozycje podczas rozwoju i dlatego wymagają określonej orientacji podczas osadzania, która zależy od konkretnej tkanki/narządu będącego przedmiotem zainteresowania i pożądanego etapu rozwoju analizy.

5. Ponowne osadzanie

  1. Postępuje się jak w punkcie 2.) niniejszego protokołu.

6. Śledzenie fotoprzekształconej tkanki w późniejszych stadiach embrionalnych

  1. Skanowanie obszaru zainteresowania (z-Stack) za pomocą laserów dla 488 nm i 561 nm dla sygnałów fluorescencyjnych odpowiednio dla zielonej i czerwonej fluorescencji.

Uwaga 1: Do skanowania x godzin po fotokonwersji użyliśmy Plan-Apochromatu 20x/NA 0.8.

Uwaga 2: Ponieważ ten protokół nie wpływa na normalny rozwój zarodka, możliwe jest obserwowanie fotoprzekształconego zarodka w późniejszych stadiach rozwoju (w tym celu postępuj zgodnie z opisem w punktach 4 - 6).

7. Reprezentatywne wyniki

Przykład testu fotokonwersji jest pokazany na rysunku 1. Śledziliśmy komórki śródbłonka podczas rozwoju danio pręgowanego (przegląd anatomii naczyniowej rozwijającego się danio pręgowanego patrz16). W związku z tym użyliśmy linii reporterowej Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 grybołu wyrażającej KikGR w jądrach śródbłonka17. Zarodki homozygotyczne i wykazujące jasną ekspresję hodowano w temperaturze 28,5 °C do 48 godzin po zapłodnieniu (hpf). Po dechorionacji zarodki zostały znieczulone i osadzone w LMA, umieszczając przednią i grzbietową stronę zarodka w kierunku szkła nakrywkowego w celu lepszej wizualizacji naczyń głowy. Do testu fotokonwersji i dalszego śledzenia fotokonwertowanego białka używamy odwróconego mikroskopu konfokalnego (Zeiss LSM 710 Meta) wyposażonego w lasery pracujące przy 405 nm, 488 nm i 561 nm oraz obiektyw Plan Apochromat 20x/NA 0,8. Jak pokazano na rysunku 1A, przed fotokonwersją KikGR ulegał ekspresji w tkance śródbłonka i był wykrywalny tylko jako zielona fluorescencja za pomocą lasera argonowego o długości fali 488 nm. Skany kontrolne za pomocą lasera DPSS 561-10 o długości fali 561 nm pod kątem czerwonej fluorescencji nie wykryły żadnego fotokonwertowanego KikGR przed fotokonwersją (ryc. 1A). Następnie ROI został całkowicie fotokonwertowany za pomocą lasera diodowego 405 nm (przy intensywności 10%, 20 iteracji), a naczynia głowy zostały ponownie zeskanowane przy użyciu laserów 488 nm i 561 nm (ryc. 1B). Jak pokazano na rysunku 1B, zielony KikGR całkowicie zmienił kolor na czerwony w ramach ROI. Po teście fotokonwersji zarodek usunięto z agarozy i wyhodowano w temperaturze 28,5 °C w wodzie jajecznej. Wreszcie, zarodek obserwowano ponownie 24 godziny po fotokonwersji, około 72 hpf, aby śledzić fotoprzekształcone komórki śródbłonka w późniejszych stadiach (Figura 1C). W ten sposób zarodek został osadzony w LMA, a próbka została ponownie zeskanowana za pomocą laserów 488 nm i 561 nm. Jak pokazano na rysunku 1C, w tkance śródbłonka powstałej w wyniku fotokonwertowanego ROI zaobserwowano zarówno nie-, jak i fotokonwertowane białka KikGR ze względu na stabilność czerwonego fluorescencyjnego fotokonwertowanego KikGR i resyntezę nowego zielonego, niefotokonwertowanego KikGR.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Fotokonwersja KikGR podczas rozwoju danio pręgowanego. (A,B) Określony obszar unaczynienia głowy śródbłonka został poddany fotokonwersji przy 48 hpf w transgenicznych zarodkach Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 i (C) obserwowany ponownie 24 godziny po fotokonwersji (około 72 hpf). Pokazana jest fluorescencja KikGR (zielony), fotokonwertowany KikGR (czerwony) i połączone kanały. Kropkowane kółka pokazują zwrot z inwestycji przed, po i 24 godziny po fotokonwersji. Obrazy są widokami grzbietowymi zarodka danio pręgowanego, przed dnem. Podziałka skali: 50 μm.

Białko (akronim) Ex (nm) Em (nm) Ec Okres QY Struktura czwartorzędowa jasność aplikacja Ref Kaede_G Okręg wyborczy 508 TGL Okręg wyborczy 518 TGL 99 Rozdział 0,9 tetramer 259 szt. Śledzenie komórek 2,6 Kaede_R 572 szt. 580 szt. 60 Rozdział 0,3 tetramer 59 Rozdział 59 KikGR_G Okręg wyborczy 507 TGL Lokal mieszkalny 517 54 Rozdział 54 0,7 tetramer Rozdział 112 Śledzenie komórek 3,6,8-10 KikGR_R Okręg wyborczy 583 TGL Okręg wyborczy 593 TGL 35 Rozdział 0,6 tetramer 68 Rozdział mKikGR_G Okręg wyborczy 505 TGL 515 szt. Rozdział 49 0,7 Monomeru Rozdział 101 Dynamiczne śledzenie obrazów w superrozdzielczości 13 mKikGR_R 580 szt. Okręg wyborczy 591 TGL 28 0,6 Monomeru 53 Rozdział 53 EosFP_G Okręg wyborczy 506 TGL 516 szt. 72 Rozdział 72 0,7 tetramer 150 szt. Śledzenie komórek 5,20 EosFP_R 571 szt. 581 szt. Rozdział 41 0,5 tetramer 67 Rozdział tdEos_G Okręg wyborczy 506 TGL 516 szt. Rozdział 34 0,7 dimer tandemowy 165 Rozdział Obrazy w doskonałej rozdzielczości 12,14,21 tdEos_R Okręg wyborczy 569 TGL 581 szt. 33 Rozdział 33 0,6 dimer tandemowy 59 Rozdział 59 mEos2_G Okręg wyborczy 506 TGL Lokal mieszkalny 519 TGL 56 Rozdział 56 0,7 Monomeru 140 szt. Dynamiczne śledzenie obrazów w superrozdzielczości 11,18 mEos2_R Okręg wyborczy 573 TGL Okręg wyborczy 584 TGL Rozdział 46 0,7 Monomeru 90 Rozdział Dendra2_G 490 szt. Okręg wyborczy 507 TGL Rozdział 45 0,5 Monomeru 67 Rozdział Dynamiczne śledzenie obrazów w superrozdzielczości 4,11 Dendra2_R Okręg wyborczy 553 TGL Okręg wyborczy 573 TGL 35 Rozdział 0,55 pkt. Monomeru 57

Tabela I. Właściwości fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych. Wraz z potoczną nazwą i/lub akronimem dla każdego PCFP, w tabeli przedstawiono długości fal szczytowego wzbudzenia (Ex) i emisji (Em), współczynniki ekstynkcji molowej (EC, 10-3 M-1 cm-1), wydajność kwantową (QY), fizjologicznie istotną strukturę czwartorzędową, względną jasność (jako % EGFP), zastosowanie i odniesienia. Tabela zaczerpnięta z Day i Davidson, 20101.

PCFP (Polskie Biuro Nadzoru Finansowego Linie transgeniczne danio pręgowanego źródło Kaede Tg(elavl3:Kaede)rw0130a Laboratorium Okamoto Tg(EPV. TP1-MMU.Hbb:Kaede)   Tg(ins:Kaede)   Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)   Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ ZIRC (Cyrk) Tg(myl7:kaede)   Tg(olig2:Kaede)   Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t ZIRC (Cyrk) Tg(UAS:Kaede)rk8 powiedział: ZIRC (Cyrk) Tg(vsx2:Kaede)nns2 powiedział: Laboratorium Higashijima KikGR Tg(kdrl:nlsKikGR)   Tg(krt4:NTR-KikGR)   Tg(myl7:nlsKikGR)   Tg(sox10:KikGR)   Tg(UAS:KikGR)   EosFP Tg(sox10:EosFP)   Tg(sox10:nlsEosFP)   Dendra Tg(-8mpx:Dendra2)   Tg(UAS:Dendra-kras)  

Tabela II. Linie transgeniczne danio pręgowanego wykazujące ekspresję PCFPs. Dane uzyskane w bazie danych modelowych organizmów zebry pręgowanego (ZFIN, http://zfin.org/). Wskazywana jest dostępność linii w Międzynarodowym Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach stworzono transgeniczne modele zwierzęce do ekspresji białek fotokonwertowalnych, takich jak Kaede czy KikGR. Zwierzęta te rozwijają się normalnie, co wskazuje, że białka te nie mają toksycznego wpływu na rozwój embrionalny. Pierwszy raport na temat testu fotokonwersji do śledzenia komórek w zarodkach zwierzęcych został przeprowadzony przez Hatta i współpracowników poprzez wstrzyknięcie mRNA lub DNA kodującego Kaede do jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego w celu wszechobecnej ekspresji lub przez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy doktorowi Ianowi C. Scottowi za uprzejme udostępnienie transgenicznej linii Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 dla danio pręgowanego w Szpitalu dla Chorych Dzieci, Toronto, Kanada. Dziękujemy Centralnemu Zarządowi Mikroskopii Konfokalnej i 2-Fonowej (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) oraz dr. Zoltan Cseresnyes, za doskonałą pomoc techniczną i ogólne wsparcie w zakresie obrazowania. S.A.-S. jest wspierany przez stypendium Heisenberg Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Prace te były wspierane przez DFG grant SE2016/7-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały:
Niezbędny sprzęt do hodowli ryb i zbierania ikry (szczegóły w Księdze Danio pręgowanego22).
Mikroskop stereoskopowyLeicaLecia MZ6 StereoskopWyposażony w laser pracujący przy 488 nm
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissZeiss LSM 710 NLOwyposażony w lasery pracujące przy 488 nm, 561 nm i 405 nm
Blok
Para kleszczyków
Naczynie hodowlane ze szklanym dnemMatTek CorpAshland MA USA
Microloader Końcówki do pipetIgły
Eppendorf Vortex
Odczynniki:
Medium do wody jajecznej
60 μ g / ml Instant Ocean Sea Salts w ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (w/v) Błękit metylenowy
4 mg/ml roztwór podstawowy trikainy
400 mg Trikaina (ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego)Sigma-Aldrich
97,9 ml ddH2O
2,1 ml 1M Tris (pH9)
Dostosować do pH 7, podwielokrotność i przechowywać -20 ° C
1% LMA (agaroza o niskiej temperaturze topnienia, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medium 1X
Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze 4 ° Z
grzewczyDumont #5

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
  4. Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  5. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
  6. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
  7. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  8. Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
  9. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
  10. Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
  11. Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
  12. Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  14. Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
  17. Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  19. Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
  20. Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Confocal MicroscopyPhoto ConversionFluorescent ProteinsTissue Specific ExpressionLow Melting Temperature AgaroseEgg Water MaintenanceEndothelial Cell Tracking

Powiązane artykuły