Cytometria masowa: Protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Podsumowanie

Opisano kroki niezbędne do codziennego strojenia i optymalizacji wydajności cytometru masowego CyTOF. Omówiono uwagi dotyczące optymalnego przygotowania próbek oraz szybkości przepływu

Streszczenie

W ostatnich latach szybka analiza pojedynczych komórek była powszechnie przeprowadzana z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Jednak problem nakładania się widm emisji fluoroforów ograniczył liczbę sond możliwych do jednoczesnego użycia. W przeciwieństwie do tego, nowy cytometr masowy CyTOF firmy DVS Sciences łączy system wprowadzania pojedynczych komórek w fazie ciekłej z ICP-MS.¹ Zamiast fluoroforów, do przeciwciał lub innych specyficznych sond dołączane są polimery chelatujące zawierające silnie wzbogacone izotopy metali.^2-5 Dzięki czystości metali i rozdzielczości masowej cytometru masowego nie występuje „nakładanie się widm” sąsiednich izotopów, a co za tym idzie, nie ma potrzeby stosowania macierzy kompensacyjnych. Ponadto, dzięki zastosowaniu lantanowców, nie występuje tło biologiczne, a zatem nie istnieje odpowiednik autofluorescencji. Przy oknie masowym obejmującym masę atomową 103-203 teoretycznie można by jednocześnie rozróżnić do 100 znaczników. Obecnie, dzięki odczynnikom chelatującym dostępnym w ofercie DVS Sciences, dostępnych jest ponad 35 kanałów, co pozwala na bezprecedensową analizę profilu immunologicznego próbek.^6-7

Wady cytometrii masowej obejmują rygorystyczny wymóg stosowania oddzielnego izotopu metalu dla każdej sondy (brak odpowiedników rozproszenia przedniego lub bocznego) oraz fakt, że jest to technika destrukcyjna (brak możliwości odzyskania posortowanych komórek). Obecna konfiguracja cytometru masowego charakteryzuje się również współczynnikiem transmisji komórek na poziomie zaledwie ~25%, co wymaga zastosowania większej liczby komórek wejściowych.

Optymalne codzienne działanie cytometru masowego wymaga wykonania kilku kroków. Podstawowym celem optymalizacji jest maksymalizacja mierzonej intensywności sygnału pożądanych izotopów metali (M) przy jednoczesnym zminimalizowaniu tworzenia się tlenków (M+16), które obniżają intensywność sygnału M i zakłócają każdy pożądany sygnał przy M+16. Pierwszym krokiem jest rozgrzanie urządzenia, aby utworzyła się gorąca, stabilna plazma ICP. Po drugie, ustawienia prądu oraz szybkości przepływu gazu pomocniczego muszą być optymalizowane codziennie. Podczas zbierania próbek maksymalna częstotliwość zdarzeń komórkowych jest ograniczona przez wydajność detektora i szybkość przetwarzania do 1000 cells/sec. Jednakże, w zależności od jakości próbki, zazwyczaj pożądana jest niższa częstotliwość zdarzeń komórkowych (300-500 cells/sec), aby zapewnić lepszą rozdzielczość między zdarzeniami komórkowymi, a tym samym zmaksymalizować liczbę nienaruszonych singletów w stosunku do dubletów i debris. Na koniec, odpowiednie czyszczenie urządzenia na koniec dnia pomaga zminimalizować sygnał tła wynikający z obecności wolnych metali.

Protokół

Wszystkie próbki komórek do analizy CyTOF muszą zostać utrwalone i permeabilizowane. Umożliwia to lepszą penetrację interkalatora DNA zawierającego iryd oraz zapobiega lizie komórek podczas etapów płukania wodą MilliQ i resuspensji bezpośrednio przed wstrzyknięciem do cytometru masowego.

1. Uruchamianie cytometru masowego

1. Uruchom program oprogramowania CyTOF. Wybierz Instrument Setup. W karcie Card Cage przejdź do prawego dolnego rogu i kliknij przycisk Heater „ON”. Włącz grzałkę co najmniej 15 min przed planowanym rozpoczęciem pracy, aby zapewnić odpowiedni czas na osiągnięcie przez płaszcz komory rozpylnej temperatury 200 °C.
2. Zastąp białą strzykawkę Norm-Ject 3 ml w pompie strzykawkowej nową strzykawką wypełnioną wodą MilliQ.
3. Czyszczenie nebulizatora. Przepłucz nebulizator w kierunku odwrotnym, używając strzykawki i prowadnicy do przeciągnięcia 5% citranox 2-3 razy zarówno przez mniejszy port doprowadzania cieczy, jak i większy port doprowadzania gazu. Powtórz płukanie wsteczne wodą MilliQ, aby usunąć pozostałości citranox.
4. Sprawdź, czy kontrolki na przednim panelu CyTOF świecą się zgodnie z Rysunkiem 1.

Rysunek 1. Podświetlenie panelu CyTOF przed uruchomieniem.

5. Otwórz zawór butli z argonem. Powinno to spowodować zapalenie się kontrolki „ARGON” na przednim panelu.
6. Podłącz nebulizator do wlotu gazu pomocniczego. Odkręć złącze rurki gazu pomocniczego, a następnie wyjmij czarną gumową uszczelkę o-ring oraz biały stożkowy element plastikowy. Zwróć uwagę na szerszy „wyrostek” na trzpieniu portu doprowadzania gazu w nebulizatorze. Umieść złącze na porcie doprowadzania gazu. Nałóż czarną uszczelkę o-ring na koniec portu gazowego i nasuń ją za szerszą część trzpienia portu. Na górze umieść biały stożkowy element plastikowy wąskim końcem na zewnątrz i przykręć go do rurki gazu pomocniczego.
7. Podłącz nebulizator do rurki doprowadzającej ciecz. Ostrożnie włóż cienką rurkę do otworu na końcu nebulizatora. Odczuwalne będą dwa opory, podobne do tych w mikropipecie. Po pierwsze, dociskaj do momentu poczucia lekkiego oporu; koniec cienkiej rurki powinien znajdować się na końcu prostej sekcji szklanej. Po drugie, dociśnij mocniej, aby wprowadzić koniec prostej sekcji szklanej głębiej do złącza, a następnie dokręć śrubę mocującą, aby zapewnić szczelność. Włóż koniec nebulizatora do białego otworu w płaszczu grzejnym.
8. W zakładce RFG Controller okna Instrument Setup naciśnij „Start Plasma”. Ponieważ nebulizator jest już włożony, naciśnij „OK”. Oprogramowanie uruchomi chłodziarkę, rozpocznie przepływ gazu i wzbudzi plazmę. Napięcie detektora zacznie rosnąć. Po zakończeniu procesu pojawi się okno z komunikatem „Plasma start-up sequence has finished successfully”; naciśnij „OK”. Na panelu przednim powinny zapalić się nowe kontrolki (Rycina 2).

Rycina 2. Kontrolki panelu CyTOF po zapłonie plazmy i pomyślnym zakończeniu uruchamiania.

9. Uruchomienie pompy strzykawkowej. W prawym górnym rogu naciśnij zielony przycisk „play”, aby uruchomić pompę strzykawkową i rozpocząć przepływ cieczy przez rurki oraz rozpylanie z nebulizatora. Domyślne ustawienia strzykawki są przeznaczone dla 3 ml wody. Aby próbka mogła przepływać przez pętlę próbkową, pompę strzykawkową należy okresowo uzupełniać po wyczerpaniu zapasu wody. Na górze ekranu znajduje się licznik wskazujący ilość cieczy, która wypłynęła z pompy strzykawkowej. Pompa strzykawkowa zatrzyma się, gdy licznik ten osiągnie wartość „3.000” lub gdy tłok dotrze do końca strzykawki. Podczas ponownego napełniania strzykawki należy nacisnąć „stop”, a nie niebieski przycisk „pause”, aby zresetować licznik.

2. Codzienna kalibracja cytometru masowego

1. Cytometr masowy będzie potrzebował około 20 min na osiągnięcie gorącej, stabilnej plazmy przed kalibracją. Celem kroków strojenia jest maksymalizacja pożądanego sygnału Tm169 lub Tb159 przy jednoczesnym utrzymaniu sygnału „Gd155” (tlenek; La139+O16) poniżej 3% wyższej wartości. Kliknij przycisk Acquisition Settings, aby otworzyć okno Data Acquisition Settings. W karcie Analytes kliknij tablicę pierwiastków, aby otworzyć panel wyboru izotopów. Wybierz izotopy obecne w roztworze strojącym DVS Sciences wymienione w instrukcji, a następnie kliknij „save”.
2. Kliknij przycisk Isotopes Per Reading, aby otworzyć okno Mass(es) Per Reading. Wybierz „Pulses Count”, a następnie zmień skalę osi y, wpisując nową liczbę i naciskając „enter”.
3. Napełnij zieloną strzykawkę Norm-Ject o pojemności 1 ml roztworem strojącym. Przekręć przełącznik portu próbkowania na „LOAD”, wstrzyknij 450 μl roztworu strojącego, a następnie przekręć przełącznik na „INJECT”. W karcie Mass Calibration okna Data Acquisition Settings naciśnij „Run”, aby monitorować przepływające masy. Lewa strona okna odpowiada niższym masom, natomiast prawa strona wyższym masom. Uwaga: w obszarze TOF 9400-9800 będą już widoczne sygnały ze względu na izotopy ksenonu w gazie argonowym (Rysunek 3). Czekaj, aż izotopy roztworu strojącego zaczną pojawiać się w tym widoku w formie smug (Rysunek 4).

Rycina 3. Okno karty kalibracji masy, przedstawiające poziomy tła dla różnych izotopów po płukaniu roztworem myjącym i wodą. Obszar wokół TOF 9400-9800 odpowiada izotopom ksenonu w gazie argonowym i powinien być zawsze obecny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą figurę.

Rycina 4. Okno karty kalibracji masy, pokazujące pionowe pasy dla różnych izotopów w roztworze strojącym DVS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

4. Powróć do okna Mass(es) Per Reading i naciśnij zielony przycisk „Play” w lewym górnym rogu. Każdy izotop wybrany w kroku 2.1 jest reprezentowany przez linię o innym kolorze. Domyślną osią x jest „Time” (czas) w sec. Monitoruj poziomy poszczególnych izotopów do momentu ich ustabilizowania się.
5. Strojenie prądu. W karcie Parameter okna Data Acquisition Settings wybierz „Current” z menu rozwijanego. Ustaw start=0, finish=10, step value=0.5, settling time=200 i naciśnij „save”. Kliknij ponownie w oknie Mass(es) Per Reading i naciśnij play. Osią x jest teraz „Current” (prąd). Odnotuj i zapisz wartości, przy których sygnały izotopów osiągają szczyt (Rycina 5). W karcie DAC Channels Setup okna Instrument Setup przewiń w dół do pozycji „Current” i wprowadź tę nową wartość. Naciśnij „Set actual current value”, a następnie „save”.

Rysunek 5. Aktualny profil strojenia.

6. Dostrojenie gazu doprowadzającego. Zmień menu rozwijane na „Make-up gas”. Ustaw start=0,55, end=0,95, step value=0,05, settling time=200. Naciśnij save. Powróć do okna Mass(es) Per Reading i naciśnij play. Oś x reprezentuje teraz natężenie przepływu gazu doprowadzającego („Make-up gas”). Zapisz wartości, przy których sygnały izotopów osiągają maksimum. Zwróć uwagę na gwałtowny wzrost sygnału „Gd155” pod koniec pomiaru (Rysunek 6). Powróć do karty DAC Channels Setup, przesuń widok w dół do sekcji „Make-up gas” i wprowadź tę nową wartość. Naciśnij „Set actual current value”, a następnie „save”.

Rycina 6. Profil strojenia gazu uzupełniającego.

7. Rejestracja stosunku pożądanego izotopu do tlenku. Wykonaj drugi wtrysk 450 μl roztworu strojącego. W karcie Parameter wybierz z menu rozwijanego opcję „Time”, ustaw start=0, end=10, step value=1, settling time=200. Naciśnij „save”. Kliknij „play” w oknie Mass(es) Per Reading. Po ustabilizowaniu się linii (Rycina 7) użyj kursora, aby odczytać wartości w górnych lewych polach dla Tm169 lub Tb159 (wyższa wartość) oraz wartość dla „Gd155” (<3% wyższej wartości). Wartości te można również zapisać w pliku strojącym do późniejszego wykorzystania.

Rysunek 7. Pomiar intensywności sygnałów roztworu strojącego po optymalizacji prądu oraz gazu wyrównawczego.

8. Czyszczenie pętli próbkowej. Wstrzyknij 3 ml wody MilliQ przez pętlę próbkową, a następnie 500 μl roztworu myjącego DVS Wash Solution. Monitoruj przebieg czyszczenia, naciskając „run” w zakładce Mass Calibration. Myj do momentu, aż intensywność smug (Rysunek 4) zacznie spadać, a następnie podaj 3 ml wody MilliQ i monitoruj proces aż do osiągnięcia poziomów tła (Rysunek 3).

3. Analiza próbek

1. Otwórz okno Acquisition. Ustawienia domyślne: Do Analysis = On-The-Fly, Signal to Analyze = Dual, Dual Count Calibration = Data. Wybrana jest opcja Noise Reduction. Każde z tych ustawień można zmienić w razie potrzeby. Wprowadź nazwę pliku. Wszystkie pliki MUSZĄ zostać zapisane na dysku E://.
2. Ustawianie opóźnień akwizycji. Ze względu na długość rurek między pętlą próbkową a nebulizatorem wystąpi niewielkie opóźnienie w rejestrowaniu zdarzeń komórkowych, wynoszące około 30 s. W związku z tym suma „Acquisition delay” i „Detector stability delay” powinna wynosić co najmniej 30 s. Opóźnienie stabilizacji detektora (Detector stability delay) powinno wynosić co najmniej 20 s.
3. Ustawianie czasu zbierania danych. „Acquisition time” to liczba sekund, przez które próbka ma być analizowana. Wypełnienie całej pętli próbkowej o pojemności 450 μl wymagałoby 600 s do zakończenia procesu. Sugeruje się dodanie od 50 do 100 s do czasu zakończenia pomiaru, aby zminimalizować przeniesienie próbki (carry-over).
4. Resuspensja próbki. Aby zminimalizować odkładanie się soli w urządzeniu, sugeruje się wykonanie co najmniej dwóch płukań wodą MilliQ po zakończeniu barwienia komórek, a następnie końcową resuspensję w wodzie MilliQ. Objętość wody MilliQ użytej do resuspensji osadu komórkowego będzie zależeć od liczby komórek wyjściowych oraz odzysków komórkowych po całej procedurze barwienia. Dobrym punktem wyjścia jest 10⁶ (wyjściowych) komórek/ml. Po resuspensji przefiltruj próbkę przez sitko do komórek, aby usunąć agregaty.
5. Rozpoczęcie pomiaru próbki. Wprowadź nową nazwę pliku dla bieżącej próbki. Przełącz zawór pętli próbkowej na pozycję „LOAD”, wstrzyknij próbkę, przełącz z powrotem na „INJECT”, a następnie kliknij „Run” w oknie Acquisition.
6. Rejestrowanie zdarzeń komórkowych. Komórki będą reprezentowane w oknie podglądu (snapshot window) jako poziome skupiska oznaczeń w każdym pionowym kanale izotopu/markera (Rysunek 8). Choć cytometr masowy może rejestrować 1 000 komórek/s, lepsza rozdzielczość między zdarzeniami komórkowymi jest zazwyczaj uzyskiwana przy 300-500 komórkach/s. Odpowiada to średnio ~1 komórce na odświeżenie ekranu. Przed rozpoczęciem wzrostu licznika zdarzeń komórkowych może minąć do 30 s. Wynika to z przetwarzania danych w trybie „On-the-fly”; żadne informacje o zdarzeniach komórkowych nie zostają utracone.

Rycina 8. Okno akwizycji podczas analizy próbki, przedstawiające poziome rzędy punktów odpowiadających elementom powiązanym z trzema oddzielnymi zdarzeniami komórkowymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

7. Jakość zdarzeń komórkowych. Należy zwrócić uwagę na wszelkie smugi tła w każdym kanale izotopowym, a także na częstotliwość zdarzeń komórkowych. Cytometr masowy rozpoznaje „zdarzenie komórkowe” jako określony wzrost sygnału powyżej poziomu tła, zatem sygnał tła pochodzący z wolnych metali lub niezwiązanych przeciwciał może zmienić liczbę „zdarzeń komórkowych”. Dodatkowo, analiza komórek przy zbyt wysokim stężeniu może spowodować zwiększoną liczbę zdarzeń typu dublet. Tło można zmniejszyć poprzez dodatkowe przemycia lub większe rozcieńczenie komórek. Liczbę dubletów można zminimalizować poprzez większe rozcieńczenie komórek, kosztem wydłużonego czasu analizy.
8. Zakończenie akwizycji danych z próbki. Po osiągnięciu czasu akwizycji zbieranie danych zostanie zakończone. Przed pojawieniem się okna wyskakującego z przyciskiem „OK” wystąpi niewielkie opóźnienie; wynika ono ponownie z przetwarzania danych w czasie rzeczywistym („On-the-Fly”). Akwizycję próbki można również przerwać przedwcześnie, naciskając przycisk „Stop”. W takim przypadku wszystkie zarejestrowane już zdarzenia komórkowe zostaną policzone i zapisane w plikach wyjściowych.
9. Wtryskiwanie co najmniej 500 μl wody MilliQ pomiędzy każdą próbką pomaga również zminimalizować przenoszenie resztek próbki (carryover).

4. Czyszczenie urządzenia po użyciu

1. Roztwór płuczący. Po analizie ostatniej próbki i przemyciu pętli próbkowania wodą, wstrzyknij 450 μl roztworu płuczącego do pętli próbkowania. Monitoruj uwalnianie wolnego metalu w karcie Kalibracji Masy (Mass Calibration) okna Ustawień Akwizycji Danych (Data Acquisition Settings) tak jak w kroku 2.8 (Rysunek 9). Gdy sygnał wolnego metalu zacznie spadać, przemyj układ 3 ml wody MilliQ i monitoruj proces, aż do osiągnięcia poziomu tła.

Rycina 9. Okno karty kalibracji masy podczas czyszczenia po pomiarze przy użyciu roztworu DVS Wash. Pionowe prążki w obszarze TOF 9800-11000 to izotopy znaczników przeciwciał usuwane z urządzenia. Pionowe prążki wokół TOF 11500 odpowiadają dwóm izotopom interkalatora Ir. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

5. Wyłączanie urządzenia

1. W zakładce RFG Controller okna Instrument Setup wybierz opcję „Stop Plasma”. Po zakończeniu procedury pojawi się okno pop-up z prośbą o usunięcie nebulizera. Naciśnij „OK”. W zakładce Card Cage wyłącz grzejnik. Zamknij zawór dopływu argonu.
2. Usuwanie nebulizera. Usuń nebulizer z komory rozpylnej, ostrożnie wyciągając go do tyłu. Odkręć przewód doprowadzający próbkę z kroku 1.6 i odłóż na bok. Lekko poluzuj połączenie doprowadzające gaz pomocniczy, a następnie wyciągnij nebulizer. Pozostawienie złączki skręconej zmniejszy ryzyko zagubienia czarnego gumowego o-ringu i białego stożkowego elementu plastikowego.
3. Czyszczenie nebulizera. Przepłucz wstecznie oba porty nebulizera 5% roztworem citranoxu, używając strzykawki i przewodu zgodnie z krokiem 1.3. Przechowuj pod przykryciem w 5% roztworze citranoxu do następnego użycia.

Wyniki

Postępowanie zgodnie z powyższym protokołem powinno przynieść cztery rezultaty. Po pierwsze, zapewnienie odpowiedniego czasu rozgrzewania cytometru masowego pozwoli na uzyskanie gorącej, stabilnej plazmy, niezbędnej do otrzymania optymalnego sygnału i minimalizacji tworzenia się tlenków. Po drugie, dokładne przemycie cytometru masowego wodą MilliQ i roztworem DVS Wash (Rysunek 9) pomoże zmniejszyć poziom adsorpcji metali na przewodach i innych częściach urządzenia, co przyczyni się do redukcji tła podcza...

Dyskusja

W ciągu ostatnich kilku dekad fluorescencyjna cytometria przepływowa stanowiła podstawową metodę analizy pojedynczych komórek, zarówno pod kątem ekspresji powierzchniowej, jak i w testach funkcjonalnych. Jednak problem nakładania się widm barwników fluorescencyjnych ograniczył liczbę markerów stosowanych jednocześnie. Choć opisano eksperymenty z wykorzystaniem ponad 12 jednoczesnych markerów, konieczny zakres kompensacji sprawia, że jest to trudne technicznie.

Zamiast fluoroforów, cytometria m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytometr masowy CyTOF	DVS Sciences
Roztwór płuczący	DVS Sciences	201071	0.05% kwasu fluorowodorowego w wodzie
Roztwór strojący	DVS Sciences	201072	0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, śladowa ilość kwasu azotowego
Kuleczki polistyrenowe zawierające Eu	DVS Sciences	201073	Zawierają izotopy Eu o naturalnej obfitości; kuleczki dostarczane w stężeniu około 1 milion/ml
Kuleczki polistyrenowe zawierające wiele lantanowców (La/Pr/Tb/Tm/Lu)	DVS Sciences	Obecnie niedostępne w sprzedaży	Zawierają izotopy wymienionych lantanowców o naturalnej obfitości
Kwas azotowy (stężony)	Fisher Scientific	A467-500	Klasa ICP-MS Optima trace-metal pure
Polistyrenowa probówka z okrągłym dnem i nakrętką z filtrem do komórek-5 ml	BD	352235	używana do filtrowania próbek komórek przed wstrzyknięciem
Strzykawka tuberkulinowa Norm-Ject-1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0	bez silikonu, bez lateksu
Strzykawka Norm-Ject-3 ml	Henke Sass Wolf	4010.000V0	bez silikonu, bez lateksu
Woda MilliQ			Woda czysta 18 MΩ; nie może być przechowywana w szklanych lub plastikowych butelkach mytych komercyjnym detergentem (ze względu na wysoką zawartość baru).
Citranox	Sigma-Aldrich	Z273236	detergent kwasowy
Gaz argonowy	Praxair	AR 5.0UH-T	99.999% ultra-wysoka czystość