Przygotowanie pęcherzyków F1FO ATPase oraz technika rejestracji patch-clamp błon pęcherzyków submitochondrialnych

Podsumowanie

Opisano metodę izolacji pęcherzyków submitochondrialnych wzbogaconych w kompleksy syntazy ATP F1FO z mózgu szczura. Pęcherzyki te umożliwiają badanie aktywności kompleksu ATP-azy F1FO oraz jego modulacji z wykorzystaniem techniki patch clamp.

Streszczenie

Mitochondria uczestniczą w wielu istotnych funkcjach komórkowych, w tym w metabolizmie, przeżywalności¹, rozwoju oraz sygnalizacji wapniowej². Dwie z najważniejszych funkcji mitochondriów wiążą się z wydajną produkcją ATP, będącego walutą energetyczną komórki, poprzez fosforylację oksydacyjną, a także z pośredniczeniem w przekazywaniu sygnałów do zaprogramowanej śmierci komórki³.

Enzymem odpowiedzialnym przede wszystkim za produkcję ATP jest syntaza F1FO-ATP, nazywana również syntazą ATP^4-5. W ostatnich latach znaczną uwagę poświęcono roli mitochondriów w apoptotycznej i nekrotycznej śmierci komórek. W przypadku śmierci apoptotycznej białka z rodziny BCL-2, takie jak Bax, wnikają w zewnętrzną błonę mitochondrialną, oligomeryzują i zwiększają jej przepuszczalność, uwalniając czynniki proapoptotyczne do cytozolu⁶. W klasycznej śmierci nekrotycznej, takiej jak wywołana przez niedokrwienie lub ekscytotoksyczność w neuronach, znaczny, słabo regulowany wzrost poziomu wapnia w macierzy przyczynia się do otwarcia poru w błonie wewnętrznej – mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności (mPTP). Prowadzi to do depolaryzacji błony wewnętrznej i wywołuje zmiany osmotyczne, co przyczynia się do pęknięcia błony zewnętrznej, uwalniania czynników proapoptotycznych i dysfunkcji metabolicznych. Wiele białek, w tym Bcl-xL⁷, oddziałuje na syntazę F1FO-ATP, modulując jej funkcję. Bcl-xL oddziałuje bezpośrednio z podjednostką beta syntazy F1FO-ATP, a ta interakcja zmniejsza konduktancję przecieku w kompleksie F1FO-ATPazy, zwiększając wypadkowy transport H+ przez F1FO podczas aktywności F1FO-ATPazy⁸, a tym samym zwiększając wydajność mitochondriów. Aby zbadać aktywność i modulację syntazy ATP, wyizolowaliśmy z mózgu gryzoni pęcherzyki submitochondrialne (SMVs) zawierające F1FO-ATPazę. SMVs zachowują integralność strukturalną i funkcjonalną F1FO-ATPazy, co wykazali Alavian et al. W niniejszej pracy opisujemy metodę, której z sukcesem używaliśmy do izolacji SMVs z mózgu szczura, oraz przedstawiamy technikę patch clamp służącą do analizy aktywności kanałów (konduktancji przecieku jonowego) w SMVs.

Protokół

1. Izolacja mitochondriów z mózgu (Adaptacja na podstawie Brown M.R. et al.⁹)

1. Uśmierć szczura metodami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
2. Odciąć głowę zwierzęcia poprzez dekapitację, naciąć skórę i odsłonić czaszkę.
3. Ostrożnie otworzyć czaszkę, przecinając ją nożyczkami lub kleszczami kostnymi. Wyjąć mózg.
4. Drobno posiekać mózg bez móżdżku w buforze izolacyjnym (patrz Tabela 1) i przenieść go do szklanego lub teflonowego homogenizatora o pojemności 5 ml (patrz lista sprzętu).
5. Ostrożnie homogenizować tkankę 10 razy (bez tworzenia pęcherzyków powietrza), przez około 5 min.
6. Wirować próbkę przy 1 500 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
7. Zabrać nadnadkład (mitochondria i synaptosomy) i odrzucić osad (materiał jądrowy i szczątki komórkowe). Wirować przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
8. Odrzucić nadnadkład i resuspenderć osad w 500 μl buforu izolacyjnego. Rozbić synaptosomy za pomocą naczynia do rozbijania komórek (patrz lista sprzętu). Zastosować ciśnienie 1 200 psi przez 10 min, a następnie przeprowadzić szybką dekompresję.
9. Nanieść mieszaninę na gradienty Ficoll (patrz Tabela 2), umieścić w rotorze SW-50.1 i wirować przy 126 500 × g przez 20 min w temperaturze 4 °C w ultrawirówce (patrz lista sprzętu). Osad stanowi oczyszczone mitochondria, a warstwa pomiędzy różnymi gęstościami Ficollu to nierozbite synaptosomy.
10. Przemyć osad poprzez wirowanie w buforze izolacyjnym przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.

2. Izolacja pęcherzyków submitochondrialnych (SMV) (Adaptacja z Chan et al.¹⁰)

1. Ponownie zawiesić mitochondria w 200 μl buforu do izolacji (Isolation Buffer) połączonego z równą objętością 1% digitoniny i pozostawić na lodzie na 15 min.
2. Dodać więcej buforu do izolacji i odwirować przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej. Powtórzyć tę czynność dwukrotnie.
3. Ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do izolacji i dodać 2 μl 10% Lubrol PX (C12E9). Wymieszać i pozostawić na lodzie na 15 min.
4. Nanieść mieszaninę warstwowo na bufor do izolacji, umieścić w rotorze SW-50.1 i odwirować przy 182 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 h.
5. Przemyć końcowy osad, odwirując go w wirówce stołowej w buforze do izolacji przy 16 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.

3. Rejestracja elektrofizjologiczna

1. Typowy zestaw do elektrofizjologii obejmuje wzmacniacz, komputer PC wyposażony w interfejs przetwornika analogowo-cyfrowego Digidata 1440A wraz z oprogramowaniem pClamp10.0, manipulatory, mikroskop, stół wibroizolacyjny oraz klatkę Faradaya.
2. Kapilary z borokrzemianowego szkła umieszcza się w wyciągaczu mikropipet Flaming/Brown Model P-87. Program wyciągacza jest zoptymalizowany tak, aby generować pipety o oporności od 80 do 100 MΩ.
3. Pęcherzyki SMV umieszcza się w fizjologicznym roztworze wewnątrzkomórkowym (ATP dodaje się w odpowiednim momencie podczas rejestracji) (Tabela 3). Pipety do techniki patch clamp napełnia się tym samym roztworem (bez ATP). Rejestrację wykonuje się poprzez utworzenie uszczelnienia gigaomowego na SMV w temperaturze pokojowej. Pęcherzyki wizualizuje się za pomocą mikroskopii kontrastowej w odwróconym mikroskopie Nikon lub Zeiss.
4. Potencjał błony utrzymuje się na poziomie od -100 mV do +100 mV przez okresy 10 sekund. Rejestracje są filtrowane przy 5 kHz za pomocą układów wzmacniacza. Dla pomyślnej rejestracji pożądany jest poziom zakłóceń elektrycznych lub szumu niespecyficznego poniżej 1 pA.
5. Dane analizuje się za pomocą oprogramowania Clampfit 10.0, na przykład w celu określenia częstotliwości i amplitudy zdarzeń pojedynczego kanału. Zależność od napięcia określa się poprzez wykreślenie zależności prądowo-napięciowej.

Wyniki

Pierwszy krok naszego protokołu pozwala na izolację oczyszczonych mitochondriów, co zostało wykazane za pomocą analizy Western blot na Rysunku 1. Na Rysunku 2 przedstawiono przykład rejestracji prądów z plastra pęcherzyków submitochondrialnych pochodzących z mózgu. Wykorzystując konfigurację plastra „inside-out”, wykazujemy aktywność kanałów modulowaną przez ATP. Rejestracja kontrolna (CTL) (po lewej) pokazuje aktywność kanałów o wielokrotnej przewodności ze średnią przewodnością szczyto...

Dyskusja

Opisane tutaj metody umożliwiają izolację czystych mitochondriów po zakończeniu kroku 1 oraz pęcherzyków submitochondrialnych (SMV) po kroku 2 z całego mózgu, bez rozróżnienia fenotypów komórkowych. SMV oczyszczone tą metodą są w zasadzie wolne od zanieczyszczeń innymi organellami subkomórkowymi, co pokazano na Rysunku 1 oraz w naszych poprzednich pracach (Alavian KN et al.⁸), i zachowują swoją integralność strukturalną i funkcjonalną przed zamrożeniem. Po zamrożeniu i rozmrożeniu izo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Homogenizator tkanek Potter-Elvehjem z tłuczkiem z PTFE	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Wirówka Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	5424 000.410
Naczynie do rozbijania komórek 4639	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Policarbonatowe probówki do wirowania	Beckman Coulter	P20314
Rotor SW-50.1	Beckman Coulter
Ultrawirówka L8-70M	Beckman Coulter
Digitonina	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
Manipulator	Sutter Instrument
Kapilara z borokrzemianu	World Precision Instruments	1308325
Wytwornica mikropipet Flaming/Brown Model P-87	Sutter Instrument