Cytometria masowa: Protokół codziennego dostrajania i uruchamiania próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Podsumowanie

Opisane są kroki niezbędne do codziennego dostrajania i optymalizacji działania cytometru masowego CyTOF. Omówiono uwagi dotyczące optymalnego przygotowania próbki i natężenia przepływu

Streszczenie

W ostatnich latach szybka analiza pojedynczych komórek była powszechnie przeprowadzana przy użyciu cytometrii przepływowej i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał. Jednak kwestia nakładania się widm emisji fluoroforów ograniczyła liczbę jednoczesnych sond. W przeciwieństwie do tego, nowy cytometr masowy CyTOF firmy DVS Sciences łączy płynny system wprowadzania pojedynczych komórek z ICP-MS. ¹ Zamiast fluoroforów, polimery chelatujące zawierające wysoko wzbogacone izotopy metali są sprzężone z przeciwciałami lub innymi specyficznymi sondami. ^2-5 Ze względu na czystość metalu i rozdzielczość masową cytometru masowego, nie ma "nakładania się widma" sąsiednich izotopów, a zatem nie ma potrzeby stosowania matryc kompensacyjnych. Dodatkowo, ze względu na zastosowanie metali lantanowców, nie ma tła biologicznego, a zatem nie ma odpowiednika autofluorescencji. Przy oknie masowym obejmującym masę atomową 103-203 teoretycznie można rozróżnić do 100 etykiet jednocześnie. Obecnie dostępnych jest ponad 35 kanałów wykorzystujących odczynniki chelatujące dostępne w DVS Sciences, co pozwala na bezprecedensową analizę profilu immunologicznego próbek. ^6-7

Wady cytometrii masowej obejmują ścisłe wymagania dotyczące oddzielnego izotopu metalu na sondę (brak odpowiednika rozproszenia do przodu lub bocznego) oraz fakt, że jest to technika destrukcyjna (brak możliwości sortowania odzysku). Obecna konfiguracja cytometru masowego ma również szybkość transmisji komórek wynoszącą zaledwie ~25%, co wymaga większej liczby komórek wejściowych.

Optymalna dzienna wydajność cytometru masowego wymaga kilku kroków. Podstawowym celem optymalizacji jest maksymalizacja mierzonej intensywności sygnału pożądanych izotopów metali (M) przy jednoczesnej minimalizacji powstawania tlenków (M+16), które zmniejszą natężenie sygnału M i zakłócą dowolny pożądany sygnał przy M+16. Pierwszym krokiem jest rozgrzanie maszyny, tak aby powstała gorąca, stabilna plazma ICP. Po drugie, ustawienia aktualnego i uzupełniającego natężenia przepływu gazu muszą być codziennie optymalizowane. Podczas pobierania próbki maksymalna częstotliwość zdarzeń w ogniwie jest ograniczona przez wydajność detektora i szybkość przetwarzania do 1000 komórek/sek. Jednak w zależności od jakości próbki, wolniejsza szybkość zdarzeń ogniw (300-500 komórek/s) jest zwykle pożądana, aby umożliwić lepszą rozdzielczość między zdarzeniami komórkowymi, a tym samym zmaksymalizować nienaruszone podkoszulki w stosunku do dubletów i szczątków. Wreszcie, odpowiednie czyszczenie maszyny pod koniec dnia pomaga zminimalizować sygnał tła spowodowany wolnym metalem.

Protokół

Wszystkie próbki komórek dla CyTOF muszą być utrwalone i przepuszczalne. Umożliwia to większe przenikanie interkalatora DNA zawierającego iryd, a także zapobiega lizie komórek podczas etapów płukania wodą MilliQ i ponownego zawieszenia bezpośrednio przed wstrzyknięciem do cytometru masowego.

1. Uruchomienie cytometru masowego

1. Otwórz oprogramowanie CyTOF. Wybierz opcję Instrument Setup (Ustawienia instrumentu). Na karcie Klatka na karty przejdź do prawego dolnego rogu i kliknij przycisk "ON" Grzejnik. Włączyć grzałkę co najmniej 15 minut przed żądanym czasem, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu, aby płaszcz komory natryskowej osiągnął temperaturę 200 °C.
2. Wymienić białą strzykawkę Norm-Ject 3 ml w pompie strzykawkowej na świeżą strzykawkę wypełnioną wodą MilliQ.
3. Nebulizator czyszczący. Przepłucz nebulizator wstecznie za pomocą strzykawki i rurki, aby przeciągnąć 5% citranox 2-3 razy zarówno przez mniejszy port wprowadzania cieczy, jak i większy port wprowadzania gazu. Powtórzyć płukanie wsteczne wodą MilliQ, aby usunąć resztki citranoxu.
4. Sprawdź, czy kontrolki na przednim panelu CyTOF świecą się, jak pokazano na rysunku 1.

Rysunek 1. Panel CyTOF świeci się przed uruchomieniem.

5. Otwórz zawór zbiornika gazu argonowego. Powinno to spowodować włączenie się kontrolki "ARGON" z przodu.
6. Przymocuj nebulizator do wlotu gazu uzupełniającego. Odkręć złącze rurki gazowej do uzupełniania i zdejmij gumowy o-ring oraz biały stożkowy plastikowy element. Zwróć uwagę na szerszą "zwrotnicę" na trzpieniu portu wprowadzania gazu nebulizatora. Umieść złącze w porcie doprowadzania gazu. Umieść o-ring na końcu portu gazowego i wciśnij o-ring przez szerszą część trzpienia portu. Umieść biały stożkowy plastikowy element na górze z wąskim końcem skierowanym do zewnątrz i przykręć rurkę gazową do uzupełniania.
7. Podłącz nebulizator do rurki wprowadzającej płyn. Ostrożnie włóż małą rurkę do otworu na końcu nebulizatora. Będą dwa ograniczniki, podobne w odczuciu do ograniczników na mikropipetatorze. Najpierw naciśnij, aż napotkasz opór światła; Koniec małej rurki powinien znajdować się na końcu prostej części szkła. Po drugie, dociśnij mocniej, aby wcisnąć koniec prostej części szkła głębiej w złączkę i dokręć złączkę śrubową, aby uszczelnić. Włóż koniec nebulizatora do białego otworu w płaszczu grzewczym.
8. Na karcie RFG Controller (Kontroler RFG) w oknie Instrument Setup (Ustawienia przyrządu) naciśnij przycisk "Start Plasma" (Uruchom plazmę). Ponieważ nebulizator jest już włożony, naciśnij "OK". Oprogramowanie włączy agregat chłodniczy, rozpocznie przepływ gazu i zapali plazmę. Napięcie detektora wzrośnie. Po zakończeniu pojawi się wyskakujące okienko z informacją "Sekwencja startowa plazmy zakończyła się pomyślnie"; naciśnij "OK". Nowe światła powinny być włączone na panelu przednim (Rysunek 2).

Rysunek 2. Panel CyTOF zapala się po zapaleniu plazmy i pomyślnym zakończeniu rozruchu.

9. Włączanie pompy strzykawkowej. W prawym górnym rogu naciśnij zielony przycisk "play", aby uruchomić pompę strzykawkową i rozpocząć przepływanie płynu przez rurkę i rozpylanie płynu z nebulizatora. Domyślne ustawienia strzykawki to 3 ml wody. Aby próbka mogła przepływać przez pętlę próbki, pompa strzykawkowa musi być okresowo wymieniana, gdy skończy się w niej woda. W górnej części ekranu znajduje się licznik wskazujący, ile płynu wypłynęło z pompy strzykawkowej. Pompa strzykawkowa zatrzyma się, gdy licznik osiągnie wartość "3.000" lub tłok uderzy w koniec strzykawki. Podczas napełniania strzykawki należy nacisnąć przycisk "stop", a nie niebieski przycisk "pauza", aby zresetować licznik.

2. Codzienna kalibracja cytometru masowego

1. Cytometr masowy będzie potrzebował około 20 minut, aby uzyskać gorącą, stabilną plazmę przed kalibracją. Celem etapów strojenia jest maksymalizacja pożądanego sygnału Tm169 lub Tb159 przy zachowaniu "Gd155" (tlenek; La139+O16) sygnał poniżej 3% wyższej wartości. Kliknij przycisk Ustawienia akwizycji, aby otworzyć okno Ustawienia akwizycji danych. Na karcie Anality kliknij układ okresowy pierwiastków, aby otworzyć panel wyboru izotopów. Wybierz izotopy w roztworze strojenia DVS Sciences wymienionym w instrukcji, a następnie kliknij "zapisz".
2. Kliknij przycisk Izotopy na odczyt, aby otworzyć okno Masy/masy na odczyt. Wybierz "Liczba impulsów" i przeskaluj oś y, wprowadzając nową liczbę i naciskając "enter".
3. Napełnij zieloną strzykawkę Norm-Ject o pojemności 1 ml roztworem strojenia. Ustaw selektor portu próbki w pozycji "LOAD", wstrzyknij 450 μl roztworu strojeniowego, a następnie ustaw selektor w pozycji "INJECT". Na karcie Wzorcowanie masy w oknie Ustawienia akwizycji danych naciśnij "Uruchom", aby monitorować, przez które masy przepływają. Lewa strona okna to mniejsza masa, natomiast prawa strona to większa masa. Uwaga: sygnały będą już słyszalne w rejonie TOF 9400-9800 ze względu na izotopy ksenonu w argonie (ilustracja 3). Poczekaj, aż izotopy roztworu strojeniowego zaczną pojawiać się jako smugi na tym wyświetlaczu (Rysunek 4).

Rysunek 3. Okno zakładki kalibracji masy, pokazujące poziomy tła dla różnych izotopów po przepłukaniu roztworem myjącym i wodą. Obszar wokół TOF 9400-9800 odpowiada izotopom ksenonu w argonie i powinien być zawsze obecny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Okno zakładki kalibracji masy, pokazujące pionowe smugi dla różnych izotopów w roztworze strojenia DVS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

4. Wróć do okna Mszy św. na czytanie i naciśnij zielony przycisk "Odtwórz" w lewym górnym rogu. Każdy izotop wybrany w kroku 2.1 jest reprezentowany przez linię w innym kolorze. Domyślna oś x to "Czas", w sekundach. Monitoruj poziomy różnych izotopów, aż osiągną stabilną wartość.
5. Strojenie prądu. Na karcie Parametr w oknie Ustawienia akwizycji danych wybierz "Bieżące" z menu rozwijanego. Niech start=0, koniec=10, wartość kroku = 0,5, czas ustalania = 200 i naciśnij "zapisz". Kliknij ponownie w oknie Mszy mas na czytanie i naciśnij przycisk odtwarzania. Oś x jest teraz "Bieżąca". Zanotować, gdzie dochodzi do szczytu sygnałów izotopów (rysunek 5) i zanotować. Na karcie DAC Channels Setup (Ustawienia kanałów DAC) w oknie Instrument Setup (Ustawienia instrumentu) przewiń w dół do pozycji "Current" (Bieżący) i wprowadź tę nową wartość. Naciśnij "Ustaw rzeczywistą wartość bieżącą", a następnie "zapisz".

Rysunek 5. Aktualny profil strojenia.

6. Dostrajanie gazu uzupełniającego. Zmień menu rozwijane na "Gaz uzupełniający". Niech początek = 0,55, koniec = 0,95, wartość kroku = 0,05, czas ustalania = 200. Naciśnij Zapisz. Wróć do okna Mszy św. na czytanie i naciśnij przycisk odtwarzania. Oś x to teraz natężenie przepływu "gazu uzupełniającego". Zapisz, gdzie sygnały izotopów osiągają szczyt. Obserwuj szybki wzrost sygnału "Gd155" pod koniec (Rysunek 6). Wróć do zakładki DAC Channels Setup (Ustawienia kanałów DAC), przewiń w dół do sekcji "Uzupełnianie gazu" i wprowadź nową wartość. Naciśnij "Ustaw rzeczywistą wartość bieżącą", a następnie "zapisz".

Rysunek 6. Profil tuningu gazu uzupełniającego.

7. Zapis stosunku pożądanego izotopu do tlenku. Wykonać drugą porcję 450 μl roztworu strojeniowego. Na karcie Parametr wybierz "Czas" z menu rozwijanego, niech start=0, koniec=10, wartość kroku = 1, czas ustalenia = 200. Naciśnij "zapisz". Naciśnij "odtwórz" w oknie Mszy Świętych na czytanie. Po ustabilizowaniu się linii (Rysunek 7) użyj kursora, aby odczytać wartość w lewym górnym polu dla Tm169 lub Tb159 (wyższa wartość), a także wartość "Gd155" (<3% wyższej wartości). Wartości te można również zapisać w pliku strojenia do wykorzystania w przyszłości.

Rysunek 7. Pomiar natężenia sygnału roztworu strojeniowego po optymalizacji prądu i gazu uzupełniającego.

8. Czyszczenie pętli próbki. Wstrzyknąć 3 ml wody MilliQ przez pętlę próbki, a następnie 500 μl roztworu do płukania DVS. Monitoruj postęp czyszczenia, naciskając przycisk "uruchom" w zakładce Wzorcowanie masy. Myć do momentu, aż intensywność smug (Rysunek 4) zacznie się zmniejszać, a następnie dodać 3 ml wody MilliQ i monitorować, aż do poziomu tła (Rysunek 3).

3. Uruchamianie próbek

1. Otwórz okno Akwizycja. Ustawienia domyślne: Do Analysis = On-The-Fly, Signal to Analyze = Dual, Dual Count Calibration = Data. Wybrana jest opcja Redukcja szumów. Każdy z nich może zostać zmieniony w razie potrzeby. Wprowadź nazwę pliku. Wszystkie pliki MUSZĄ być zapisane na dysku E://.
2. Ustawianie opóźnień akwizycji. Wystąpi niewielkie opóźnienie w rejestrowaniu zdarzeń komórkowych wynoszące około 30 sekund ze względu na długość rurki między pętlą próbki a nebulizatorem. W związku z tym suma "Opóźnienia nabycia" i "Opóźnienia stabilności detektora" powinna wynosić co najmniej 30 sekund. Opóźnienie stabilności detektora powinno wynosić co najmniej 20 sekund.
3. Ustawianie czasu zbierania danych. "Czas akwizycji" to liczba sekund, w których chcesz uruchomić próbkę. Wypełnienie całej pętli próbki o objętości 450 μl wymagałoby 600 sekund. Sugeruje się dodanie 50-100 sekund do końca czasu pracy, aby zminimalizować przenoszenie próbki.
4. Ponowne zawieszenie próbki. Aby zminimalizować gromadzenie się soli w maszynie, zaleca się wykonanie co najmniej dwóch płukań w wodzie MilliQ pod koniec barwienia komórek, a następnie ponowne zawieszenie w wodzie MilliQ. Objętość wody MilliQ użytej do ponownego zawieszenia osadu komórkowego będzie się różnić w zależności od liczby komórek, z którymi zacząłeś, i odzyskiwania komórek po całej procedurze barwienia. Dobrym punktem wyjścia jest 10⁶ (początkowych) komórek/ml. Po ponownym zawieszeniu przefiltrować przez sitko w celu usunięcia kruszyw.
5. Rozpoczynanie przykładowego przebiegu. Wprowadź nową nazwę pliku dla bieżącej próbki. Przełącz zawór pętli próbki na "LOAD", wstrzyknij próbkę, przełącz z powrotem na "INJECT", a następnie naciśnij "Uruchom" w oknie Akwizycji.
6. Rejestrowanie zdarzeń w komórkach. Komórki będą reprezentowane w oknie migawki jako poziome zbiory znaczników w każdym pionowym kanale izotopu/znacznika (Rysunek 8). Podczas gdy cytometr masowy może zarejestrować 1000 komórek / s, lepsza rozdzielczość między zdarzeniami komórkowymi jest zwykle uzyskiwana przy 300-500 komórkach / s. Odpowiada to średnio ~1 odświeżeniu komórki/ekranu. Może upłynąć do 30 sekund, zanim licznik zdarzeń w komórce zacznie się zwiększać. Dzieje się tak dzięki przetwarzaniu danych "w locie"; Żadne informacje o zdarzeniach w komórce nie zostaną utracone.

Rysunek 8. Okno akwizycji podczas uruchamiania próbki, pokazujące poziome rzędy plamek odpowiadających elementom powiązanym z trzema oddzielnymi zdarzeniami komórki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

7. Jakość zdarzeń komórkowych. Zwróć uwagę na wszelkie smugi tła w każdym kanale izotopowym, a także częstotliwość zdarzeń w komórce. Cytometr masowy rozpoznaje "zdarzenie komórkowe" jako pewien wzrost sygnału powyżej tła, więc sygnał tła z wolnego metalu lub niezwiązanego przeciwciała może zmienić liczbę "zdarzenia komórkowego". Dodatkowo, uruchamianie komórek w zbyt wysokim stężeniu może powodować zwiększoną liczbę zdarzeń dubletowych. Tło można zmniejszyć przez dodatkowe płukanie lub większe rozcieńczenie komórek. Dublety można zminimalizować poprzez większe rozcieńczenie komórek, kosztem wydłużenia czasu pracy.
8. Zakończenie akwizycji danych próbki. Po osiągnięciu czasu akwizycji zbieranie danych zostanie zakończone. Nastąpi pewne opóźnienie, zanim pojawi się wyskakujące okienko z przyciskiem "OK"; ponownie, jest to spowodowane przetwarzaniem danych "w locie". Pobieranie próbki można również zatrzymać przedwcześnie, naciskając przycisk "Stop". W takim przypadku wszystkie już zarejestrowane zdarzenia w komórkach zostaną zliczone i przetworzone na pliki wyjściowe.
9. Wstrzyknięcie co najmniej 500 μl wody MilliQ między każdą próbką również pomaga zminimalizować przenoszenie próbki.

4. Czyszczenie maszyny po użyciu

1. Roztwór do mycia. Po uruchomieniu próbki końcowej i przepłukaniu pętli próbki wodą, wstrzyknąć 450 μl roztworu płuczącego do pętli próbki. Monitoruj uwalnianie wolnego metalu na karcie Wzorcowanie masy w oknie Ustawienia akwizycji danych, jak w kroku 2.8 (Rysunek 9). Gdy sygnał wolnego metalu zacznie się zmniejszać, przepłukać 3 ml wody MilliQ i monitorować, aż do osiągnięcia poziomu tła.

Rysunek 9. Okno zakładki kalibracji masy, podczas czyszczenia po uruchomieniu roztworem DVS Wash. Pionowe smugi w regionie TOF 9800-11000 to izotopy znakowane przeciwciałami, które są usuwane z maszyny. Pionowe smugi wokół TOF 11500 odpowiadają dwóm izotopom interkalatora IR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

5. Wyłączanie maszyny

1. Na karcie RFG Controller (Kontroler RFG) w oknie Instrument Setup (Ustawienia przyrządu) wybierz opcję "Stop Plasma" (Zatrzymaj plazmę). Po zakończeniu procedury pojawi się wyskakujące okienko z prośbą o wyjęcie nebulizatora. Naciśnij "OK". W zakładce Card Cage (Klatka na kartę) wyłącz grzałkę. Zamknij zawór na dopływie argonu.
2. Usunięcie nebulizatora. Wyjmij nebulizator z komory rozpylania, ostrożnie pociągając do tyłu. Odkręć sample rurka wprowadzająca z kroku 1.6 i odłóż na bok. Odkręć przyłącze doprowadzania gazu uzupełniającego, aby lekko je poluzować, a następnie zdejmij nebulizator. Pozostawienie złączki skręconej ze sobą zmniejszy ryzyko zgubienia czarnego gumowego o-ringu i białego stożkowego plastikowego elementu.
3. Nebulizator czyszczący. Przepłukać wstecznie oba porty nebulizatora 5% citranoxem za pomocą strzykawki i rurki, jak w kroku 1.3. Przechowywać pod przykryciem w 5% citranox do następnego użycia.

Wyniki

Przestrzeganie powyższego protokołu powinno osiągnąć cztery rzeczy. Po pierwsze, zapewnienie odpowiedniego czasu na rozgrzanie cytometru masowego wytworzy gorącą, stabilną plazmę niezbędną do uzyskania optymalnego sygnału i minimalnego tworzenia się tlenków. Po drugie, odpowiednie umycie cytometru masowego wodą MilliQ i roztworem DVS Wash (rysunek 9) pomoże zmniejszyć poziom adsorpcji metalu na rurkach i innych częściach urządzenia, pomagając zmniejszyć tło podczas pobierania próbki (rysunek 8

Dyskusja

W ciągu ostatnich kilku dekad fluorescencyjna cytometria przepływowa była metodą konia roboczego do analizy pojedynczych komórek, zarówno pod względem ekspresji powierzchniowej, jak i testów funkcjonalnych. Jednak problemy z nakładaniem się widmowym barwników fluorescencyjnych ograniczyły liczbę jednoczesnych markerów. Chociaż opisano eksperymenty z użyciem więcej niż 12 jednoczesnych markerów, ilość niezbędnej kompensacji sprawia, że jest to technicznie trudne.

Zamiast fluoroforów, cytometria...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytometr masowy CyTOF	DVS Sciences
Roztwór do płukania	DVS Sciences	201071	0,05% kwasu fluorowodorowego w wodzie
Roztwór strojeniowy	DVS Sciences	201072	0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, śladowy kwas azotowy
Kulki polistyrenowe zawierające Eu	DVS Sciences	201073	Zawiera naturalne izotopy Eu; kulki dostarczane w ilości około 1 milion/ml
Kulki polistyrenowe zawierające wiele lantanowców (La/Pr/Tb/Tm/Lu)DVS		Sciences Jeszcze niedostępne na rynku	Zawiera naturalne izotopy wymienionych lantanowców
Kwas azotowy (skoncentrowany)	Fisher Scientific	A467-500	Optima śladowy metal czysty klasy ICP-MS
Polistyrenowa probówka okrągłodenna z nasadką sitkową-5 ml	BD	352235	służy do filtrowania próbek komórek przed wstrzyknięciem
Strzykawka tuberkulinowa Norm-Ject-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	bez silikonu, bez lateksu
Strzykawka Norm-Ject-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	bez silikonu, bez lateksu
Woda			18 MΩ czysta woda; nie może być przechowywana w szklanych lub plastikowych butelkach, które zostały umyte dostępnym w handlu detergentem (ze względu na ich wysoką zawartość obecnych poziomów baru).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	kwaśny detergent
Gaz argonowy	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% Ultra-wysoka czystość