Funkcjonalny obrazowanie rezonansem magnetycznym (fMRI) ze stymulacją słuchową u ptaków śpiewających

Lisbeth Van Ruijssevelt; Geert De Groof; Anne Van der Kant; Colline Poirier; Johan Van Audekerke; Marleen Verhoye; Annemie Van der Linden

doi:10.3791/4369

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Funkcjonalny obrazowanie rezonansem magnetycznym (fMRI) ze stymulacją słuchową u ptaków śpiewających

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4369

⸱

3 czerwca 2013

Lisbeth Van Ruijssevelt¹ , Geert De Groof¹ , Anne Van der Kant¹ , Colline Poirier¹ , Johan Van Audekerke¹ , Marleen Verhoye¹ , Annemie Van der Linden¹

¹Bio-Imaging Lab, University of Antwerp

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowaną procedurę obrazowania neuronalnych substratów stymulacji słuchowej w mózgu ptaka śpiewającego przy użyciu funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym (fMRI). Opisano w nim przygotowanie bodźców dźwiękowych, pozycjonowanie obiektu badawczego oraz akwizycję i późniejszą analizę danych fMRI.

Streszczenie

Neurobiologia śpiewu ptaków, jako model mowy ludzkiej, stanowi istotny obszar badań w neurobiologii behawioralnej. Podczas gdy elektrofizjologia i podejścia molekularne pozwalają na badanie różnych bodźców w odniesieniu do kilku neuronów lub jednego bodźca w dużych obszarach mózgu, funkcjonalny obrazowanie rezonansem magnetycznym (fMRI) oparte na poziomie utlenowania krwi (BOLD) pozwala na połączenie obu tych zalet, i.e. porównanie aktywacji neuronalnej wywołanej różnymi bodźcami w całym mózgu jednocześnie. fMRI u ptaków śpiewających jest trudne ze względu na mały rozmiar ich mózgów oraz fakt, że ich kości, a w szczególności czaszka, zawierają liczne jamy powietrzne, co indukuje istotne artefakty podatności magnetycznej. fMRI BOLD z echem gradientowym (GE) zostało z sukcesem zastosowane u ptaków śpiewających ^1-5 (przegląd literatury, patrz ⁶). Badania te koncentrowały się na pierwotnych i wtórnych obszarach słuchowych mózgu, które są regionami wolnymi od artefaktów podatności. Jednakże, ponieważ interesujące procesy mogą zachodzić poza tymi regionami, wymagane jest fMRI BOLD całego mózgu z wykorzystaniem sekwencji MRI mniej podatnej na te artefakty. Można to osiągnąć, stosując fMRI BOLD z echem spinowym (SE) ^7,8. W niniejszym artykule opisujemy, jak wykorzystać tę technikę u zebra finczów (Taeniopygia guttata), które są małymi ptakami śpiewającymi o masie ciała 15-25 g, szeroko badanymi w neurobiologii behawioralnej śpiewu ptaków. Głównym tematem badań fMRI u ptaków śpiewających jest percepcja i nauka śpiewu. Słuchowy charakter bodźców w połączeniu ze słabą czułością BOLD sekwencji fMRI opartych na SE (w porównaniu do GE) sprawia, że wdrożenie tej techniki jest bardzo wymagające.

Protokół

1. Przygotowanie bodźców słuchowych

W pierwszej kolejności należy zarejestrować bodźce dźwiękowe podczas ich odtwarzania wewnątrz otworu systemu MR 7T. Otwór jest ograniczoną przestrzenią, która może zniekształcać bodźce słuchowe, co prowadzi do wzmocnienia określonych częstotliwości słuchowych. Rycina 1 przedstawia częstotliwości wzmocnione i stłumione, co wykazują nasze nagrania białego szumu wykonane w miejscu głowy ptaka wewnątrz otworu magnesu przy użyciu mikrofonu światłowodowego (Optimic 1160, Optoacoustics). Aby zrekompensować to sztuczne wzmocnienie, do każdego bodźca stosuje się funkcję korektora za pomocą oprogramowania WaveLab. W naszej konkretnej konfiguracji funkcja ta składa się z jądra Gaussa o następujących parametrach: maksymalna amplituda: -20dB, wycentrowana na 3,750 Hz, szerokość: 0,05 oktawy (co w naszym systemie odpowiada zakresowi 2,500-5,000 Hz).
Bodźce w postaci pieśni składają się z kilku pojedynczych motywów pieśni każdego ptaka, przeplatanych okresami ciszy. Czas trwania tych okresów ciszy jest dostosowany tak, aby całkowita ilość dźwięku i ciszy była identyczna dla wszystkich bodźców. Taka konstrukcja zachowuje naturalną zmienność długości pieśni w obrębie osobników oraz między osobnikami. Całkowita długość każdego bodźca wynosi 16 sec. Intensywność każdej pieśni jest normalizowana pod kątem dopasowanej wartości średniej kwadratowej (root-mean-square) i filtrowana górnoprzepustowo przy 400 Hz przed zintegrowaniem w kompletny bodziec (pieśń i okresy ciszy). Manipulacje te są wykonywane przy użyciu oprogramowania Praat.
Eksperyment opiera się na projekcie blokowym ON/OFF, w którym okresy stymulacji słuchowej (bloki ON) przeplatają się z okresami odpoczynku (bloki OFF) (Rycina 2). Każdy blok (ON i OFF) trwa 16 sec, co odpowiada czasowi akwizycji 2 obrazów (patrz poniżej w sekcji akwizycja). Każdy rodzaj bodźca jest prezentowany 25 razy, co skutkuje akwizycją 50 obrazów na bodziec i na badany osobnik. Kolejność prezentacji warunków powinna być randomizowana w obrębie oraz pomiędzy osobnikami. Taka zrandomizowana kolejność bodźców może zostać zaprogramowana w oprogramowaniu Presentation.

2. Przygotowanie obiektu

2.1 Badani i wielkość grup

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół dostosowany specjalnie do pracy z (dorosłymi) zebra finczami. Wybór gatunku zależy od postawionego pytania badawczego. Należy jednak wziąć pod uwagę również inne kwestie, takie jak odporność ptaków na znieczulenie. Zebra fincze (Taeniopygia guttata) powinny być utrzymywane w wolierach przy fotoperiodzie 12 h światła : 12 h ciemności i mieć ad libitum dostęp do pokarmu i wody przez cały czas trwania badania. Minimalna liczba osobników w jednym eksperymencie wynosi 15. Liczba ta uwzględnia czułość fMRI w sekwencji spin-echo oraz naturalną zmienność międzyosobniczą zjawisk biologicznych mierzonych w eksperymencie.

2.2 Instalacja zestawu i przygotowanie zwierzęcia

(W celu uzyskania szczegółowych informacji na temat wykorzystanego sprzętu, odsyłamy do listy konkretnych odczynników i sprzętu na końcu niniejszego artykułu)

Zainstaluj maskę typu „beak mask” na stole do rezonansu magnetycznego w systemie MRI 7T i połącz ją z kontrolerem gazów za pomocą plastikowych rurek. Otwórz butle z tlenem i azotem, a następnie włącz kontroler gazów (przepływ tlenu: 200 cc/min; azotu: 400 cc/min).

Jak wspomniano powyżej, w przedstawionym układzie zastosowano system MR 7T. Możliwe jest użycie innych systemów MR o różnej indukcji pola, jednak przy 7T osiągnięto optymalny kompromis pomiędzy stosunkiem sygnału do szumu a stopniem występowania artefaktów podatności (patrz dyskusja). Przy wyższej indukcji pola stosunek sygnału do szumu wzrośnie wraz ze wzrostem stopnia występowania artefaktów podatności.

Włącz system z regulacją sprzężeniem zwrotnym oraz urządzenie do ogrzewania strumienia powietrza.
Zanurz dziób kanarka w masce i trzymaj głowę ptaka skierowaną w dół do czasu pełnego znieczulenia, podając 3% izofluranu w mieszaninie tlenu i azotu. Można to zweryfikować, delikatnie pociągając za stopę: gdy ptak jest w pełni uśpiony, nie cofa stopy. Ponadto oczy ptaka będą częściowo przymknięte.
Wprowadź sondę temperatury kloaki w celu pomiaru temperatury ciała i monitoruj częstotliwość oddychania, umieszczając czujnik pneumatyczny pod brzuchem kanarka. Zapnij kamizelkę, aby unieruchomić ciało ptaka (Rycina 3).
Utrzymuj częstotliwość oddychania w zakresie 40 - 100 oddechów na minutę i stałą temperaturę ciała w wąskim zakresie 40 ± 0.5 °C. Gdy częstotliwość oddychania jest zbyt niska lub zbyt wysoka, odpowiednio dostosuj poziom znieczulenia (% izofluranu). Jeśli problem będzie się utrzymywał, należy przerwać eksperyment i wyjąć zwierzę z aparatury w celu wybudzenia.
Umieść niemagnetyczne głośniki dynamiczne po obu stronach głowy kanarka i podłącz je do wzmacniacza. Upewnij się, że przewody głośników są poprowadzone z dala od sondy temperatury, ponieważ zbyt bliska odległość może wpływać na odczyty temperatury.
Umieść powierzchniową cewkę RF na górnej części głowy kanarka i wypozycjonuj ptaka w centrum magnesu (co automatycznie oznacza centrum cewki nadawczej znajdującej się w środku magnesu).
Zmniejsz poziom znieczulenia do 1.5% izofluranu w mieszaninie tlenu i azotu.

3. Pozyskiwanie danych

Należy pozyskać zestaw 1 obrazu przeglądowego (scout) gradient-echo (GE) w płaszczyźnie strzałkowej, 1 poziomej i 1 czołowej (sekwencja tri-pilot) oraz zestawy obrazów wielowarstwowych w płaszczyznach poziomej, czołowej i strzałkowej (pilotażowa sekencja SE RARE T₂-weighted rapid acquisition relaxation-enhanced), aby określić pozycję mózgu w magnesie (Rycina 4).
Należy zmniejszyć szum gradientów poprzez zwiększenie ich czasów narastania (ramp times) do 1 000 μs.
Przygotować sekwencję fMRI: sekwencja RARE T₂-weighted, efektywne TE: 60 msec, TR: 2 000 msec, czynnik RARE: 8, FOV: 16 mm, rozmiar macierzy: 64 x 32, orientacja: strzałkowa, grubość warstwy: 0,75 mm, grubość przerwy międzywarstwowej: 0,05 mm, 15 warstw obejmujących niemal cały mózg (Rycina 4).
W oprogramowaniu do prezentacji należy wybrać protokół słuchowy (bodźce słuchowe i czas ich podawania). Protokół ten składa się z sekwencji poleceń – inicjujących konkretne bodźce słuchowe – które są wykonywane przy określonym numerze skanu. Przy każdym powtórzeniu w sekwencji fMRI oprogramowanie skanera wysyła wyzwalacz (trigger) do oprogramowania prezentacji słuchowej, które z kolei rejestruje numer skanu i wykonuje odpowiednie polecenie.
Aby upewnić się, że oprogramowanie prezentacji słuchowej nie pominie żadnego wyzwalacza ze skanera, w pierwszej kolejności uruchamia się protokół słuchowy. Po pełnym załadowaniu protokołu rozpoczyna się sekwencję fMRI.
Każdemu eksperymentowi fMRI poprzedza pozyskanie 12 obrazów pustych (dummy images), aby sygnał przypisany do szumu skanera osiągnął stan stacjonarny przed rozpoczęciem stymulacji słuchowej.
Po pozyskaniu danych należy zastosować zero-filling do rozmiaru 64 x 64.
Należy dokonać wstępnej oceny wyników za pomocą narzędzia Functional Tool programu Paravision (opcja Processing/Functional Imaging). Obliczamy różnicową odpowiedź BOLD pomiędzy wszystkimi blokami aktywnymi (ON) a linią bazową (bloki OFF). Analiza ta daje wstępną informację o jakości eksperymentu. Jeśli na tym etapie nie stwierdzono aktywacji w głównych obszarach słuchowych, ptak prawdopodobnie nie słyszał lub nie przetwarzał bodźców słuchowych z powodu problemów technicznych z prezentacją bodźców, poziomu znieczulenia itp. W takim przypadku należy zweryfikować ustawienia i powtórzyć pomiar.
Należy uruchomić anatomiczną sekwencję 3D RARE T2-weighted w tej samej orientacji co poprzednie skany fMRI, z efektywnym TE: 60 msec, TR: 2 000 msec, czynnikiem RARE: 8, FOV: 16 mm i rozmiarem macierzy 256 x 128 x 64.
Należy zastosować zero-filling danych do rozmiaru 256 x 256 x 256.
Zebra fincha należy zdjąć z łóżka MRI i pozwolić mu dojść do siebie po znieczuleniu w klatce pod czerwoną lampą. Zazwyczaj powrót zebra fincha do sprawności po znieczuleniu izofluranem przebiega stosunkowo szybko (maksymalnie 5 min). Już po kilku minutach ptaki próbują wstać, a po pełnym wybudzeniu siadają na gałązce zamiast na dnie klatki. Czas trwania znieczulenia w niniejszym eksperymencie wynosi około 2 hr. Maksymalny czas znieczulenia izofluranem stosowany dla zebra finchów w naszym laboratorium to 6 hr, po którym ptaki również budziły się w ciągu 5 min.

4. Przetwarzanie danych

Konwertuj dane MR do formatu Analyze lub Nifti.
Ponieważ program SPM został opracowany do przetwarzania danych fMRI pozyskanych od ludzi, czyli dla wokseli o rozmiarze około 2 mm, wiele ustawień SPM jest dostosowanych do tej przybliżonej wielkości woksela. Jeśli nie chce się zmieniać wszystkich tych ustawień, najprostszym sposobem postępowania jest sztuczne zwiększenie rozmiaru wokseli w danych fMRI ptaków. Za pomocą programu MRIcro dostosuj rozmiar woksela w nagłówku, mnożąc rzeczywisty rozmiar woksela przez 10. Należy zauważyć, że taka korekta nie wpływa na same dane; nie jest stosowany ponowny próbkowanie ani żadne inne modyfikacje danych.

Alternatywą do tego rozwiązania jest zastosowanie narzędzia „SPMMouse”, które stanowi zestaw narzędzi umożliwiający programowi SPM otwieranie i analizowanie plików o dowolnym wymiarze wokseli. Narzędzie to pozwala na tworzenie tzw. „szklanych mózgów” (glass brains) w SPM z dowolnego obrazu i automatycznie dostosowuje domyślne skale długości na podstawie nagłówków plików obrazów lub danych wprowadzonych przez użytkownika. Zatem zestaw narzędzi ten działa w sposób przeciwny do proponowanego przez nas rozwiązania. Zamiast zmieniać rozmiar wokseli w obrazach, aby dopasować je do SPM, zmieniane są domyślne ustawienia SPM, aby umożliwić korzystanie z obrazów o różnych rozmiarach wokseli.

Wykonaj ponowne wyrównanie danych fMRI. Przeprowadź korejestrację anatomicznego zbioru danych 3D z szeregami czasowymi fMRI. Znormalizuj dane 3D (oraz skorejestrowane szeregi czasowe fMRI) do atlasu MRI mózgu zebry wyżynnej. Zastosuj macierz transformacji do zbioru danych fMRI. Wszystkie te kroki można wykonać przy użyciu oprogramowania Statistical Parametric Mapping (SPM) 8.
Wygładź dane za pomocą jądra Gaussa o szerokości 0,5 mm w programie SPM8.
Przeprowadź statystyczne analizy oparte na wokselach przy użyciu SPM8. Modeluj dane jako funkcję prostokątną (bez funkcji odpowiedzi hemodynamicznej). Oszacuj parametry modelu za pomocą klasycznego algorytmu Restricted Maximum Likelihood. Oblicz średni efekt każdego bodźca słuchowego dla każdego osobnika (analiza efektów stałych), a następnie oblicz statystyki wymagane do analiz grupowych (analizy efektów mieszanych).
Zrzutuj statystyczną mapę parametrów na atlas zebry wyżynnej (Rycina 5) ⁹ w programie SPM8, aby zlokalizować aktywacje funkcjonalne (Rycina 6).