Artykuł metodologiczny

F1FO Przygotowanie pęcherzyków ATPazy i technika wykonywania zapisów patch clamp błon pęcherzyków podmitochondrialnych

DOI:

10.3791/4394

⸱

4 maja 2013

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano metodę izolowania pęcherzyków submitochondrialnych wzbogaconych w kompleksy syntazy F1FO ATP z mózgu szczura. Pęcherzyki te pozwalają na badanie aktywności kompleksu ATPazy F1FO i jego modulacji za pomocą techniki rejestracji patch clamp.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są zaangażowane w wiele ważnych funkcji komórkowych, w tym metabolizm, przetrwanie1, rozwój i sygnalizację wapnia2. Dwie z najważniejszych funkcji mitochondriów są związane z wydajną produkcją ATP, waluty energetycznej komórki, poprzez fosforylację oksydacyjną i pośredniczenie sygnałów do zaprogramowanej śmierci komórki3.

Enzymem odpowiedzialnym za produkcję ATP jest syntaza F1FO-ATP, zwana również syntazą ATP4-5. W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono roli mitochondriów w apoptozie i martwiczej śmierci komórek. W apoptotycznej śmierci komórki białka z rodziny BCL-2, takie jak Bax, dostają się do zewnętrznej błony mitochondrialnej, oligomeryzują i przenikają błonę zewnętrzną, uwalniając czynniki proapoptotyczne do cytozolu6. W klasycznej martwiczej śmierci komórki, takiej jak ta spowodowana niedokrwieniem lub ekscytotoksycznością neuronów, duży, słabo regulowany wzrost wapnia w macierzy przyczynia się do otwarcia wewnętrznego pora błony, pora przejściowego przepuszczalności mitochondriów lub mPTP. Powoduje to depolaryzację błony wewnętrznej i powoduje przesunięcia osmotyczne, przyczyniając się do pęknięcia błony zewnętrznej, uwolnienia czynników proapoptotycznych i dysfunkcji metabolicznej. Wiele białek, w tym Bcl-xL7, oddziałuje z syntazą F1FO ATP, modulując jej funkcję. Bcl-xL oddziałuje bezpośrednio z podjednostką beta syntazy F1FO ATP, a ta interakcja zmniejsza przewodnictwo przecieku w kompleksie F1FOATPase, zwiększając transport netto H+ przez F1FO podczas aktywności ATPazy F1FO8, a tym samym zwiększając wydajność mitochondriów. Aby zbadać aktywność i modulację syntazy ATP, wyizolowaliśmy z pęcherzyków submitochondrialnych mózgu gryzoni (SMV) zawierających ATPazę F1FO. SMV zachowują strukturalną i funkcjonalną integralność ATPazy F1FO, jak pokazano w Alavian i wsp. Tutaj opisujemy metodę, którą z powodzeniem zastosowaliśmy do izolacji SMV z mózgu szczura i nakreślamy technikę zacisku krosowego do analizy aktywności kanału (przewodnictwa wycieku jonów) SMV.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja mitochondrialna mózgu (Na podstawie Brown M.R. et al.9)

  1. Uśmierc szczura przy użyciu metod zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC).
  2. Odetnij głowę zwierzęcia przez ścięcie, przetnij skórę i odsłoń czaszkę.
  3. Delikatnie otwórz czaszkę, tnąc nożyczkami lub rongeur. Usuń mózg.
  4. Mózg bez móżdżku należy drobno rozdrobnić w buforze izolacyjnym (patrz Tabela 1) i przenieść go do homogenizatora szklanko-teflonowego o pojemności 5 ml (patrz wykaz wyposażenia).
  5. Delikatnie homogenizować tkankę 10 razy (bez pęcherzyków), około 5 min.
  6. Odwirować próbkę o masie 1 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
  7. Zachowaj supernatant (mitochondria i synaptosomy) i wyrzuć osad (materiał jądrowy i szczątki komórkowe). Wirować w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu izolacyjnego. Rozbijanie synaptosomów za pomocą naczynia do rozbijania komórek (patrz lista sprzętu). Zastosuj ciśnienie 1,200 psi przez 10 minut, a następnie szybką dekompresję.
  9. Nałożyć mieszaninę na gradienty Ficoll (patrz Tabela 2), umieścić w wirniku SW-50.1 i odwirować w temperaturze 126 500 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ultrawirówce (patrz lista wyposażenia). Osad jest oczyszczonymi mitochondriami, warstwą między różnymi gęstościami Ficollu są niezakłócone synaptosomy.
  10. Przemyć osad przez odwirowanie w buforze izolacyjnym o stężeniu 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.

2. Izolacja pęcherzyków submitochondrialnych (SMV) (Na podstawie Chan et al.10)

  1. Ponownie zawiesić mitochondria w 200 μl buforu izolacyjnego w połączeniu z równą objętością 1% digitoniny i pozostawić na lodzie na 15 minut.
  2. Dodać więcej buforu izolacyjnego i odwirować w temperaturze 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej. Zrób to dwa razy.
  3. Zawiesić osad w 200 μl buforu izolacyjnego i dodać 2 μl 10% Lubrol PX (C12E9). Wymieszaj i pozostaw na lodzie na 15 minut.
  4. Nałożyć mieszaninę na bufor izolacyjny, umieścić w wirniku SW-50.1 i odwirować w temperaturze 182 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  5. Końcowe osady przepłukać przez odwirowanie w wirówce biurkowej w buforze izolacyjnym o stężeniu 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

3. Zapis elektrofizjologiczny

  1. Typowe stanowisko do elektrofizjologii składa się ze wzmacniacza, komputera PC wyposażonego w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A w połączeniu z oprogramowaniem pClamp10.0, manipulatorów, mikroskopu, stołu do izolacji drgań, klatki Faradaya.
  2. Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego są wkładane do ściągacza do mikropipet płomieniowo-brązowych model P-87. Program ściągacza do pipet jest zoptymalizowany pod kątem generowania pipet o rezystancji od 80 do 100 MΩ.
  3. SMV umieszcza się w fizjologicznym roztworze wewnątrzkomórkowym (ATP dodaje się w odpowiednim momencie podczas zapisu) (Tabela 3). Pipety z zaciskiem krosowym są napełniane tym samym roztworem (bez ATP). Nagrania są wykonywane poprzez formowanie giga-omowej uszczelki na SMV w temperaturze pokojowej. Pęcherzyki są wizualizowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym za pomocą mikroskopu odwróconego Nikon lub Zeiss.
  4. Potencjał membrany jest utrzymywany na napięciach w zakresie od -100 mV do +100 mV przez okres 10 sekund. Nagrania są filtrowane z częstotliwością 5 kHz za pomocą obwodów wzmacniacza. Poziom rozproszonego szumu elektrycznego lub niespecyficznego poniżej 1 pA jest pożądany dla udanego nagrania.
  5. Dane są analizowane za pomocą oprogramowania Clampfit 10.0, na przykład w celu określenia częstotliwości i amplitudy zdarzeń jednokanałowych. Zależność od napięcia jest określana przez wykreślenie zależności napięcia prądowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszy krok naszego protokołu pozwala na izolację oczyszczonych mitochondriów, jak pokazano na rysunku 1 za pomocą Western blot. Na rycinie 2 pokazano przykład zapisu plamy pęcherzyków submitochondrialnych pochodzących z mózgu. Korzystając z konfiguracji patch inside-out, demonstrujemy aktywność kanału modulowaną przez ATP. Zapis kontrolny (CTL) (po lewej) pokazuje aktywność kanału wielokonduktancyjnego ze średnią przewodnością szczytową 600 pS. który został natychmiast zmniejszony po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj metody umożliwiają wyizolowanie czystych mitochondriów na końcu kroku 1 i pęcherzyków submitochondrialnych (SMV) po kroku 2 z całego mózgu bez rozróżnienia fenotypów komórek. SMV wzmocnione tą metodą są zasadniczo wolne od zanieczyszczenia przez inne organelle subkomórkowe, jak pokazano na rysunku 1 i naszej poprzedniej pracy (Alavian KN i wsp.8) i zachowują swoją integralność strukturalną i funkcjonalną przed zamrożeniem. Po zamrożeniu i rozmrożeniu izolowane mitochond...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Młynek do tkanek Potter-Elvehjem z PTFEPestleKrackeler Scientific, Inc.1-7725T-5
Wirówka Eppendorf 5424 Eppendorf5424 000.410
4639 Naczynie do rozbijania komórekParr Instrument Company4639
FicollSigma-AldrichF5415
Probówki wirówkowe z poliwęglanuBeckman CoulterP20314
SW-50.1 Rotor Beckman Coulter
L8-70M UltrawirówkaBeckman Coulter
DigitoninaSigma-AldrichD5628
Lubrol PX (C12E9) Calbiochem205534
Axopatch 200B Axon Instruments Urządzenie
molekularneDigidata 1440A
ManipulatorInstrument Sutter Kapilara
szkła borokrzemianowegoŚwiat Instrumenty precyzyjne1308325
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet Model P-87Instrument
Urządzenie molekularne pClamp10.0 ze Sutter

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  2. Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
  3. Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
  4. Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
  5. Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
  6. Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
  7. Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
  8. Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
  9. Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  10. Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
  11. Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

p cherzyki submitochondrialneizolacja mitochondri wrozbijanie synaptosom wwirowanie w gradiencie g sto citraktowanie digitoninzestaw do elektrofizjologiiprzewodnictwo przecieku jonowegoaktywno syntazy ATP

Powiązane artykuły