Mikroskopijne organizmy, takie jak wolno pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście umożliwiające analizę C. elegans z wykorzystaniem wzorów dyfrakcyjnych. Metoda ta polega na śledzeniu periodyczności czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie wiązki lasera przez kuwetę.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroorganizmy glebowe i wodne żyją i zachowują się w złożonym środowisku trójwymiarowym. Większość badań nad zachowaniem mikroorganizmów prowadzono natomiast z wykorzystaniem metod opartych na mikroskopach, co ogranicza ruch i zachowanie do wąskiego, niemal dwuwymiarowego pola ogniskowania.1 Przedstawiamy nowatorskie podejście analityczne, które umożliwia analizę w czasie rzeczywistym swobodnie pływających C. elegans w kuwecie, bez zależności od sprzętu mikroskopowego. Metoda ta polega na śledzeniu okresowości czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie światła laserowego przez kuwetę. Pomiarom poddajemy częstotliwości oscylacji swobodnie pływających nicieni.
Analiza dyfrakcyjnych wzorów pola dalekiego dostarcza informacji o kształcie fal organizmów z rodzaju nematodes. Dyfrakcja jest procesem uginania się światła na krawędziach obiektu. W tym przypadku światło ulega dyfrakcji na organizmach. Fale świetlne interferują, co może prowadzić do powstania wzoru dyfrakcyjnego. Dyfrakcyjny wzór pola dalekiego, nazywany również wzorem Fraunhofera, powstaje, gdy odległość od obiektu do ekranu jest znacznie większa niż rozmiar dyfrakcyjnego obiektu. W takim przypadku wzór dyfrakcyjny można obliczyć (wymodelować) przy użyciu transformaty Fouriera.2
C. elegans to wolnożyjące nicienie glebowe, które poruszają się w trzech wymiarach. Przemieszczają się zarówno po macierzy stałej, takiej jak gleba lub agar, w sinusoidalnym wzorcu lokomocyjnym zwanym pełzaniem, jak i w cieczy w innym wzorcu zwanym pływaniem.3 Rola informacji sensorycznych dostarczanych przez komórki mechanosensoryczne, chemosensoryczne i termosensoryczne, które kontrolują plastyczne zmiany we wzorcach lokomocyjnych oraz przełączanie między nimi, zaczyna być dopiero wyjaśniana.4 Opisujemy podejście optyczne do pomiaru lokomocji nicieni w trzech wymiarach, które nie wymaga użycia mikroskopu i pozwoli nam rozpocząć badanie złożoności lokomocji nicieni w różnych warunkach.
Protokół
1. Przygotowanie C. elegans do analizy wideo
- Przenieś 10-20 dorosłych, zapłodnionych nicieni na świeże szalki Petri wypełnione agarem NGM, używając cienkiej, spłaszczonej igły platynowej. Szalki Petri z agarem NGM zawierają małą, okrągłą plamkę E. coli (najlepsze wyniki daje szczep o ograniczonym wzroście OP50), która służy nicieniom jako pożywienie. Pozostaw nicienie na 3-5 hr w celu zniesienia jaj, a następnie usuń osobniki dorosłe, tworząc w ten sposób małą, zsynchronizowaną rozwojowo kulturę 50-150 nicieni. Pozostaw nicienie do osiągnięcia wczesnego stadium dorosłości, inkubując szalki Petri w temperaturze 20 °C przez 4-5 dni. Metody hodowli te opierają się na ustalonych procedurach (Stiernagle 2006).5
- W dniu analizy wideo wypłucz szalkę z młodymi dorosłymi nicieniami 1 ml dejonizowanej wody destylowanej, zbierając w ten sposób 50-150 osobników z zsynchronizowanej kultury. Można również zastosować roztwór buforowy, taki jak M9 lub PBS. Użyj mikrocentryfugi, aby odwirować nicienie na dno probówki, lub pozostaw je do osiedlenia się pod wpływem grawitacji przez około 15 min. Usuń większość wody z probówki i zastąp ją 1 ml dejonizowanej wody destylowanej, aby wypłukać przylegające bakterie z ciał nicieni.
- Przenieś nicienie w wodzie lub buforze do kuwety kwarcowej za pomocą mikropipety. Ważne jest, aby pracować z małą liczbą osobników, łącznie około 5-10 nicieni naraz lub nawet mniej, aby prawdopodobieństwo oświetlenia przez laser tylko jednego nicienia w danym momencie było wysokie. Jeśli liczba nicieni na szalkach hodowlanych jest zbyt duża, rozcieńcz je w wodzie lub buforze, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości. Można również przenosić pojedyncze nicienie do kropli wody lub buforu na świeżej płytce agarowej w celu ich wypłukania, a następnie przenosić poszczególne osobniki do kuwety. W naszym badaniu użyliśmy kuwet o rozmiarach 1 mm, 2 mm i 5 mm, aby zbadać wpływ ograniczeń fizycznych na zachowanie pływackie.
2. Układ optyczny do analizy wideo
- Wykonaj konfigurację zgodnie z przedstawionym schematem w Rysunek 1 wykorzystując laser helowo-neonowy (HeNe) o długości fali 543 nm (zielony), dwa lustra aluminiowe z powłoką na powierzchni przedniej, uchwyt na kuwetę, ekran projekcyjny oraz kamerę wysokich prędkości (Casio High Speed Exilim) zdolną do filmowania z częstotliwością ok. 240 kl./s. Dwa lustra służą do kierowania wiązki lasera przez kuwetę. W zależności od charakteru badania można zastosować kuwety o różnych rozmiarach. Przykładowo, w celu wykazania wpływu ograniczeń przestrzennych na częstotliwości pływania, zastosowano kuwety o grubości 5 mm. Wiązka lasera musi spełniać wymagania dotyczące nadpróbkowania; t.j.., organizm nie powinien zasłaniać więcej niż jednej trzeciej wiązki lasera. Dla C. eleganswiązka lasera powinna mieć średnicę około 2 mm w punkcie oddziaływania z nicieniem. Średnica wiązki lasera nie powinna przekraczać 5 mm, ponieważ utrudni to zlokalizowanie wzoru dyfrakcyjnego. Odległość od organizmu dyfrakcyjnego do ekranu powinna być znacznie większa niż rozmiar samego organizmu.
- Przykryć górną część kuwety parafilmem i odwrócić ją, aby wymieszać nicienie w kolumnie wody. Umieścić kuwetę w uchwycie tak, aby nicienie znajdowały się początkowo w górnej części naczynia. Za pomocą luster skierować wiązkę lasera przez środek kuwety. Ponieważ nicienie mają większą gęstość niż woda, będą powoli opadać na dno kuwety, jednocześnie pływając w kolumnie wody.
- Na ekranie projekcyjnym zamaluj na czarno miejsce odpowiadające przechodzącej wiązce laserowej, aby zredukować rozproszenie w punkcie styku wiązki z ekranem (Rycina 2)Alternatywnie w ekranie projekcyjnym można wykonać otwór, aby umożliwić przejście wiązki transmitowanej przez ekran. Wyeliminowanie lub ograniczenie rozproszenia wiązki transmitowanej zapobiegnie nasyceniu matrycy CCD kamery przez tę wiązkę.
- Aby wyznaczyć miarę rozmiaru wzoru dyfrakcyjnego, narysuj linię o długości około 5 cm na ekranie projekcyjnym obok plamki przechodzącego wiązki lasera, tak aby nie zakłócać obrazu światła ugiętego.
- Rozpocznij nagrywanie kamerą przy włączonym świetle w pomieszczeniu, aby linia o długości 5 cm znalazła się na tym samym materiale wideo co obrazy dyfrakcyjne. Wyłącz światło w pomieszczeniu. Nagrywaj kamerą obrazy dyfrakcyjne na ekranie w momencie, gdy dżdżownice przechodzą przez wiązkę lasera.
3. Przygotowanie danych wideo
- Zainstaluj program do analizy wideo (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/) na komputerze. Zaimportuj wideo do programu do analizy wideo
- Ustaw punkt początkowy tak, aby pokrywał się z transmitowaną plamką lasera. Ustaw skalę, korzystając z linii 5 cm na ekranie projekcyjnym.
- Śledź przemieszczenie kątowe obrazu dyfrakcyjnego utworzonego przez każdego nicienia, korzystając z oprogramowania do analizy wideo (Rysunek 3)
- Aby wyznaczyć przemieszczenie kątowe poprzez obliczenie arctan (y/x), skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego (Excel) i dodaj 180 deg lub π do wszystkich ujemnych kątów, aby uzyskać ciągły wykres (Rysunek 4).
4. Akwizycja danych w czasie rzeczywistym do natychmiastowej obserwacji częstotliwości pływania
- Wykorzystując ten sam układ, co w przypadku analizy wideo, umieść fotodiodę (DET10A firmy ThorLabs) o niewielkiej powierzchni (~1 mm2) poza centrum wzoru dyfrakcyjnego, bezpośrednio przed ekranem projekcyjnym.
- Podłącz fotodiodę do cyfrowego oscyloskopu (PicoScope firmy Pico Technology), który jest połączony z komputerem za pomocą portu USB. Obserwuj wzory oscylacji na ekranie komputera.
- Zapisz pozyskane zestawy danych w formacie ASCII lub tekstowym.
5. Analiza danych
- Importuj dane pozyskane za pomocą wideo lub fotodiody do programu do analizy danych umożliwiającego dopasowanie przebiegów czasowych z wykorzystaniem minimalizacji chi-kwadrat. W niniejszej procedurze użyto programu Origin (http://www.originlab.com/). Dopasuj krzywą sinusoidalną w celu wyznaczenia częstotliwości miotania (Rysunki 4 i 5).
- Oblicz średnie częstotliwości pływania dla różnych próbek i wyznacz wariancję. W tej badaniu dane analizowano statystycznie za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Bonferroniego. Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
6. Modelowanie obrazów dyfrakcyjnych na przykładzie programu Mathematica
Uwaga: Wzory dyfrakcyjne można modelować przy użyciu wielu różnych narzędzi obliczeniowych. Procedura ta będzie się różnić w zależności od zastosowanego narzędzia, takiego jak MatLab, Excel, Origin itp.
- Wykonanie zdjęcia: Wykonać zdjęcia nicieni na szkiełku mikroskopowym przy użyciu tradycyjnego mikroskopu.
- Binaryzacja obrazu: Zaimportować obraz nicienia „Worm” do programu Mathematica, przeciągając go do okna programu. Przekształcić obraz w obraz czarno-biały (binaryzacja). Można to osiągnąć za pomocą polecenia „Binarize” w Mathematica: BlackandWhiteImage=Binarize[Worm]. Obraz można następnie wyświetlić jako obraz czarno-biały.
Alternatywnie można użyć polecenia „EdgeDetect”, aby utworzyć BlackandWhiteImage: EdgeDetect[Worm,6.0,0.035], gdzie dwie ostatnie liczby kontrolują grubość uzyskanych krawędzi. - Konwersja obrazu na macierz zer i jedynek: Można to osiągnąć za pomocą polecenia „ImageData” w Mathematica: Matrix=ImageData[BlackandWhiteImage].
- Transformata Fouriera macierzy: Użyć polecenia „Fourier” w Mathematica, aby przeprowadzić transformację Fouriera macierzy, stosując wskazane FourierParameters: FTransform = Fourier[Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
- Kwadrat modułu macierzy w celu uzyskania macierzy dyfrakcyjnej i poprawy kontrastu obrazu: Podnieść do kwadratu wartość bezwzględną macierzy i wyświetlić otrzymany obraz, który stanowi wzór dyfrakcyjny odpowiadający obrazowi oryginalnemu. Należy również użyć funkcji „Log”, aby przeskalować kontrast obrazu: ImageContrast = Image[Log[1 + (Abs[FTransform])^2]/0.5].
- Zmiana rozmiaru obrazu dla łatwiejszego oglądania: Wyciąć centralny wzór dyfrakcyjny i zmienić rozmiar według uznania: ImageResize[ImageContrast [y, 100], 500].
- Porównać modelowane wzory dyfrakcyjne z wzorami dyfrakcyjnymi uzyskanymi z swobodnie pływających nicieni. (Rycina 6)
Wyniki
W ramach przykładu badaliśmy C. elegans w kuwecie kwarcowej o szerokości 1 cm, grubości 5 mm i wysokości 4 cm. Pobierając dane dla pojedynczego nicienia za pomocą analizy wideo, średnia częstotliwość pływania uzyskana z analizy wideo w kuwecie o grubości 5 mm wynosi około 2,5 Hz (Rysunek 4). Podobnie, pobierając dane dla pojedynczego nicienia za pomocą metody akwizycji danych w czasie rzeczywistym przy użyciu cyfrowego oscyloskopu (PicoScope), otrzymujemy częstotliwość pływania wynoszącą około 2,7 Hz (Rysunek 5). Procedurę tę można powtórzyć dla wielu nicieni. Szczegółowe badanie swobodnie pływających nicieni wykazało średnią częstotliwość pływania 2,37 Hz w kuwecie 5 mm.6 Zgodnie z oczekiwaniami, częstotliwość pływania jest wyższa niż w przypadku nicienia pełzającego (~0,8 Hz).3 Stosując tę metodę dyfrakcyjną, stwierdzono, że średnie częstotliwości pływania C. elegans ograniczonego do szkiełka mikroskopowego są zgodne z wcześniej opublikowaną wartością 2 Hz.1,7
Postępowanie zgodnie z procedurami 3.) a następnie 6.) umożliwia modelowanie wzorców dyfrakcji pływania przy użyciu obrazów nicieni uzyskanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu. Modelowane wzorce dyfrakcji są wykorzystywane do symulacji cyklu pływania C. elegans (Rysunek 6). Pomyślny model składa się z fizycznie wykonalnych, następujących po sobie wzorców pływania, które odpowiadają częstotliwościom pływania. Nicień powinien znajdować się w tej samej formie na koniec cyklu pływania, w jakiej był na jego początku.
Rycina 1. Do stworzenia dynamicznego wzoru dyfrakcyjnego z wykorzystaniem żywych C. elegans użyto zielonego lasera HeNe. Wzór dyfrakcyjny ten został zarejestrowany przy prędkości 240 fps.
Rysunek 2. Namalowanie czarnej kropki zwiększa absorpcję wiązki przechodzącej. Saturacja kamery spowodowana światłem rozproszonym ulega zmniejszeniu, a wzór dyfrakcyjny staje się widoczny.
Rycina 3. Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy wideo (Logger Pro) przedstawiający śledzony wzór dyfrakcyjny dżdżownicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rysunek 4. Dane wideo odpowiadające cyklowi pływania nicienia w kuwecie 5 mm. Dopasowanie krzywej wykazuje częstotliwość pływania wynoszącą ~ 2.5 Hz.
Rycina 5. Dane w czasie rzeczywistym odpowiadające cyklowi pływania nicienia w kuwecie 5 mm. Dopasowanie krzywej wykazuje częstotliwość pływania wynoszącą ~ 2.7 Hz.
Rysunek 6. Górny rząd przedstawia rzeczywiste wzory dyfrakcyjne, które odpowiadają modelowym wzorom dyfrakcyjnym w dolnym rzędzie. Modelowe wzory dyfrakcyjne zostały wytworzone przy użyciu nicieni na szkiełku przedmiotowym (środkowy rząd).
Dyskusja
Opracowaliśmy nowatorskie podejście do pomiaru ruchu i prostych zachowań lokomocyjnych w czasie rzeczywistym u organizmów mikroskopijnych, takich jak nicienie, które nie wymaga użycia mikroskopów.8 To podejście metodologiczne mogłoby zostać wykorzystane również do badania licznych organizmów mikroskopijnych, takich jak protisty. Metoda ta jest ograniczona jedynie długością fali zastosowanego światła. Organizm nie może być mniejszy niż długość fali światła. Poza oszczędnością kosztów i przenośnością wymaganego sprzętu, kluczową zaletą tego podejścia jest możliwość pomiaru zachowania w czasie rzeczywistym i w trzech wymiarach, bez wąskich ograniczeń płaszczyzn obrazowania pod mikroskopem. Dzięki tej technice możliwe jest również badanie wpływu sił grawitacyjnych lub wielu innych czynników na zachowanie, których nie można badać za pomocą metod opartych na mikroskopach.9 W ten sposób możemy uzyskać lepsze zrozumienie naturalnych zachowań lokomocyjnych mikroorganizmów, uwolnionych od ograniczeń kropel na szkiełkach mikroskopowych lub specjalistycznych komór mikroprzepływowych (Park et al, 2008).10
Brak informacji o fazie w obrazie dyfrakcyjnym uniemożliwia bezpośrednie odtworzenie obrazu odpowiadającego obiektowi dyfrakcyjnemu, ponieważ obraz dyfrakcyjny w polu dalekim jest proporcjonalny do kwadratu wartości bezwzględnej transformaty Fouriera. W związku z tym obliczamy obrazy dyfrakcyjne na podstawie obrazów nicieni, aby można było je dopasować do obrazów dyfrakcyjnych swobodnie pływających nematod (Rysunek 6).
Ta metoda przyniosła rezultaty w przypadku naprawdę swobodnie pływających C. elegans i może być zastosowana do każdego gatunku mikroskopijnego, który porusza się w środowisku optycznie przezroczystym, takim jak woda lub wiele różnych roztworów jonowych. Konwencjonalne mikroskopy pozwalają na badania jedynie z głębokością ogniskowania rzędu mikrometrów.11 Wynika to z ograniczonej głębi ostrości podczas ogniskowania światła:
gdzie liczba przysłony N jest odwrotnie proporcjonalna do kręgu rozmycia (c), tak że krótka ogniskowa wiąże się z dużym c.12,13 Choć ta metoda dyfrakcyjna z pewnością nie zastępuje konwencjonalnej mikroskopii, pozwala ona na szybkie uzyskanie wyników ilościowych, co umożliwia manipulowanie gatunkami w czasie rzeczywistym przy niskich kosztach. Wzory dyfrakcyjne można uzyskać za pomocą dowolnego wskaźnika laserowego. Wzory dyfrakcyjne mogą być rejestrowane przy obniżonej rozdzielczości czasowej za pomocą zwykłego aparatu cyfrowego. Nawet jeśli użytkownik nie ma pod ręką mikroskopu ani fotodiody, kluczowe elementy tego eksperymentu, takie jak pomiar częstotliwości miotania się i ocena wzorów dyfrakcyjnych, mogą być wykonane przy minimalnych nakładach finansowych.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Tzlil Rozenblat, Alexandrze Bello i Karlowi Spuhlerowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund oraz grant NASA nr NX09AU90A, grant National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) nr 0630388 oraz grant NSF nr 1058385.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Laser HeNe 543 nm | Melles Griot | LGX1 | Można użyć dowolnego lasera w zakresie widzialnym o mocy mniejszej niż 5 mW. |
| 2 lustra aluminiowe z powierzchnią przednią | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| Szybka kamera Exilim | Casio | ||
| Kuweta kwarcowa | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro (oprogramowanie) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ |
Bibliografia
- Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
- James, J. F. A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , Cambridge Univ. Press. (1995).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).
- Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue. Nature. 440, 684-687 (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, W. ormB. ook, , (2006).
- Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction. O. J. Biphys. , (2012).
- Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).
- Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).
- Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment. PLOS One. 3, e2550(2008).
- Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).
- Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
- Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).
Przedruki i uprawnienia
