Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

17K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

16 listopada 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Streszczenie

Wykorzystanie nanomateriałów ma potencjał, by zrewolucjonizować inżynierię materiałową i medycynę. Obecnie badana jest szereg różnych nanocząsteczek pod kątem zastosowań w obrazowaniu i terapii. Wirusowe nanocząsteczki (VNPs) pochodzące z roślin można uznać za samoskładające się bionanomateriały o określonych rozmiarach i kształtach. Wirusy roślinne badane w laboratorium Steinmetza obejmują cząsteczki ikosaedryczne tworzone przez Cowpea mosaic virus (CPMV) oraz Brome mosaic virus (BMV), z których oba mają średnicę 30 nm. Opracowujemy również struktury pręcikowe i nitkowate pochodzące z następujących wirusów roślinnych: Tobacco mosaic virus (TMV), który tworzy sztywne pręciki o wymiarach 300 nm na 18 nm, oraz Potato virus X (PVX), który tworzy cząsteczki nitkowate o długości 515 nm i szerokości 13 nm (czytelnika odsyłamy do ref. 1 i 2 w celu uzyskania dalszych informacji na temat VNPs).

Z punktu widzenia inżyniera materiałowego VNPs są atrakcyjnymi modułami budulcowymi z kilku powodów: cząstki te są monodyspersyjne, mogą być z łatwością produkowane na dużą skalę in planta, są wyjątkowo stabilne i biokompatybilne. Ponadto VNPs są jednostkami „programowalnymi”, które można specyficznie modyfikować za pomocą inżynierii genetycznej lub metod biokoniugacji chemicznej 3. Struktura VNPs jest znana z rozdzielczości atomowej, a modyfikacje mogą być przeprowadzane z precyzją przestrzenną na poziomie atomowym4 – jest to poziom kontroli, którego nie można osiągnąć przy użyciu syntetycznych nanomateriałów z zastosowaniem obecnie dostępnych, najnowocześniejszych technologii.

W niniejszej pracy opisujemy propagację wirusów CPMV, PVX, TMV i BMV w roślinach Vigna ungiuculata oraz Nicotiana benthamiana. Przedstawiono protokoły ekstrakcji i oczyszczania dla każdego VNP. Opisano metody charakteryzacji oczyszczonych i chemicznie znakowanych VNP. W badaniu tym skupiamy się na znakowaniu chemicznym VNP fluoroforami (np. Alexa Fluor 647) oraz glikolem polietylenowym (PEG). Barwniki ułatwiają śledzenie i detekcję VNP 5-10, a PEG zmniejsza immunogenność białkowych nanocząsteczek, jednocześnie poprawiając ich farmakokinetykę 8,11. Wykazaliśmy celowanie do guza PEGylacji VNP z wykorzystaniem modelu mysiego ksenoprzeszczepu nowotworowego. Do badania biodystrybucji wykorzystano kombinację obrazowania fluorescencyjnego tkanek ex vivo przy użyciu systemu Maestro Imaging System, kwantyfikacji fluorescencji w homogenizowanych tkankach oraz mikroskopii konfokalnej. VNP są usuwane przez układ siateczkowo-ściśleczny (RES); celowanie do guza odbywa się biernie poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)12. Nanotechnologia VNP jest potężną technologią typu plug-and-play do obrazowania i leczenia ognisk chorobowych in vivo. Dalsze prace nad VNP koncentrujemy na dostarczaniu ładunków leków i klinicznie istotnych grup obrazujących, a także ligandów specyficznych dla tkanek, aby celować w receptory molekularne nadmiernie ekspresowane w nowotworach i chorobach układu sercowo-naczyniowego.

Protokół

1. Namnażanie VNP (CPMV, BMV, PVX i TMV)

  1. Ustaw sterowniki komory dla roślin doniczkowych na 15 h dnia (100% światła, 25 °C, 65% wilgotności) i 9 h nocy (0% światła, 22 °C, 60% wilgotności).
  2. Zaszczep rośliny zgodnie z harmonogramem przedstawionym w Tabeli 1.
CPMVPVX, TMV i BMV
Dzień 0: Posadzić 3 nasiona viguły w każdej doniczce.Dzień 0: Zasadź około 30 nasion N. benthamiana w doniczce. Nawoź raz w tygodniu, stosując 1 łyżkę nawozu na 5 l wody.
Dzień 14: Przesadź rośliny N. benthamiana w stosunku 1 rośliny na doniczkę.
Dzień 10: Zainfekuj liście pierwotne wirusem CPMV (5 μg/50 μl/liść) poprzez inokulację mechaniczną z zastosowaniem niewielkiej ilości karborundum.Dzień 28: Zainfekuj od trzech do pięciu liści wirusem PVX, TMV lub BMV (5 μg/50 μl na liść) poprzez inokulację mechaniczną przy użyciu niewielkiej ilości karborundu.
Dzień 20: Zebrać liście i przechowywać w temperaturze -80 °C.Dzień 42: Zebrać liście i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Tabela 1. Harmonogram hodowli, infekcji i zbioru liści.

Uwaga: jako przykład zaprezentowano jedynie propagację CPMV.

2. Oczyszczanie VNP (CPMV, BMV, PVX i TMV)

Uwaga: Wszystkie etapy przeprowadza się na lodzie lub w temperaturze 4 °C.

  1. Zhomogenizować 100 g zamrożonych liści w standardowym blenderze, używając 2 objętości zimnego buforu (patrz Tabela 2). Przefiltrować przez 2-3 warstwy gazy.
  2. W przypadku PVX skorygować pH do 6,5 za pomocą 1 M HCl. Dodać 0,2% (w/v) kwasu askorbinowego i 0,2% (w/v) siarczynu sodu.
  3. Odwirować surowy homogenat roślinny przy 5 500 x g przez 20 min. Zebrać nadfiltr.
  4. W przypadku BMV nanieść 25 ml nadfiltru na 5 ml 10% (w/v) roztworu sacharozy. Odwirować przy 9 000 x g przez 3 h, a następnie resuspender osad w 38,5% (w/v) roztworze CsCl. Mieszać poprzez wstrząsanie przez 5 h, a następnie kontynuować od kroku 2.12.
  5. Wyekstrahować materiał roślinny, dodając 0,7 objętości mieszaniny chloroform:1-butanol w stosunku 1:1 (v/v). Mieszać mieszaninę przez 30-60 min.
  6. Odwirować roztwór przy 5 500 x g przez 20 min. Zebrać górną fazę wodną.
  7. Dodać NaCl do stężenia 0,2 M oraz 8% (w/v) PEG (MW 8 000). W przypadku TMV dodać również 1% (v/v) Triton X-100. Mieszać przez co najmniej 1 h, a następnie odstawić na co najmniej 1 h.
  8. Odwirować roztwór przy 15 000 x g przez 15 min. Resuspender osad w 10 ml buforu. W przypadku PVX dodać 0,1% β-merkaptoetanolu i mocznik do stężenia 0,5 M.
  9. Odwirować przy 8 000 x g przez 30 min i zebrać nadfiltr.
  10. Poddać nadfiltr ultrawirowaniu przy 160 000 x g przez 3 h. Resuspender osad w 5 ml buforu przez noc.
  11. Przygotować gradient sacharozy 10-40%, używając równych objętości 10%, 20%, 30% i 40% sacharozy w buforze (zaczynając od najwyższego stężenia). Pozostawić gradient do ustabilizowania przez noc w temperaturze pokojowej.
  12. Poddać resuspenderowany osad ultrawirowaniu w gradiencie sacharozy przy 100 000 x g przez 2 h (24 h dla BMV).
  13. Zebrać pasmo rozpraszania światła i poddać dializie przeciwko buforowi.
  14. Przeprowadzić charakterystykę VNPs (poniżej) i przechowywać w 4 °C. Do długotrwałego przechowywania użyć temperatury -80 °C.
CPMV i TMV0.1 M bufor fosforanowy potasu (pH 7.0)
38.5 mM KH2PO4
61.5 mM K2HPO4
PVX0.5 M bufor boranowy (pH 7.8)
0.5 M kwas borowy
Dostosować pH za pomocą NaOH
BMVbufor SAMA (pH 4.5)
250 mM octan sodu
10 mM MgCl2
2 mM β-merkaptoetanol ( dodać na świeżo)

Tabela 2. Bufory i ich skład dla każdego VNP.

Uwaga: jako przykład zaprezentowano jedynie propagację CPMV.

3. Charakterystyka VNP (CPMV, BMV, PVX i TMV)

  1. Przeprowadź spektroskopię UV/vis w celu oznaczenia stężenia VNPs.
    1. Zmieierz absorbancję 2 μl próbki za pomocą spektrofotometru NanoDrop.
    2. Wyznacz stężenie cząsteczek i barwników, korzystając z prawa Beer-Lamberta (A=εcl, gdzie A to absorbancja, ε to współczynnik ekstynkcji, c to stężenie, a l to długość drogi optycznej). Dla NanoDrop długość drogi optycznej wynosi 0,1 cm.
      Współczynniki ekstynkcji specyficzne dla VNPs wynoszą:
      CPMV: 8,1 cm-1mg-1ml (przy 260 nm)
      PVX: 2,97 cm-1mg-1ml (przy 260 nm)
      TMV: 3,0 cm-1mg-1ml (przy 260 nm)
      BMV: 5,15 cm-1mg-1ml (przy 260 nm)
  2. Przeanalizuj cząsteczki za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) z wykluczaniem żelowym.
    1. Używając kolumny do wykluczania żelowego Superose 6 oraz systemu ÄKTA Explorer, nanieś 50-100 μg VNPs w 200 μl 0,1 M buforu fosforanowego potasu (pH 7,0).
    2. Ustaw detektory na 260 nm (kwasy nukleinowe), 280 nm (białka) oraz na długość fali wzbudzenia zastosowanych barwników.
    3. Przeprowadź analizę przy szybkości przepływu 0,5 ml/min przez 72 min.
    4. Profil elucji oraz stosunek A260:A280 nm wskazują, czy preparat VNP jest czysty oraz czy cząsteczki są nienaruszone i prawidłowo złożone.
      Następujące stosunki A260:280 wskazują na czysty preparat VNP:
      CPMV: 1,8±0,1
      PVX: 1,2±0,1
      TMV: 1,1±0,1
      BMV: 1,7±0,1
  3. Przeprowadź denaturującą elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z gradientem 4-12% Bis-Tris (gotowe żele NuPAGE), aby przeanalizować czystość preparatu i stopień konjugacji z poszczególnymi białkami otoczki.
    1. Dodaj 3 ml 4x buforu do próbek LDS do 10 μg cząsteczek w 9 μl buforu fosforanowego potasu. W przypadku BMV dodaj dodatkowo 1 μl 4x buforu do próbek LDS oraz 3 μl β-merkaptoetanolu, aby zredukować dużą liczbę mostków disiarczkowych.
    2. Inkubuj w bloku grzejnym przez 5 min w temperaturze 100 °C.
    3. Nanieś próbki na żel SDS.
    4. Przeprowadź elektroforezę przy napięciu 200 V przez 1 h w 1x buforze do elektroforezy MOPS.
    5. Zdokumentuj żel w świetle UV, aby zwizualizować fluorescencyjne białka otoczki.
    6. W przypadku białek niewykazujących fluorescencji, barwi żel błękitem Coomassie (0,25% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) kwas octowy) przez 1 h.
    7. Odbarwiaj żel w 30% metanolu i 10% kwasie octowym przez noc. W razie potrzeby wymień roztwór.
    8. Zdokumentuj żel w świetle białym.
  4. Przeanalizuj integralność cząsteczek za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).
    1. Rozcieńcz próbki do stężenia 0,1-1 mg/ml w 20 μl wody DI.
    2. Nanieś 20 μl krople próbek na Parafilm.
    3. Przykryj krople siatką do TEM i pozostaw na 2 min. Nadmiar roztworu z siatki usuń za pomocą papieru filtracyjnego.
    4. Przepłucz siatkę, kładąc ją na kropli wody DI, a następnie osusz papierem.
    5. Zbarw siatkę, kładąc ją na 20 μl kropli 2% (w/v) octanu uranylu przez 2 min. Nadmiar barwnika usuń papierem filtracyjnym.
    6. Przepłucz siatkę ponownie w wodzie.
    7. Obserwuj siatkę pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

4. Konjugacja chemiczna VNPs z PEG i fluoroforami, oczyszczanie oraz charakterystyka

  1. W obliczeniach dla poniższych reakcji przyjęto następujące masy molowe VNP:
    CPMV: 5,6 x 106 g/mol
    PVX: 35 x 106 g/mol
    TMV: 41 x 106 g/mol
    BMV: 4,6 x 106 g/mol
  2. Sprzęgnij barwniki i PEG z lysynami powierzchniowymi CPMV oraz PVX, wykorzystując jednowypadkową reakcję sprzęgania z N-hydroksysukcynimidem: dodaj 2 500 równoważników molowych (wszystkie nadmiary molowe odnoszą się do nadmiaru molowego na jeden VNP) estru sukcynimidylowego Alexa Fluor 647 oraz 4 500 równoważników NHS-PEG (M.W. 5 000) rozpuszczonych w DMSO do CPMV w 0,1 M buforze fosforanowym potasu. W przypadku pracy z PVX dodaj 10 000-krotny nadmiar molowy NHS-barwnika i NHS-PEG. Dostosuj objętości buforu i DMSO w taki sposób, aby końcowe stężenie CPMV i PVX wynosiło 2 mg/ml, a zawartość DMSO stanowiła 10% całkowitej objętości reakcji. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze pokojowej, chroniąc ją przed światłem. CPMV i PVX posiadają odpowiednio 300 i 1 270 dostępnych do modyfikacji lysyn. (W celu pogłębienia wiedzy na temat modyfikacji chemicznej CPMV i PVX zaleca się zapoznanie z następującymi referencjami: 13-15).
  3. Sprzęgnij barwniki i PEG z tyrozynami TMV poprzez sprzęganie diazoniowe, a następnie miedziową(I)-katalizowaną cykloaddycję azydowo-alkinową.
    1. Przygotuj sól diazoniową (alkin), mieszając 400 μl 0,3 M monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego, 25 μl 3,0 M azotyku sodu i 75 μl 0,68 M destylowanej 3-etynylaniliny rozpuszczonej w acetonitrylu w temperaturze 4 °C przez 1 h.
    2. Dodaj 3,3 ml buforu boratowego o pH 8,8 zawierającego 100 mM NaCl do 1,25 ml TMV (roztwór zapasowy 20 mg/ml).
    3. Reaguj TMV z 450 μl roztworu soli diazoniowej (alkinu) w kąpieli lodowej przez 3 h, aby wprowadzić grupę alkinową jako uchwyt do ligacji w TMV poprzez sprzęganie diazoniowe. Roztwór przybierze jasnobrązowy kolor. TMV posiada 2 140 tyrozyn dostępnych do sprzęgania.
    4. Oczyść produkt końcowy, wykorzystując poduszkę sacharozową zgodnie z opisem w punkcie 4.4.
    5. Przyłącz funkcjonalizowany azydowo Alexa Fluor 647 oraz PEG-azyd (M.W. 5 000) za pomocą miedziowej(I)-katalizowanej cykloaddycji azydowo-alkinowej (CuAAC). Dodaj 2 równoważniki azyd-barwnika i azyd-PEG na białko otoczki i inkubuj z 1 mM CuSO4, 2 mM AMG oraz 2 mM askorbinianem sodu w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dostosuj objętość buforu tak, aby końcowe stężenie reakcyjne TMV wynosiło 2 mg/ml. (W celu pogłębienia wiedzy na temat modyfikacji chemicznej TMV zaleca się zapoznanie z następującymi referencjami: 16,17).
  4. Sprzęgnij barwniki z lysynami, a PEG z cysteinami mutantu cysteinowego BMV (cBMV):
    1. Dodaj 2 000 równoważników molowych estru sukcynimidylowego Oregon Green 488 rozpuszczonego w DMSO do cBMV w 0,1 M buforze TNKM (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4). Dostosuj objętości buforu i DMSO tak, aby końcowe stężenie BMV wynosiło 1 mg/ml, a zawartość DMSO stanowiła 10% całkowitej objętości reakcji. Inkubuj mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc ją przed światłem.
    2. Oczyść cząsteczki, używając filtrów odwirku zgodnie z opisem w punkcie 4.4.
    3. Dodaj 2 000-krotny nadmiar molowy PEG-maleimidu (M.W. 2 000), stosując te same warunki reakcji co wcześniej, i inkubuj mieszaninę reakcyjną przez 2 h w temperaturze 4 °C. cBMV posiada 180 reaktywnych lysyn i cystein. (W celu pogłębienia wiedzy na temat modyfikacji chemicznej BMV zaleca się zapoznanie z następującą referencją:18).
  5. Oczyszczanie: Przepuść roztwór przez 40% (w/v) poduszkę sacharozową przy 160 000 x g przez 2,5 h. Ponownie rozpuść osad w buforze. Alternatywnie przeprowadź dializę przeciwko odpowiedniemu buforowi, używając filtrów wirowych z odcięciem 10 kDa.
  6. Charakteryzacja: PEGylizowane i znakowane fluorescencyjnie VNP analizuje się za pomocą opisanych powyżej metod: spektroskopii UV/Vis, elektroforezy w żelu SDS, FPLC oraz TEM (nie pokazano, jednak należy odnieść się do Rysunków 6 i 7).

5. Celowanie w nowotwór i obrazowanie z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu mysiego

  1. Hodować ludzkie komórki raka jelita grubego HT-29 w podłożu RPMI uzupełnionym o 5% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny i 1% L-glutaminy w temperaturze 37 °C w 5% CO2, używając kolb do hodowli komórkowej o powierzchni 175 cm2.
  2. Przemyć komórki dwukrotnie sterylnym PBS i zebrać poprzez inkubację z 5 ml trypsyny-EDTA w 37 °C przez 5 min. Inaktywować trypsynę za pomocą 5 ml podłoża RPMI. Zebrać komórki przez wirowanie przy 500 x g przez 5 min. w 4 °C i resuspendować w świeżym RPMI w zagęszczeniu 5x106 komórek/50 μl podłoża (liczbę całkowitą komórek oznaczyć przy użyciu błękitu trypanu i hemocytometru). Przed wstrzyknięciem zmieszać z równą objętością matrigelu (wszystkie roztwory i odczynniki muszą pozostać sterylne).
  3. Pozyskać sześciotygodniowe myszy NCR nu/nu i utrzymywać je na diecie bez lucerny przez 2 tygodnie. [Uwaga: wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą zostać zatwierdzone przez IACUC]. Indukować ksenoprzeszczepy guzów poprzez podskórne wstrzyknięcie 5x106 komórek/100 μl/guz w boki (2 guzy/mysz), używając sterylnej igły o średnicy 18 1/2 G. Regularnie monitorować zwierzęta. Pomieścić wielkość guzów za pomocą suwmiarki i pozwolić guzom urosnąć do średniej objętości 20 mm3 (w ciągu następnych 12 dni). Przyporządkować myszy losowo do dwóch różnych grup: PBS i VNP (n = 3 zwierzęta/grupa/punkt czasowy). Używając strzykawki insulinowej 1 ml o średnicy 28 G, podać dożylnie przez żyłę ogonową 100 μl sterylnego PBS lub formulację VNP w dawce 10 mg/kg.

Uwaga: Eksperymenty z hodowlami tkankowymi oraz badania na żywych zwierzętach nie zostaną zaprezentowane. Demonstracja praktyczna ograniczy się do przetwarzania tkanek i akwizycji danych. W celu uzyskania informacji na temat modelu ksenograftu guza HT-29 należy odwołać się do pozycji 19

Do oceny homingu VNPs do guza wykorzystuje się trzy techniki:

  1. Obrazowanie fluorescencyjne z wykorzystaniem systemu obrazowania Maestro: Uśmierć myszy w różnych punktach czasowych (2, 24 i 72 h) przy użyciu CO2 gaz. Przeprowadź sekcję zwierząt i wyciśnij wszystkie główne organy (mózg, serce, płuca, śledzionę, nerki i wątrobę) wraz z guzami na bokach ciała. Umieść tkanki na parafilmie i przeanalizuj za pomocą urządzenia do obrazowania fluorescencyjnego, stosując żółte filtry wzbudzenia i emisji (czas ekspozycji 800 ms), aby wykryć obecność sygnałów fluorescencyjnych w tkankach (pochodzących z etykiety A647 sprzężonej z VNPs). Zapisz obrazy i przeanalizuj intensywność fluorescencji przy użyciu oprogramowania ImageJ 1.44o (http://imagej.nih.gov/ij). Porównać w czasie wzorzec wychwytu VNPs w guzach i innych głównych tkankach.
  2. Po obrazowaniu każdą tkankę należy przeciąć na pół, a jedną połowę zatopić w związku OCT w celu wykonania kriosnittów i analizy konfokalnej. Drugą połowę należy umieścić w wcześniej zważonych probówkach kriogenicznych i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.2Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
  3. Ilościowe oznaczanie fluorescencji: Zapisz masę tkanek. Rozmroź zamrożone tkanki w temperaturze pokojowej i umieść je w osobnych probówkach Falcon o pojemności 50 ml zawierających 1 ml PBS. Za pomocą ręcznego homogenizatora do tkanek homogenizuj tkanki w PBS przez 2–3 min, a następnie przenieś homogenizat do probówek do mikrowirówki. Wirowarkuj homogenizaty przez 10 min przy 13 000 x g w celu usunięcia niezhomogenizowanej tkanki.
  4. Przenieś 100 μl supernatantu z tkanek z każdej grupy (PBS i preparaty VNP/punkty czasowe) do czarnej płytki UV z 384 dołkami. Oceń intensywność fluorescencji (długości fal Ex/Em 600/665) za pomocą czytnika płytek. Znormalizuj otrzymane wartości fluorescencji względem masy tkanek.
  5. Immunohistochemia: Przygotować skrawki na mikrotomie kriostatycznej (10 μm) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przeprowadzić barwienie skrawków tkanek w celu wykazania jąder komórkowych (DAPI) oraz markera komórek śródbłonka (przeciwciało anty-mysie CD31 znakowane FITC). Wykonać analizę z użyciem mikroskopii konfokalnej w celu zmapowania lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie VNP w naczyniach oraz w obrębie guza.

Uwaga: Procedura ta nie zostanie zaprezentowana, reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 8. W celu uzyskania informacji na temat immunohistochemii oraz opisanych metod barwienia, czytelnik może zapoznać się z ref. 19

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównawcza analiza wzrostu roślin; układ eksperymentalny, badanie zmienności koloru liści, metoda chlorozy.
Rycina 1. Rośliny zainfekowane wirusami roślinnymi. Rośliny Vigna unguiculata zainfekowane CPMV (A). Rośliny Nicotiana benthamiana zainfekowane PVX (B), TMV (C) oraz BMV (D). Zdjęcia wykonano około 10 dni po infekcji poprzez inokul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół przedstawia metodę chemicznej modyfikacji VNPs oraz ich zastosowania w obrazowaniu nowotworów in vivo. Prezentowane tutaj techniki obrazowania fluorescencyjnego zwierząt, kwantyfikacji fluorescencji oraz immunohistochemii są przydatne do badania biodystrybucji i oceny celowania w nowotwór. Techniki te dostarczają cennych informacji na temat dostępu nanocząsteczek do guza poprzez efekt EPR. Dzięki połączeniu wyników z różnych metod analitycznych otrzymujemy skuteczne podejście do oceny lokaliza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty NIH/NIBIB R00 EB009105 (dla NFS) i P30 EB011317 (dla NFS), grant szkoleniowy NIH/NIBIB T32 EB007509 (dla AMW), grant inwestycyjny Interdisciplinary Alliance Investment Grant Uniwersytetu Case Western Reserve (dla NFS) oraz grant Case Comprehensive Cancer Center P30 CA043703 (dla NFS). Dziękujemy studentom badaczom z laboratorium Steinmetza za ich bezpośrednie wsparcie: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian So oraz Paul Chariou.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja VNP
Wewnętrzna komora roślinnaPercival ScientificE-41L2
V. unguiculata nasiona (odmiana California black-eye no. 5)Burpee51771A
N. benthamiana nasionaNasiona N. benthamiana zostały otrzymane w darowiźnie z Salk Institute. Nasiona są pozyskiwane poprzez rozmnażanie roślin.
KarborundFisherC192-500
Ziemia do doniczek Pro-mix BXPremier Horticulture713400
Profesjonalny nawóz Jack's Professional 20-10-20 Peat-LiteJR Peters77860
Sprzęt
50,2 rotor z tytaunBeckman337901
rotor SW 32 TiBeckman369694
Ultrawirówka Optima L-90KBeckman365672
rotor SLA-3000Thermo Scientific07149
rotor SS-34Thermo Scientific28020
wirówka Sorvall RC-6 PlusThermo Scientific46910
Butelka z polipropylenuBeckman355607Dla rotora SLA-3000
Butelka poliwęglanowaBeckman357002Dla rotora SS-34
probówka Ultra-ClearBeckman344058Do gradientu sacharozy i rotora SW 32 Ti
Butelka poliwęglanowaBeckman355618Do wirowania w celu otrzymania osadu i rotora 50.2 Ti
spektrofotometr NanoDropThermo ScientificNanoDrop2000c
system gotowych żeli PowerEase 500InvitrogenEI8675EU
kolumna do chromatografii żelowej (wykluczania sterycznego) Superose 6 10/300 GL (24 ml)GE Healthcare17-5172-01
ÄChromatograf KTA Explorer 100GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302Wirówka nakładkowa
KriostatLeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life SciencesIn vivo system obrazowania
Rozrywacz tkanekProdukty Biospec985370-395
Czytnik mikropłytekTecanInfinite-200
Mikroskop elektronowy transmisyjnyZEISSLibra 200FE
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny FluoViewOlympusFV1000
Odczynniki i substancje chemiczne
3-etynyloanilinaSigma Aldrich498289-5G
czarna płytka 384-dołkowaBD Biosciences353285
żel NuPAGE SDS Bis-Tris 4-12%InvitrogenNP0321BOX
bufor do próbek 4X LDSInvitrogenNP0008
Kwas octowyFisherA385-500
AcetonitrylSigma Aldrich271004-1L
azydek Alexa Fluor 647InvitrogenA10277
Kwas karboksylowy Alexa Fluor 647, ester succynimidylowyInvitrogenA20006
Filtry wirówkowe Amicon Ultra-0,5 mlMilliporeUFC501096próg odcięcia 10 kDa
Chlorowodorek aminoguanidynyAcros Organics36891-0250
Kwas borowyFisherA74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250FisherBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
DimetylosulfoksydFisherBP231-100
Papier filtracyjnyFisher09-801Kstopień P5
przeciwciało przeciwko CD31 mysiego pochodzenia znakowane FITCBioLegend102406
Surowica koziaInvitrogen16210-064
KClFisherBP366-500
Sód L-askorbinianAcros Organics35268-0050
MetanolFisherA412P-4
MgCl22FisherBP214-500
Przesmyki szkiełka przedmiotowegoFisher12-544-3
Szkiełko nakrywkowe do mikroskopuVWR48366-277
bufor MOPSInvitrogenNP0001
mPEG-malNanokryształyPG1-ML-2kMW 2000
mPEG-N3NanokryształyPG1-AZ-5kmasa cząsteczkowa 5000
mPEG-NHSNanokryształyPG1-SC-5kMW 5000
NaClFisherBP358-212
Oregon Green 488 ester succynimidylowy *izomer 6*InvitrogenO-6149
monohydrat kwasu p-toluenosulfonowegoAcros Organics13902-0050
PermountFisherSP15-100
Fosforan potasu dwuzasadowyFisherBP363-1
Fosforan potasu jednodobazowyFisherBP362-1
Octan soduFisherBP333-500
Azotyn soduAcros Organics42435-0050
Siarczyn soduAmresco0628-500G
SacharozaFisherS6-500
Siatka do TEMTed PellaFCF-400Cu
Tris (zasada)FisherBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-merkapto–etanolFisherO3446I-100
Kultura tkanek
Płodowa surowica bydlęcaInvitrogen12483-020
Komora countingowa (hemocytometr)Fisher0267110
komórki HT-29ATCCHTB-38
L-glutaminaInvitrogen25030-080
PBSCellgro21-040-CV
Penicylina-streptomycynaInvitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
Kolby do hodowli tkankowychCorning431080175 cm2
Błękit trypanowyThermo ScientificSV30084.01
Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, roztwórInvitrogen25300-054
Badania na zwierzętach
Dieta dla gryzoni z 18% zawartością białkaHarlan TekladTeklad Global 2018SDieta bez lucerny
Strzykawka insulinowaBD Biosciences329410igła 28 G
IzofluranBaxterAHN3637
Macierz Matrigel, błona podstawnaBD Biosciences356234
myszy NCR nu/nuSzkoła CWRU
Jednostka ds. Zwierząt Atymicznych i Ksenoprzeszczepów przy Wydziale Medycyny
Sterylna strzykawkaBD Biosciences305196igła 18 1/2 G
Związek do kriotomii Tissue-Tek CRYO-OCTAndwin Scientific4583

Bibliografia

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wirusy roślinneoczyszczanie CPMVznakowanie fluorescencyjnePEGylacjacelowanie w nowotworymodel ksenoprzeszczepu mysiegoobrazowanie fluorescencyjnemikroskopia konfokalnachromatografia wykluczania
Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.