Artykuł metodologiczny

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

DOI:

10.3791/4372

⸱

24 listopada 2012

 ,  , 
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, Tehran, Iran, 2Department of Endocrinology & Female Infertility, Reproductive Biomedicine Center, Royan Institute for Reproductive Biomedicine, ACECR, Tehran, Iran

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwijające się zęby mądrości stanowią łatwo dostępne źródło komórek macierzystych w wieku dorosłym, które można pozyskać podczas rutynowych zabiegów ortodontycznych. Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z miazgi zęba (hDPSCs) wykazują wysoki potencjał proliferacyjny oraz zdolność do różnicowania wieloliniowego w porównaniu z typowymi źródłami dorosłych komórek macierzystych1-8; w związku z tym hDPSCs mogą być odpowiednimi kandydatami do autologicznego przeszczepiania w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Oprócz tych zalet, posiadanie cech mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), takich jak efekt immunomodulacyjny, czyni hDPSCs bardziej wartościowymi, nawet w przypadku transplantacji allogenicznej6,9,10. Dlatego podstawowym krokiem w wykorzystaniu tego źródła komórek macierzystych jest wybór najlepszego protokołu izolacji hDPSCs z tkanki miazgi. Aby osiągnąć ten cel, kluczowe jest zbadanie wpływu różnych warunków izolacji na różne zachowania komórkowe, takie jak ich typowe markery powierzchniowe oraz zdolność do różnicowania.

W związku z tym w niniejszej pracy wyizolowano tkankę miazgi z ludzkich zatrzymanych zębów trzecich każdego z pacjentów, a następnie zastosowano oba istniejące protokoły oparte na literaturze do izolacji hDPSCs,11-13 t.j. dysocjację enzymatyczną tkanki miazgi (DPSC-ED) lub przerost z eksplantów tkankowych (DPSC-OG). W tym celu próbowano usprawnić metody izolacji poprzez zastosowanie dentystycznej tarczy diamentowej. Następnie komórki te scharakteryzowano pod kątem markerów związanych ze stromalnymi komórkami macierzystymi (CD73, CD90, CD105 i CD44), markerów hematopoetycznych/śródbłonkowych (CD34, CD45 i CD11b), markerów naczyniowych, takich jak CD146, a także STRO-1. Następnie oba protokoły porównano pod kątem potencjału różnicowania w odontoblasty, wykorzystując zarówno ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (QPCR), jak i barwienie Alizariną Czerwoną. QPCR wykorzystano do oceny ekspresji genów związanych z mineralizacją (fosfataza alkaliczna; ALP, macierzowa zewnątrzkomórkowa fosfoglikoproteina; MEPE i dentynowa sialofosfoproteina; DSPP).14

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki macierzyste są komórkami klonogennymi, które posiadają dwie niezwykłe cechy, znane jako wielopotencjalność oraz zdolność do samoodnowy15. spośród wszystkich komórek macierzystych o różnym potencjale replikacyjnym, komórki macierzyste pochodzenia stomatologicznego, jako komórki macierzyste postnatalne, przyciągnęły w ostatnich latach uwagę ze względu na ich dostępność, plastyczność i wysoką zdolność do proliferacji w porównaniu z innymi dorosłymi komórkami macierzystymi16. Charakterystycznie, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste, komórki macierzyste miazgi zęba są przylegającymi komórkami klonogennymi, które wykazują zdolność do różnicowania w wielu kierunkach w linie mezenchymalne i/lub niemezenchymalne, zarówno in vitro, jak i in vivo.1-8,17,18 DPSCs są identyfikowane na podstawie braku ekspresji antygenów hematopoetycznych (np. CD45, CD34, CD14) oraz obecności ekspresji CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 i STRO-1.19,20

Łatwość uzyskania potencjału przy minimalnym bólu i zachorowalności sprawia, że ludzkie DPSCs są cennym źródłem MSCs w porównaniu ze standardowymi źródłami, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego21. Generalnie DPSCs izoluje się za pomocą metody wypłukiwania, t.j. migracji komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG)22-24 i/lub poprzez trawienie enzymatyczne (DPSC-ED)4,6,25. Wcześniejsze badania wykazały, że metoda izolacji i warunki hodowli mogą indukować różne populacje lub linie podczas pasaży in vitro26,27. W przypadku zębów trwałych (pDPSCs), Huang et al wykazali, że pDPSCs poddane trawieniu enzymatycznemu mają wyższy potencjał proliferacyjny w porównaniu do DPSCs uzyskanych metodą wypłukiwania.26 Ponadto, w przypadku zębów mlecznych (dDPSCs), wykazano, że markery STRO-1 i CD34 wykazują silniejszą ekspresję w dDPSC-ED w porównaniu z dDPSC-OG. Dodatkowo, dDPSC-ED wykazały wyższy stopień mineralizacji w określonym medium osteo/odonto.27 W związku z tym, ze względu na wyjątkowy potencjał DPSCs w medycynie regeneracyjnej, wymagane będą dalsze badania w celu lepszego zrozumienia możliwych różnych populacji pochodzących z różnych metod izolacji.

W niniejszej pracy podjęto próbę wprowadzenia łatwego sposobu ekstrakcji miazgi, wykorzystując jednowykorzystywalną diamentową tarczę dentystyczną w celu usprawnienia tego procesu. Ponadto, po wyizolowaniu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych z miazgi z zastosowaniem metod ED lub OG, zbadano właściwości ogólne oraz zdolność do różnicowania się obu grup.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu enzymu i medium do proliferacji (PM)

  1. Przygotowanie roztworu kolagenazy typu I: Odważyć kolagenazę typu I (12 mg/ml), rozpuścić w 1 ml PBS i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Następnie przelać do probówki 15 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Przygotowanie roztworu dyspazy: Odważyć dyspazę (16 mg/ml), rozpuścić w 1 ml PBS i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Następnie przelać do probówki 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  3. Przygotowanie roztworu enzymatycznego: Dodać 1 ml roztworu kolagenazy typu I (12 mg/ml) oraz 1 ml roztworu dyspazy (16 mg/ml) do 2 ml sterylnego PBS zawierającego 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Końcowe stężenie dyspazy i kolagenazy I w całkowitej objętości powinno wynosić odpowiednio 4 mg/ml i 3 mg/ml. Następnie rozdzielić tę objętość do czterech probówek 15 ml, z których każda powinna zawierać 1 ml roztworu enzymatycznego. Każda probówka może zostać wykorzystana do jednego trawienia miazgi.
  4. Przygotowanie roztworu do płukania: Dodać 100 mg/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny do PBS.
  5. Przygotowanie pożywki podstawowej: Pożywka Eagle'a z modyfikacją alfa (α-MEM) uzupełniona o 10% FBS oraz 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
  6. Przygotowanie pożywki proliferacyjnej (PM): Pożywka Eagle'a z modyfikacją alfa (α-MEM) uzupełniona o 10% FBS, 100 μM L-kwasu askorbiniowego 2-fosforanu, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny oraz 0,25 mg/ml amfoterycyny B.
  7. Przygotowanie pożywki odontogennej: Pożywka Eagle'a z modyfikacją alfa (α-MEM) uzupełniona o 10% FBS, 100 μM L-kwasu askorbiniowego 2-fosforanu, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 0,01 μM deksametazonu, 5 mM β-fosforanu glicerolu oraz 1,8 mM fosforanu jednopotasowego.

2. Przygotowanie tkanki miazgi zębnej człowieka do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej

  1. Zdrowe ludzkie trzecie trzonowce pobrano od osób dorosłych (w wieku 21-29 lat) w klinice stomatologicznej Imam Ali po uzyskaniu zgody Institutional Review Board (IRB).
  2. Zęby umieszczono w medium podstawowym (α-MEM uzupełniony o 10% FBS) i przetransportowano do laboratorium w temperaturze 4 °C.
  3. W warunkach sterylnych, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza dla materiałów biologicznie niebezpiecznych, przygotowano po jednej szalce Petriego o średnicy 100 mm dla każdego zęba przeznaczonego do obróbki. Powierzchnie zębów oczyszczono 70% etanolem.
  4. Podczas pracy w jednej z szalek Petriego ząb trzymano kleszczykami stomatologicznymi, a za pomocą skalpela usuwano zanieczyszczenia oraz więzadło ozębne z korzeni.
  5. Połączenie cementowo-emaliowe powoli przecięto za pomocą sterylnej tarczy stomatologicznej, aby odsłonić jamę miazgi. Należy pamiętać, że proces cięcia musi być przeprowadzany powoli, aby zminimalizować przegrzanie tkanki zęba.
  6. Tkankę miazgi delikatnie oddzielono od korony i korzenia.
  7. Tkankę miazgi pocięto na małe fragmenty za pomocą skalpela.

3. Izolacja ludzkiej miazgi zęba

  1. Tkanki miazgi poddano albo dysocjacji enzymatycznej, albo bezpośredniemu wyprowadzeniu komórek z eksplantatów tkanki miazgi w celu izolacji hDPSCs.
  2. Dysocjacja enzymatyczna tkanki miazgi:
    1. Małe fragmenty tkanek miazgi przeniesiono do roztworu enzymatycznego na 1 hr w temperaturze 37 °C. Co 30 min mieszano na wirówce typu vortex, aby wspomóc rozpad tkanki.
    2. Następnie usunięto duże agregaty komórkowe, a zawiesiny pojedynczych komórek uzyskano poprzez przepuszczenie komórek przez sitko komórkowe o rozmiarze 70-μM.
    3. Zawiesiny pojedynczych komórek wirowano z prędkością 1,200 rpm przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    4. Nadfiltr ostrożnie odpipetowano, a osad resuspenderowano w 1 ml medium proliferacyjnego (PM). (Uwaga: FBS w medium proliferacyjnym hamuje dysocjację enzymatyczną.)
    5. Zawiesiny pojedynczych komórek miazgi zębowej wysiano do kolb hodowlanych o powierzchni 25 cm2 z dodatkiem PM, a następnie inkubowano w 37 °C w 5% CO2.
    6. Medium hodowlane zmieniano co trzy dni aż do osiągnięcia konfluencji komórek.
  3. Bezpośrednie wyprowadzenie komórek z eksplantatów tkanki miazgi:
    1. Tkankę miazgi posiekano na fragmenty o wielkości 1-2-mm, a każdy fragment umieszczono w kolbach hodowlanych o powierzchni 25-cm2 z PM, a następnie inkubowano w 37 °C w 5% CO2. Należy pamiętać, że całkowita objętość PM do wyprowadzenia komórek musi umożliwiać przytwierdzenie fragmentów miazgi dla dalszego wzrostu komórek (2-3 ml na kolbę).
    2. Medium zmieniano po zaobserwowaniu wyprowadzenia komórek.
    3. Wyprowadzone komórki po osiągnięciu konfluencji poddano pasażowaniu w stosunku 1:4 (pasaż 1).

4. Immunofenotypowanie

  1. 250 000 komórek/probówkę obu typów komórek w trzecim pasażu inkubowano z przeciwciałami antyludzkimi sprzężonymi z PE lub FITC oraz ich izotypami przez 30 min w temperaturze 4 °C w ciemności. (Uwaga: stężenie przeciwciał zastosowano zgodnie z protokołem producenta.)
  2. Po czasie inkubacji do każdej probówki dodano 100 μl PBS lub roztworu rozcieńczającego do FACS, a następnie odwirowano przy 1 200 rpm przez 5 min w ciemności.
  3. Nadnadocz został usunięty, a osady zawieszono ponownie w 100 μl PBS lub rozcieńczalnika do FACS w ciemności.
  4. Analizę docelowych markerów powierzchniowych (markerów CD) przeprowadzono za pomocą BD FACSCalibur.

5. Indukcja różnicowania DPSCs w komórki zmineralizowane i ilościowy test Alizarin Red S

  1. Komórki macierzyste z miazgi zęba (DPSCs), uzyskane albo poprzez enzymatyczną dysocjację tkanki miazgi (znane jako DPSC-ED), albo poprzez bezpośredni wzrost komórek z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG), poddawano subkulturacji przez 3 pasaże.
  2. W trzecim pasażu komórki wysiano do płytki 6-dołkowej w zagęszczeniu 5 000 komórek na dołek.
  3. Przy konfluencji 60% podłoże odontogenne zastąpiono konwencjonalnym podłożem PM. Trzy studzienki pozostały jako kontrola negatywna poprzez dodanie podłoża wzrostowego.
  4. Wymiana medium co 3 dni do 21. dnia.
  5. W 21. dniu komórki przemyto PBS, a następnie utrwalono za pomocą 1 ml/studzienkę 10% paraformaldehydu przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  6. Następnie ostrożnie odessano paraformaldehyd, a komórki przemyto 3 razy (po 5–10 min każdego razie) wodą destylowaną H2O2O. (Uwaga: Należy unikać naruszania warstwy monowarstwowej.
  7. Po przemyciu do każdej dołki dodano 1 ml Alizaryny czerwonej S na 20 min w temperaturze pokojowej.
  8. Komórki przemyto zjonizowaną wodą H2O2Cztery razy (po 5 min za każdym razem, przy delikatnym kołysaniu), aby usunąć nadmiar czerwieni alizarynowej.
  9. 1 ml/dołek H2Dodano O, aby zapobiec wysychaniu komórek.
  10. Płytki poddano inspekcji wizualnej i/lub akwizycji obrazu.
  11. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej barwieniem Alizarin Red S, H2Do każdego dołka płytki 6-dołkowej wlano 1 ml 10% kwasu octowego w miejsce roztworu O. & inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu.
  12. Następnie monowarstwę komórek w każdej studni zeskrobano. & obie formy kwasu octowego & komórki przeniesiono do osobnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Uwaga: zawartość każdej studzienki należy przenieść do osobnej probówki t. j. trzy studnie testowe & trzy studzienki kontrolne dla każdego ED & grupy OG)
  13. Probówki intensywnie mieszano na wirówce vortex przez 30 s.
  14. Ogrzewać w temperaturze 85 °C przez 10 min. (Uwaga: aby uniknąć odparowania, probówki uszczelniono parafilmem.)
  15. Po podgrzaniu probówki przeniesiono do lodu na 5 min.UwagaProbówek nie należy otwierać do czasu ich ostygnięcia.
  16. Zawiesiny odwirowano przy 20 000 x g przez 15 min. W czasie wirowania przygotowano standardy Alizarin Red.

Standardy Alizarin Red S przygotowano, najpierw rozcieńczając bufor do rozcieńczeń, a następnie wykonując 2-krotne rozcieńczenia seryjne zgodnie z tabelą.

Wysoki zakres stężenia barwnika Niskie stężenie barwnika
2 mM1 mM500 μM250 μM125 μM62,5 μM31,3 μM15,6 μM7,8 μM3,9 μM1,9 μM0,9 μM0,4 μMPuste
  1. Po wirowaniu 1 ml supernatantu z każdej probówki przeniesiono do nowych, oddzielnych probówek mikrocentryfugicznych o pojemności 1,5 ml.
  2. pH zneutralizowano, dodając ok. 375 μl 10% wodorotlenku amonu do każdej probówki. (Uwaga: zakres pH powinien wynosić 4,1-4,5.)
  3. 150 μl standardów i próbek (łącznie z oddzielnymi próbami badawczymi i kontrolami) naniesiono na płytkę 96-dołkową z nieprzezroczystymi ściankami i przezroczystym dnem.
  4. Absorbancję odczytano przy 405 nm, a wartości OD z próbek porównano z wykresem standardowym w celu dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tutaj przedstawiono DPSCs uzyskane poprzez dysocjację enzymatyczną (DPSC-ED) w dniu 10, 15 i 18 (Rysunek 1). Kolonie zaczęły tworzyć się mniej więcej od 3 do 5 dni po izolacji.
  2. DPSCs uzyskane metodą wyprowadzania (DPSC-OG) przedstawiono na Rysunku 2 w dniu 5, 10, 13 i 18. Komórki o fenotypie fibroblastycznym zaczęły migrować z tkanki miazgi do kolby, układając się równolegle, mniej więcej 5 dni po wysianiu.
  3. DPSCs w trzecim pasażu z zastosowaniem obu metod przedstawiono n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje proces izolacji i charakterystyki hDPSCs z miazgi zębowej przy użyciu dwóch metod: dysocjacji enzymatycznej oraz bezpośredniego wyrastania komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi. Ponadto oceniono różnicowanie tych komórek in vitro w odontoblasty za pomocą ilościowego testu Alizarin Red S oraz QPCR.

W istniejących protokołach izolacji tkanki miazgi z ludzkiego zęba stosowano różne instrumenty, takie jak kleszcze (kleszcze kostne)9, igły d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyrażamy wdzięczność dr Leila Shakeri i dr Aref Dournaei za krytyczne dyskusje oraz panu Mohammad Reza Khadem Sharif za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
α-MEMGIBCO11900-073
Kolagenaza typu ISigma-AldrichC0130-100MG
DyspazaGIBCO17105-041
Penicylina/streptomycynaGIBCO15140-122
Amfoterycyna BGIBCO15290-018
definiowana płodowa surowica bydlęca (FBS)HyCloneSH30070.03
L-askorbinian 2-fosforanSigmaA8960-5G
L-glutaminaGIBCO25030-024
DeksametazonSigmaD4902
β-Glicerynian fosforanu dwusodowy nawodniony, BioUltraSigmaG9422-100G
Wodorofosforan potasuSigma-AldrichP5655
Zestaw do analizy osteogenezyMilliporePS01802031
Kontrola izotypowa mysiej IgG2b-PEBD Pharmingen50808088029
kontrolny izotyp FITC mouse IgG2bBD Pharmingen559532
FITC mysia IgG1 κ izotypBD Pharmingen11471471
FITC/PE przeciwciała mysie przeciw ludzkim antygenom CD34/CD45BD Pharmingen341071
PE przeciwciało anty-ludzkie CD146BD Pharmingen550315
Monoklonalne przeciwciało mysie anty-ludzkie CD90/FITCDaka00034418
przeciwciało mysie anty-CD73 ludzkie znakowane PEBD Pharmingen550257
Przeciwciało anty-h CD105/Endoglin PEBD PharmingenFAB10971P
przeciwciało mysie anty-ludzkie CD11b/Mac1 znakowane PEBD Pharmingen5553888
CD44 PE mysia przeciwciała antyludzkieBD Pharmingen555479
roztwór buforu fosforanowego (PBS)GIBCO003000
70-μsito do komórek mFalcon352360
0.2 μfiltr strzykawkowy mMillex-GVSLGV033RB
25 cm2 kolba hodowlanaSigma-AldrichZ707481
SPRZĘT
BD FACSCaliburBD342975
spektrofotometr do mikropłytek multiskan Thermo Scientific51119200
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus
Oprogramowanie Flowing w wersji 2.3.1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. Stem cell-based biological tooth repair and regeneration. Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).
  2. Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).
  3. Gandia, C., et al. Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction. Stem Cells. 26, 638-645 (2008).
  4. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).
  5. Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration. Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).
  6. Kerkis, I., et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic. J. Transl. Med. 6, 35(2008).
  7. Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory. Dent. Update. 34, 20-29 (2007).
  8. Cordeiro, M. M., et al. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).
  9. Pierdomenico, L., et al. Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp. Transplantation. 80, 836-842 (2005).
  10. de Mendonca Costa, A., et al. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives. Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).
  12. Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells. Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).
  13. Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth. J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).
  14. Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. Expression of mineralization markers in dental pulp cells. J. Endod. 33, 703-708 (2007).
  15. Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).
  16. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).
  17. Graziano, A., et al. Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering. J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).
  18. d'Aquino, R., et al. Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).
  19. Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury. Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).
  20. Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).
  21. Tomic, S., et al. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).
  22. Tsukamoto, Y., et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).
  23. About, I., et al. Human dentin production in vitro. Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).
  24. Couble, M. L., et al. Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures. Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).
  25. Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor. Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).
  26. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).
  27. Bakopoulou, A., et al. Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth. Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).
  28. Curtis, K. M., et al. EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells. BMC Mol. Biol. 11, 61(2010).
  29. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).
  30. d'Aquino, R., et al. Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).
  31. Atari, M., et al. Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp. Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dysocjacja enzymatycznametoda wyp ywucytometria przep ywowar nicowanie odontoblast wbarwienie alizaryn czerwonanaliza qPCRmarkery mezenchymalneCD73 CD90 CD105izolacja kom rek macierzystych

Powiązane artykuły