Synergistyczny efekt światła widzialnego i gentamycyny w odniesieniu do mikroorganizmów Pseudomona aeruginosa

Podsumowanie

Wykazujemy, że opracowane urządzenie biomedyczne wykorzystujące ciągłe lub impulsowe leczenie laserem światła widzialnego w połączeniu z antybiotykoterapią (gentamycyną) wywołuje statystycznie istotny efekt synergistyczny, prowadzący do zmniejszenia żywotności P. aeruginosa PAO1 o 8 log w porównaniu z samą antybiotykoterapią.

Streszczenie

W ostatnim czasie ukazało się kilka publikacji na temat bakteriobójczego działania światła widzialnego, z których większość stwierdza, że za zabijanie różnych patogenów odpowiedzialna jest niebieska część widma (400 nm-500 nm)^1-5. Zasugerowano, że fototoksyczny efekt niebieskiego światła jest wynikiem indukowanego światłem tworzenia się reaktywnych form tlenu (ROS) przez endogenne bakteryjne fotosensybilizatory, które absorbują światło głównie w obszarze niebieskim^4,6,7. Istnieją również doniesienia o działaniu biobójczym światła czerwonego i bliskiej podczerwieni⁸, a także światła zielonego⁹.

W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodę, która pozwoliła nam scharakteryzować wpływ wysokoenergetycznego zielonego światła (długość fali 532 nm) w trybie ciągłym (CW) oraz impulsowym z przełącznikiem Q (Q-S) na Pseudomonas aeruginosa. Wykorzystując tę metodę, zbadaliśmy również wpływ zielonego światła w połączeniu z leczeniem antybiotykiem (gentamycyną) na żywotność bakterii. P. aeruginosa jest powszechnym nosokomialnym patogenem oportunistycznym wywołującym różne choroby. Szczep ten jest dość odporny na wiele antybiotyków i zawiera wiele przewidywanych systemów effluxu wielolekowego RND typu AcrB/Mex¹⁰.

W zastosowanej metodzie wykorzystano wolno żyjące bakterie Gram-ujemne w fazie stacjonarnej (P. aeruginosa szczep PAO1), hodowane w pożywce Luria Broth (LB) i poddane działaniu laserów z przełącznikiem Q i/lub laserów CW, z dodatkiem lub bez dodatku antybiotyku gentamycyny. Żywotność komórek określano w różnych punktach czasowych. Uzyskane wyniki wykazały, że sama terapia laserowa nie obniżyła żywotności komórek w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną, a sama terapia gentamycyną spowodowała jedynie 0,5 log redukcji liczby żywych komórek P. aeruginosa. Jednakże połączone zastosowanie lasera i gentamycyny wywołało efekt synergistyczny, a żywotność P. aeruginosa została zredukowana o 8 log.

Zaproponowaną metodę można dodatkowo wdrożyć poprzez opracowanie urządzenia typu cewnik, zdolnego do wstrzykiwania roztworu antybiotyku do zainfekowanego narządu przy jednoczesnym naświetlaniu tego obszaru.

Protokół

1. Hodowla bakterii

1. Gram-ujemny szczep P. aeruginosa PAO1 hodowano w bulionie Luria (LB) w temperaturze 37 °C przez 18 hr.
2. Kulturę komórek odwirowano następnie przy 7,500 rpm (obrotów na minutę) przez 5 min, a supernatant usunięto.
3. Bakterie zawieszono ponownie w 10% LB i inkubowano przez kolejne 2 hr, aby kultura ponownie weszła w fazę stacjonarną.
4. Zawiesinę bakterii podzielono następnie na dwie grupy: do pierwszej grupy (2 probówki) nie dodawano antybiotyku, natomiast do drugiej grupy dodano antybiotyk gentamycynę (50 μg/ml).

2. Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU)

1. W celu określenia żywotności komórek pobierano próbki o objętości 20 μl z eksperymentu mniej więcej co 2 hr w ciągu 24 hr. Próbki poddano rozcieńczeniom seryjnym, a następnie wysiano na płytki z agarem LB i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Dla każdej grupy traktowania określono liczbę CFU na płytce i dokonano porównania między poszczególnymi przedziałami czasowymi i różnymi sposobami traktowania. Logarytmiczną redukcję CFU obliczono zgodnie z równaniem (1):
   Log reduction= LogU-LogC[CFU/ml]
   Gdzie U to wartość jednostek tworzących kolonie w każdym punkcie czasowym; CFU to jednostka tworząca kolonię, a jednostki CFU/ml są równe:
   CFU/ml = ( liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia )/( objętość inokulatu )
   Natomiast C to liczba CFU stwierdzona w próbce kontrolnej w czasie początkowym. Należy zauważyć, że U oznacza współczynnik tworzenia kolonii w momencie pomiaru.
3. Współczynnik rozcieńczenia to liczba rozcieńczeń, w których w każdym z nich stężenie bakterii zostało zredukowane dziesięciokrotnie. Objętość inokulatu wynosiła zawsze 200 µL i jest ona powiązana z rozmiarem użytej probówki.

Podsumowując kwestię stężeń, antybiotyk gentamycyna zastosowano w stężeniu 50 μg/ml. W odniesieniu do bakterii, do końca procesu wykonano łącznie 8 rozcieńczeń. Każde rozcieńczenie było dziesięciokrotne i przeprowadzano je w probówkach o objętości 200 μl. Punktem wyjścia było dodanie 20 μl próbek do probówki 200 μl (zatem stężenie początkowe wynosiło 20/200C₀=0.1C0, gdzie C₀ oznacza stężenie początkowe w 20 μl próbek), a stężenie końcowe zostało zredukowane o 8 rzędów wielkości w wyniku 8 rozcieńczeń.

3. Oświetlenie

1. Laser CW Nd:YAG (długość fali 532 nm i średnia moc optyczna 200 mW) został rozdzielony na dwie ścieżki optyczne za pomocą optycznego dzielnika wiązki 50%/50%. Średnica wiązki wynosiła około 10 mm. Czas naświetlania wynosił 24 hr.
2. Impulsowy laser Nd:YAG z przełącznikiem Q (długość fali 532 nm, średnia moc 300 mW i szczytowa moc optyczna 2,5 MW) został również rozdzielony na dwie ścieżki za pomocą optycznego dzielnika wiązki 50%/50%. Średnica plamki wynosiła 6 mm. Szerokość impulsu lasera z przełącznikiem Q wynosiła 6 nsec, a częstotliwość repetycji 15Hz. Średnia gęstość mocy wynosiła 106 mW/cm², a szczytowa gęstość mocy 8,83 kW/mm². Czas naświetlania wynosił 24 hr.

Należy zauważyć, że zawiesina bakteryjna była mieszana podczas napromieniowania i utrzymywana w odpowiednich warunkach hodowlanych zapewniających wzrost bakterii (we wszystkich probówkach znajdowało się podłoże Luria Broth, aby umożliwić wzrost bakterii).

Wyniki

Układ oparty na laserze przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. W pierwszym wariancie eksperymentalnym wykorzystano laser Nd:YAG w trybie ciągłym (CW) o długości fali 532 nm (druga harmoniczna Nd:YAG) i średniej mocy optycznej 200 mW. Wiązka ta została rozdzielona na dwie ścieżki optyczne za pomocą dzielnika wiązki 50%/50%, tak aby każda z rozdzielonych wiązek miała moc 100 mW. Średnica wiązki wynosiła około 10 mm, zatem gęstość mocy wynosiła około 100 mW/cm². Czas ekspozycji wynosił 24 hr. ...

Dyskusja

Fototerapia w ostatnich latach stała się obszarem zaawansowanych badań multidyscyplinarnych, wyłaniając się jako obiecujące podejście w leczeniu licznych chorób. W tym kontekście szeroko badano wykorzystanie światła w zakresie widzialnym. Przykładowo stwierdzono, że zakażone rany można leczyć skuteczniej, poddając je działaniu intensywnego światła widzialnego w celu sterylizacji. Udowodniono, że mechanizm działania tej metody polega na indukowaniu przez światło reaktywnych form tlenu (ROS), które zabijają bakterie^11...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka Lauria	Difco	241420
Gentamycyna	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710