Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej pochodzących z zębów stałych przy użyciu dwóch różnych metod

Summary

Metoda opisywała izolację i charakterystykę ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) za pomocą enzymatycznej dysocjacji miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wzrostu komórek macierzystych z eksplantatów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie następuje porównawcze różnicowanie in vitro obu typów hDPSC do odontoblastów.

Abstract

Rozwijające się zęby mądrości są łatwo dostępnym źródłem komórek macierzystych w wieku dorosłym, które można uzyskać dzięki rutynowym zabiegom ortodontycznym. Ludzkie komórki macierzyste pochodzące z miazgi (hDPSC) mają wysoki potencjał proliferacyjny i zdolność różnicowania wieloliniowego w porównaniu ze zwykłym źródłem dorosłych komórek macierzystych^1-8; w związku z tym hDPSC mogą być dobrymi kandydatami do przeszczepu autologicznego w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Wraz z tymi korzyściami, posiadanie cech mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), takich jak efekt immunolodulacyjny, sprawia, że hDPSC są bardziej wartościowe, nawet w przypadku przeszczepu allogenicznego^6,9,10. Dlatego podstawowym krokiem do wykorzystania tego źródła komórek macierzystych jest wybór najlepszego protokołu izolowania hDPSC z tkanki miazgi. Aby osiągnąć ten cel, kluczowe jest zbadanie wpływu różnych warunków izolacji na różne zachowania komórkowe, takie jak ich wspólne markery powierzchniowe, a także ich zdolność do różnicowania.

Tak więc, tutaj oddzielamy ludzką tkankę miazgi od zatrzymanych trzecich zębów trzonowych, a następnie używamy obu istniejących protokołów opartych na literaturze, do izolacji hDPSC,11-13, tj. enzymatycznej dysocjacji tkanki miazgi (DPSC-ED) lub wyrostka z eksplantatów tkanek (DPSC-OG). W związku z tym staraliśmy się ułatwić metody izolacji za pomocą dentystycznego dysku diamentowego. Następnie komórki te scharakteryzowały się pod względem markerów związanych ze zrębem (CD73, CD90, CD105 i CD44), markerów krwiotwórczych/śródbłonka (CD34, CD45 i CD11b), markerów okołonaczyniowych, takich jak CD146, a także STRO-1. Następnie te dwa protokoły porównano w oparciu o siłę różnicowania do odontoblastów zarówno za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (QPCR), jak i barwienia czerwienią alizaryny. QPCR wykorzystano do oceny ekspresji genów związanych z mineralizacją (fosfataza alkaliczna; ALP, fosfoglikkoproteina zewnątrzkomórkowa macierzy; MEPE i sialofosfoproteina zębiny; DSPP). ¹⁴

Introduction

Komórki macierzyste to komórki klonogenne, które posiadają dwie niezwykłe cechy, znane jako multipotencja i samoodnowa¹⁵. Spośród wszystkich komórek macierzystych o różnych potencjach replikacyjnych, komórki macierzyste zęba jako postnatalne komórki macierzyste przyciągnęły uwagę w ostatnich latach ze względu na ich dostępność, plastyczność i wysoką zdolność proliferacyjną w porównaniu z innymi dorosłymi komórkami macierzystymi¹⁶. Charakterystycznie, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste, komórki macierzyste miazgi zębowej są przylegającymi komórkami klonogennymi, które mają zdolność wielokrotnego różnicowania się w linie mezenchymiczne i/lub niemezenchymiczne, zarówno in vitro, jak i in vivo. ^1-8,17,18 DPSC identyfikuje się na podstawie ujemnej ekspresji antygenów krwiotwórczych (np. CD45, CD34, CD14) oraz dodatniej ekspresji CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 i STRO-1. ^19,20

Łatwo uzyskany potencjał przy minimalnym bólu i zachorowalności sprawiają, że ludzkie DPSC są cennym źródłem MSCs w porównaniu ze zwykłymi źródłami, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego²¹. Ogólnie rzecz biorąc, DPSC zostały wyizolowane metodą wzrostu, tj. migracją komórek macierzystych z eksplantatów tkanki miazgi (DPSC-OG)^22-24 i/lub trawieniem enzymatycznym (DPSC-ED)^4,6,25. Wcześniejsze badania wykazały, że metoda izolacji i warunki hodowli mogą indukować różne populacje lub linie w pasażach in vitro ^26,27. W przypadku zębów stałych (pDPSC) Huang i wsp. wykazali, że trawione enzymatycznie pDPSC mają wyższy potencjał proliferacyjny w porównaniu z wyrosłymi ^DPSC.26 Ponadto w przypadku zębów mlecznych (dDPSC) wykazano, że markery STRO-1 i CD34 wyrażają się bardziej w dDPSC-ED w porównaniu z dDPSC-OG. Ponadto dDPSC-ED wykazywał wyższy współczynnik mineralizacji w określonym pożywce osteo/odonto. ²⁷ W związku z tym, ze względu na wyjątkowy potencjał DPSC w medycynie regeneracyjnej, konieczne będą dalsze badania w celu lepszego zrozumienia możliwych różnych populacji, które pochodzą z różnych metod izolacji.

Tutaj próbowano wprowadzić łatwy sposób ekstrakcji miazgi, poprzez użycie jednoetapowego diamentowego dysku dentystycznego, aby ułatwić proces ekstrakcji miazgi. Ponadto, po wyizolowaniu ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pulpy za pomocą metod ED lub OG, zbadano również ogólne właściwości i zdolność różnicowania między dwiema grupami.

Protocol

1. Przygotuj roztwór enzymu i pożywkę proliferacyjną (PM)

1. Przygotuj roztwór kolagenazy typu I: Odważyć kolagenazę typu I (12 mg/ml) i rozpuścić w 1 ml PBS i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Następnie umieść probówkę o pojemności 15 ml i utrzymuj ją w temperaturze -20 °C, aż będzie potrzebna.
2. Przygotuj roztwór dypazy: Odważyć dypazę (16 mg/ml) i rozpuścić w 1 ml PBS i przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Następnie umieścić probówkę o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie potrzebna.
3. Przygotować roztwór enzymatyczny: Dodać 1 ml roztworów kolagenazy typu I (12 mg/ml) i 1 ml roztworów dypazy (16 mg/ml) do 2 ml sterylnego PBS zawierającego 100 mg/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny. Całkowite stężenie dypazy i kolagenazy I w końcowej objętości powinno wynosić 4 mg/ml i 3 mg/ml receptywnie. Następnie podzielić tę objętość na cztery probówki o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 1 ml roztworu enzymu. Każda probówka może być użyta do jednego trawienia miazgi.
4. Przygotuj roztwór myjący: Dodaj 100 mg/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny do PBS.
5. Przygotuj podstawowe pożywki: Modyfikacja alfa pożywki Eagle'a (α-MEM) uzupełniona 10% FBS i 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny.
6. Wytwarzanie pożywki proliferacyjnej (PM): Modyfikacja alfa pożywki Eagle'a (α-MEM) uzupełniona 10% FBS, 100 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 0,25 mg/ml amfoterycyny B.
7. Wytwarzanie pożywki zębontogennej: Modyfikacja alfa pożywki Eagle's (α-MEM) uzupełniona 10% FBS, 100 μM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego, 2 mM L-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny, 0,01 μM deksametazonu, 5 mM fosforanu β-glicerolu, 1,8 mM fosforanu monopotasowego.

2. Przygotowanie tkanki ludzkiej miazgi zębowej do izolacji komórek macierzystych miazgi zębowej

1. Normalne ludzkie trzecie zęby trzonowe zostały pobrane od dorosłych (w wieku 21-29 lat) w Klinice Dentystycznej Imama Ali pod nadzorem zatwierdzonej Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB).
2. Zęby umieszczono w pożywce podstawowej (α-MEM uzupełnioną 10% FBS) i przeniesiono do laboratorium w temperaturze 4 °C.
3. W sterylnych warunkach, pracując w okapie z przepływem laminarnym o zagrożeniu biologicznym, ustawiono jedną 100-milimetrową szalkę Petriego dla każdego zęba, który miał być poddany obróbce. Powierzchnie zębów zostały oczyszczone 70% etanolem.
4. Podczas pracy na jednej z szalek Petriego ząb był utrzymywany za pomocą kleszczy dentystycznych, a ostrze skalpela służyło do usuwania zanieczyszczeń i więzadeł przyzębia na korzeniach.
5. Połączenie cementowo-szkliwne było powoli przecinane za pomocą wysterylizowanej tarczy zębowej w celu odsłonięcia komory miazgi. Należy wziąć pod uwagę, że proces cięcia musi być wykonywany powoli, aby zmniejszyć przegrzanie tkanki zęba.
6. Tkanka miazgi została delikatnie oddzielona od korony i korzenia.
7. Tkankę miazgi pocięto na drobne kawałki za pomocą ostrza skalpela.

3. Izolacja ludzkiej miazgi zębowej

1. Tkanki miazgi poddano albo enzymatycznej dysocjacji tkanki miazgi, albo bezpośredniemu wyrostowi komórek z eksplantatów tkanki miazgi w celu wyizolowania hDPSC.
2. Enzymatyczna dysocjacja tkanki miazgi:
   1. Małe kawałki tkanek miazgi przeniesiono do roztworu enzymatycznego na 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Wiruj co 30 minut, aby pomóc w rozbiciu tkanki.
   2. Następnie usunięto duże agregaty komórkowe i uzyskano zawiesiny pojedynczych komórek, przepuszczając komórki przez sitko komórkowe o średnicy 70 μM.
   3. Zawiesiny jednokomórkowe odwirowywano z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Supernatanty ostrożnie odpipetowano, a osad ponownie zawieszono w 1 ml pożywki proliferacyjnej (PM). (Uwaga: FBS w pożywce proliferacyjnej kończy dysocjację enzymatyczną.)
   5. Jednokomórkowe zawiesiny miazgi zębowej wysiewano do kolby hodowlanej o średnicy 25^cm2 z PM, a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
   6. Pożywkę hodowlaną zmieniano co trzy dni, aż do osiągnięcia zbiegu komórek.
3. Bezpośredni wzrost komórek z eksplantatów tkanki miazgi:
   1. Tkankę miazgi rozdrobniono na fragmenty o średnicy 1-2 mm, a każdy kawałek umieszczono w kolbach hodowlanych o średnicy 25^cm2 z PM, a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 .} Należy wziąć pod uwagę, że całkowita objętość PM dla wzrostu komórki musi wspierać przyczepienie się kawałków miazgi w celu dalszego wzrostu komórek (2-3 ml na kolbę).
   2. Pożywka uległa zmianie po zaobserwowaniu przerostu.
   3. Wyrośnięte komórki podczas konfluencji hodowano w stosunku 1:4 (pasaż 1).

4. Immunofenotypowanie

1. 250 000 komórek/probówkę obu typów komórek w pasażu 3 inkubowano za pomocą PE lub sprzężonych z FITC przeciwciał anty-ludzkich z ich izotypami przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemnym miejscu. (Uwaga: stężenie przeciwciał zastosowano zgodnie z protokołem wytwarzania.)
2. Po czasie inkubacji do każdej probówki dodano 100 μl roztworu rozcieńczającego PBS lub FACS i odwirowano z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut w ciemnym miejscu.
3. Supernatanty usunięto, a granulki ponownie zawieszono w 100 μl PBS lub rozcieńczeniu FACS w ciemnym miejscu.
4. Docelowe markery powierzchniowe (markery CD) oceniano za pomocą BD FACSCalibur.

5. Indukcja różnicowania DPSC w zmineralizowane komórki i ilościowe oznaczanie czerwonej czerwieni S

1. DPSC, które uzyskano przez enzymatyczną dysocjację tkanki miazgi (znaną jako DPSC-ED) lub bezpośredni wzrost komórek z eksplantatów tkanki miazgi (DPSC-OG), hodowano przez 3 pasaże.
2. W Pasażu 3 komórki wysiewano na 6-dołkową płytkę przy 5,000 komórek / dołku.
3. Przy zbieganiu 60% pożywka zębopochodna została zastąpiona przez konwencjonalny PM. Trzy studnie pozostawiono jako kontrolę ujemną poprzez dodanie pożywki wzrostowej.
4. Podłoże zmieniać co 3 dni do 21 dnia.
5. W 21 dniu komórki przemyto PBS i utrwalono 1 ml / studzienkę 10% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Następnie odpipetowano paraformaldehyd, ostrożnie, a komórki przemyto 3 razy (za każdym razem 5-10 minut) destylowanym_H2O. (Uwaga: Unikaj naruszania monowarstwy).
7. Po umyciu dodano 1 ml/studzienkę Alizarin Red S na 20 minut w temperaturze pokojowej.
8. Komórki przemywano dejonizowanym_H2Ocztery razy (za każdym razem po 5 minut z delikatnym kołysaniem) w celu usunięcia dodatkowej czerwieni alizarynowej.
9. Dodano 1 ml/basenik_H2O, aby zapobiec wysuszeniu komórek.
10. Płytki założono do oględzin i/lub akwizycji obrazu.
11. W teście ilościowym czerwieni Alizaryny S, H₂O zastąpiono 1 ml 10% kwasu octowego do każdej studzienki na 6-dołkowej płytce i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
12. Następnie, monowarstwa komórek / studzienka została zeskrobana i zarówno kwas octowy, jak i komórki przeniesiono do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. (Uwaga: każda studzienka powinna być przeniesiona do oddzielnej probówki, tj. trzech studzienek testowych i trzech studzienek kontrolnych dla każdej grupy ED i OG).
13. Rurki były energicznie wirowane przez 30 sekund.
14. Podgrzewać do 85 °C przez 10 minut (Uwaga: aby uniknąć parowania, probówki zostały uszczelnione parafilmem).
15. Po podgrzaniu rurki przeniesiono do lodu na 5 minut (Uwaga: Probówek nie należy otwierać, dopóki nie ostygną).
16. Zawiesiny odwirowywano przy 20 000 x g przez 15 minut. Podczas wirowania opracowano wzorce czerwieni Alizarin.

Alizarin Red S zostały przygotowane przez pierwsze rozcieńczenie buforu rozcieńczającego i użyte do wykonania 2-krotnych seryjnych rozcieńczeń w oparciu o tabelę.

Wysoki zakres stężenia barwnika Niski zakres stężenia barwnika 2 mM 1 mM 500 μM 250 μM 125 μM 62,5 μM 31,3 μM 15,6 μM 7,8 μM 3,9 μM 1,9 μM 0,9 μM 0,4 μM pusty

16. Po odwirowaniu 1 ml supernatantu/probówki przeniesiono do nowych, oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
17. pH zneutralizowano ~375 μl 10% wodorotlenku amonu na probówkę. (Uwaga: pH powinno wynosić 4,1-4,5.)
18. 150 μl wzorca i próbek (w tym oddzielne testy i kontrole) dodano do nieprzezroczystej, przezroczystej dolnej płytki 96-dołkowej.
19. Absorbancję odczytano przy długości fali 405 nm, a wartości OD z próbek porównano z wykresem wzorcowym w celu dalszej analizy.

Results

1. DPSC, które uzyskano przez dysocjację enzymatyczną (DPSC-ED), pokazano tutaj w dniu 10, 15,18 (ryc. 1). Kolonie zaczęły się formować prawie 3 do 5 dni po izolacji.
2. Wyrośnięte DPSC (DPSC-OG) pokazano na rysunku 2 w dniach 5, 10, 13 i 18. Komórki podobne do fibroblastów zaczęły migrować z tkanki miazgi do kolby poprzez równoległe uporządkowanie przez prawie 5 dni po wysianiu.
3. DPSC w przejściu 3 przy użyciu obu metod pokazano na rysunku 3. Oba typy DPSC był...

Discussion

Protokół ten opisuje proces izolacji i charakterystyki hDPSC z miazgi zęba przy użyciu dwóch metod: dysocjacji enzymatycznej i bezpośredniego wzrostu komórek macierzystych z eksplantatów tkanki miazgi. Ponadto różnicowanie in vitro tych komórek w odontoblasty oceniano za pomocą ilościowego testu Alizarin Red S i QPCR.

Istniejące protokoły izolowania tkanki miazgi od ludzkiego zęba były używane za pomocą różnych narzędzi, takich jak szczypce (kleszcze kostne)⁹, igła do tępie...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM	GIBCO	11900-073
Kolagenaza typu I	Sigma-Aldrich	C0130-100MG
Dyspaza	GIBCO	17105-041
Penicylina/streptomycyna	GIBCO	15140-122
Amfoterycyna B	GIBCO	15290-018
Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca (FBS)	HyClone	SH30070.03
2-fosforan kwasu L-askorbinowego	Sigma	A8960-5G
L-glutamina	GIBCO	25030-024
Deksametazon	Sigma	D4902
β-Fosforan glicerolu sól disodowa hydrat, BioUltra	Sigma	G9422-100G
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	P5655
Zestaw do oznaczania osteogenezy	Mysz Millipore	PS01802031
Kontrola izotypu IgG2b-PE	BD pharmingen	50808088029
FITC mysz IgG2b kontrola izotypu	BD pharmingen	559532
mysz FITC IgG1 κ izotyp	BD pharmingen	11471471
mysz FITC/PE anty-ludzka CD34/CD45	BD pharmingen	341071
PE anty-ludzki CD146	BD pharmingen	550315
Mysz monoklonalna anty-ludzka CD90 / FITC	Daka	00034418
mysz PE anty-ludzka CD73	BD pharmingen	550257
Anti-h CD105 / Endoglin PE	BD pharmingen	FAB10971P
mysz PE anty-ludzka CD11b/Mac1	BD pharmingen 5553888
CD44 PE mysz anty	ludzka BD pharmingen	555479
Roztwór buforu fosforanowego (PBS)	GIBCO	003000
70-μ m sitko komórkowe	Falcon	352360
0,2 μ m filtr strzykawkowy	Millex-GV	SLGV033RB
25 cm2 kolba hodowlana	Sigma-Aldrich	Z707481
EQUIPMENT
BD FACSCalibur	BD	342975
multiskan spektrofotometr mikropłytkowy	Thermo scientific	51119200
Fleurcense Microscope	Oprogramowanie Olympus
Flow w wersji 2.3.1