Artykuł metodologiczny

Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej

DOI:

10.3791/4412

⸱

25 października 2012

 ,  , 
1Physics & Astronomy Department, Vassar College, 2Biology Department, Vassar College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopijne organizmy, takie jak swobodnie pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście, które zapewnia analizę C. elegans przy użyciu wzorów dyfrakcyjnych. Podejście to polega na śledzeniu czasowej okresowości wzorów dyfrakcyjnych generowanych przez kierowanie światła laserowego przez kuwetę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopijne organizmy glebowe i wodne żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Z kolei większość badań nad mikroskopijnym zachowaniem organizmów przeprowadzono przy użyciu podejść opartych na mikroskopie, które ograniczają ruch i zachowanie do wąskiego, prawie dwuwymiarowego pola ogniskowego. 1 Przedstawiamy nowatorskie podejście analityczne, które zapewnia analizę w czasie rzeczywistym swobodnie pływających C. elegans w kuwecie bez zależności od sprzętu opartego na mikroskopie. Podejście to polega na śledzeniu czasowej okresowości wzorów dyfrakcyjnych generowanych przez kierowanie światła laserowego przez kuwetę. Mierzymy częstotliwości oscylacji dla swobodnie pływających nicieni.

Analiza wzorów dyfrakcyjnych dalekiego pola ujawnia wskazówki dotyczące przebiegów nicieni. Dyfrakcja to proces zakrzywiania się światła wokół obiektu. W tym przypadku światło jest załamywane przez organizmy. Fale świetlne interferują i mogą tworzyć wzór dyfrakcyjny. Wzór dyfrakcyjny dalekiego pola lub Fraunhofera powstaje, jeśli odległość między ekranem a obiektem jest znacznie większa niż w przypadku obiektu dyfrakcyjnego. W takim przypadku wzór dyfrakcyjny można obliczyć (zamodelować) za pomocą transformaty Fouriera. cyfra arabska

C. elegans to wolno żyjące nicienie żyjące w glebie, które poruszają się w trzech wymiarach. Poruszają się zarówno po stałej matrycy, takiej jak gleba lub agar, w sinusoidalnym wzorcu lokomotorycznym zwanym pełzaniem, jak i w cieczy w innym wzorze zwanym pływaniem. 3 Rola odgrywana przez informacje sensoryczne dostarczane przez komórki mechanosensoryczne, chemosensoryczne i termosensoryczne, które zarządzają zmianami plastycznymi we wzorcach lokomotorycznych i przełącznikami we wzorcach, dopiero zaczynają być wyjaśniane. 4 Opisujemy optyczne podejście do pomiaru lokomocji nicieni w trzech wymiarach, które nie wymaga mikroskopu i pozwoli nam rozpocząć badanie złożoności lokomocji nicieni w różnych warunkach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. C. elegans Przygotowanie do analizy wideo

  1. Przenieś 10-20 grawitacyjnych dorosłych nicieni na świeże płytki Petriego wypełnione agarem NGM za pomocą cienkiego, spłaszczonego platynowego drucianego szpikulca. Szalki Petriego wypełnione agarem NGM zawierają małą okrągłą plamkę E. coli (szczep o ograniczonym wzroście, OP50, daje najlepsze wyniki), aby nicienie mogły się zjadać. Pozwól nicieniom złożyć jaja przez 3-5 godzin, a następnie usuń dorosłe osobniki, tworząc w ten sposób małą, zsynchronizowaną rozwojowo kulturę 50-150 nicieni. Pozwól nicieniom dorosnąć do wczesnej dorosłości, inkubując płytki Petriego w temperaturze 20 °C przez 4-5 dni. Te metody hodowli opierają się na ustalonych procedurach (Stiernagle 2006). 5
  2. W dniu analizy wideo przepłucz płytkę młodych dorosłych nicieni 1 ml dejonizowanej, destylowanej wody, zbierając w ten sposób 50-150 robaków z zsynchronizowanej kultury. Można również użyć roztworu buforowego, takiego jak M9 lub PBS. Użyj mikrowirówki, aby obrócić robaki na dno probówki lub pozwól im osiąść grawitacyjnie przez około 15 minut. Usuń większość wody z probówki i zastąp ją 1 ml dejonizowanej wody destylowanej w celu zmycia wszelkich przylegających bakterii z nicieni.
  3. Przenieść nicienie do wody lub buforu do kuwety kwarcowej za pomocą mikropipety. Ważne jest, aby pracować z niewielką liczbą, w sumie około 5-10 nicieni jednocześnie lub nawet mniej, aby jeden nicień na raz mógł zostać oświetlony przez laser. Jeśli liczba nicieni na płytkach hodowlanych jest zbyt duża, rozcieńczyć robaki w wodzie lub buforze, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości. Możliwe jest również zbieranie pojedynczych nicieni do kropli wody lub bufora na świeżej płytce agarowej w celu ich umycia i przeniesienia pojedynczych robaków do kuwety. W naszym badaniu użyliśmy kuwet o rozmiarach 1 mm, 2 mm i 5 mm, aby zbadać wpływ ograniczeń fizycznych na zachowanie podczas pływania.

2. Konfiguracja optyczna do analizy wideo

  1. Wykonaj konfigurację, jak pokazano na rysunku 1, używając lasera helowo-neonowego (HeNe) o długości fali 543 nm (zielony), dwóch aluminiowych lusterek na przedniej powierzchni, uchwytu na kuwetę, ekranu projekcyjnego i szybkiej kamery (Casio High Speed Exilim) zdolnej do filmowania z prędkością ~240 kl./s. Dwa lustra służą do kierowania wiązką lasera przez kuwetę. W zależności od charakteru badania można stosować kuwety o różnych rozmiarach. Jako przykład użyliśmy kuwet o grubości 5 mm, aby pokazać wpływ ograniczeń przestrzennych na częstotliwość pływania. Wiązka laserowa musi spełniać wymagania dotyczące nadpróbkowania; Oznacza to, że organizm nie powinien blokować więcej niż jedną trzecią wiązki laserowej. W przypadku C. elegans wiązka laserowa powinna mieć średnicę około 2 mm, gdy wchodzi w interakcję z nicieniami. Wiązka laserowa nie powinna mieć średnicy większej niż 5 mm, ponieważ wzór dyfrakcyjny będzie trudny do zlokalizowania. Odległość od organizmu dyfrakcyjnego do ekranu powinna być znacznie większa niż sam organizm.
  2. Umieść parafilm na wierzchu kuwety i odwróć go, aby wymieszać nicienie ze słupem wody. Umieść kuwetę w uchwycie kuwety tak, aby robaki początkowo znajdowały się w górnej części kuwety. Za pomocą luster skieruj wiązkę lasera przez środek kuwety. Ponieważ nicienie są gęstsze od wody, będą powoli opadać na dno kuwety, jednocześnie pływając w słupie wody.
  3. Na ekranie projekcyjnym pokoloruj plamkę odpowiadającą przesyłanej wiązce laserowej na czarno, aby zmniejszyć rozpraszanie, gdy transmitowana wiązka styka się z ekranem projekcyjnym (rysunek 2). Alternatywnie umieść otwór w ekranie projekcyjnym, aby umożliwić przejście przesyłanej wiązki przez ekran. Wyeliminowanie lub zmniejszenie rozpraszania od przesyłanej wiązki zapobiegnie nasyceniu matrycy CCD kamery z powodu transmitowanej wiązki.
  4. Aby uchwycić miarę wielkości wzoru dyfrakcyjnego, narysuj linię o długości około 5 cm na ekranie projekcyjnym obok plamki transmitowanej wiązki laserowej, nie zakłócając obrazu w świetle dyfrakcyjnym.
  5. Rozpocznij nagrywanie kamerą, gdy światło w pomieszczeniu jest włączone, tak aby linia 5 cm znajdowała się na tym samym materiale filmowym, co obrazy dyfrakcyjne. Wyłącz światło w pomieszczeniu. Nagrywaj obrazy dyfrakcyjne na ekranie za pomocą aparatu, gdy robaki przechodzą przez wiązkę laserową.

3. Przygotowanie danych wideo

  1. Zainstaluj na komputerze program do analizy wideo (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/). Zaimportuj wideo do programu do analizy wideo
  2. Ustaw początek układu współrzędnych tak, aby pokrywał się z przesyłaną plamką lasera. Ustaw skalę za pomocą linii 5 cm na ekranie projekcyjnym.
  3. Śledź przemieszczenie kątowe obrazu dyfrakcyjnego utworzonego przez każdą nicień za pomocą oprogramowania do analizy wideo (rysunek 3)
  4. Aby znaleźć przemieszczenie kątowe, biorąc arctan (y/x), skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego (Excel) i dodaj 180 stopni lub π dla wszystkich kątów ujemnych, aby uzyskać ciągły wykres (rysunek 4).

4. Akwizycja danych w czasie rzeczywistym do natychmiastowej obserwacji częstotliwości pływania

  1. Korzystając z tej samej konfiguracji, co w przypadku analizy wideo, umieść fotodiodę (DET10A firmy ThorLabs) o małym obszarze (~1 mm2) poza środkiem we wzorze dyfrakcyjnym tuż przed ekranem projekcyjnym.
  2. Podłącz fotodiodę do oscyloskopu cyfrowego (PicoScope firmy Pico Technology), który łączy się z komputerem przez port USB. Obserwuj wzorce młócenia na ekranie komputera.
  3. Zapisuj pozyskane zestawy danych w formacie ASCII lub tekstowym.

5. Analiza danych

  1. Zaimportuj dane uzyskane za pomocą wideo lub fotodiody do programu do analizy danych, który jest w stanie dopasować przebiegi przy użyciu minimalizacji chi-kwadrat. Użytym tutaj programem jest Origin (http://www.originlab.com/). Dopasuj krzywą sinusoidalną, aby określić częstotliwość młócenia (rysunki 4 i 5).
  2. Uśrednij częstotliwości pływania z różnych próbek i określ wariancję. W tym badaniu dane analizowano statystycznie przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Bonferroniego. Wartość p wynosząca < 0,05 została uznana za statystycznie istotną.

6. Modeluj wzory dyfrakcyjne na przykładzie Mathematica

Uwaga: Wzory dyfrakcyjne mogą być modelowane przy użyciu wielu różnych narzędzi obliczeniowych. Ta procedura będzie się różnić dla różnych narzędzi obliczeniowych, takich jak MatLab, Excel, Origin itp.

  1. Utwórz obraz: Rób zdjęcia nicieni na szkiełku mikroskopowym za pomocą tradycyjnego mikroskopu.
  2. Binaryzuj obraz: Zaimportuj obraz robaka "Robak" do Mathematica, przeciągając obraz do Mathematica. Przekonwertuj obraz na obraz czarno-biały (binaryzacja). Można to osiągnąć za pomocą polecenia 'Binarize' w Mathematica: BlackandWhiteImage=Binarize[Worm]. Obraz można następnie wyświetlić jako obraz czarno-biały.
    Alternatywnie można użyć polecenia "EdgeDetect", aby utworzyć BlackandWhiteImage: EdgeDetect[Worm,6.0,0.035], gdzie dwie końcowe liczby kontrolują chropowatość wynikowych krawędzi.
  3. Przekształć obraz w macierz zer i jedynek: Można to osiągnąć za pomocą polecenia "ImageData" w Mathematica: Matrix=ImageData[BlackandWhiteImage].
  4. Macierz transformaty Fouriera: Użyj polecenia "Fourier" w Mathematica, aby przekształcić macierz Fouriera przy użyciu wskazanych parametrów Fouriera: FTransform = Fourier[Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
  5. Moduł kwadratowy matrycy, aby uzyskać matrycę dyfrakcyjną i poprawić kontrast obrazu: Podnieś do kwadratu wartość bezwzględną matrycy i wyświetl wynikowy obraz, który jest wzorem dyfrakcyjnym odpowiadającym oryginalnemu obrazowi. Użyj również funkcji "Log", aby przeskalować kontrast obrazu: ImageContrast = Image[Log[1 + (Abs[FTransform])^2]/0.5].
  6. Zmień rozmiar obrazu, aby ułatwić przeglądanie: Przytnij centralny wzór dyfrakcyjny i zmień rozmiar zgodnie z potrzebami: ImageResize[ImageContrast [y, 100], 500].
  7. Porównaj modelowane wzory dyfrakcyjne ze wzorami dyfrakcyjnymi uzyskanymi od swobodnie pływających robaków. (Rysunek 6)

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na przykład, badaliśmy C. elegans w kuwecie kwarcowej o szerokości 1 cm, grubości 5 mm i wysokości 4 cm. Pobierając próbki pojedynczego robaka za pomocą analizy wideo, średnia częstotliwość pływania uzyskana z analizy wideo w kuwecie o grubości 5 mm wynosi około 2,5 Hz (ryc. 4). Podobnie, próbkując pojedynczego robaka za pomocą metody pozyskiwania danych w czasie rzeczywistym, uzyskujemy częstotliwość pływania około 2,7 Hz (rysunek 5), za pomocą oscyloskopu cyfrowego (PicoScope). Tę procedurę można powtórzyć dla wielu robaków. Szczegółowe badanie swobodnie pływających robaków wykazało średnią częstotliwość pływania 2,37 Hz w kuwecie 5 mm. 6 Zgodnie z oczekiwaniami, częstotliwość pływania jest wyższa niż w przypadku pełzającego robaka (~,8 Hz). 3 Stosując tę metodę dyfrakcyjną, stwierdzono, że średnia częstotliwość pływania C. elegans, która jest ograniczona do szkiełka mikroskopowego, odpowiada poprzednio opublikowanej wartości 2 Hz.1,7

Następujące procedury 3.) a następnie 6.) pozwala na modelowanie pływających wzorów dyfrakcyjnych za pomocą obrazów robaków uzyskanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu. Modelowane wzory dyfrakcyjne są wykorzystywane do symulacji cyklu pływania C. elegans (ryc. 6). Udany model składa się z fizycznie wykonalnych następujących po sobie wzorców pływania dopasowanych do częstotliwości pływania. Robak powinien mieć taki sam kształt pod koniec cyklu pływania, jak na początku cyklu pływania.

figure-results-1
Rysunek 1. Zielony laser HeNe został użyty do stworzenia dynamicznego wzoru dyfrakcyjnego przy użyciu żywych C. elegans. Ten wzór dyfrakcyjny został sfilmowany z prędkością 240 kl./s.

figure-results-2
Rysunek 2. Narysowanie czarnej kropki zwiększa absorpcję przesyłanej wiązki. Nasycenie kamery spowodowane rozproszonym światłem jest zmniejszone, a wzór dyfrakcyjny staje się widoczny.

figure-results-3
Rysunek 3. Zrzut ekranu oprogramowania do analizy wideo (Logger Pro) ze śledzonym wzorem dyfrakcji robaków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-4
Rysunek 4. Dane wideo odpowiadające cyklowi pływania nicienia w kuwecie o średnicy 5 mm. Dopasowanie krzywej ujawnia częstotliwość pływania ~ 2,5 Hz.

figure-results-5
Rysunek 5. Dane w czasie rzeczywistym odpowiadające cyklowi pływania nicienia w kuwecie 5 mm. Dopasowanie krzywej ujawnia częstotliwość pływania ~ 2,7 Hz.

figure-results-6
Rysunek 6. Górny rząd reprezentuje rzeczywiste wzory dyfrakcyjne i jest dopasowany do modelowanych wzorów dyfrakcyjnych w dolnym rzędzie. Modelowane wzory dyfrakcyjne uzyskano za pomocą robaków na szkiełku mikroskopowym (środkowy rząd).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do pomiaru ruchu w czasie rzeczywistym i prostych zachowań lokomotorycznych w mikroskopijnych organizmach, takich jak nicienie, które nie wymaga użycia mikroskopów. 8 Takie podejście metodologiczne można również wykorzystać do badania wielu mikroskopijnych organizmów, takich jak protisty. Ta metoda jest ograniczona jedynie długością fali użytego światła. Organizm nie powinien być mniejszy niż długość fali światła. Oprócz oszczędności kosztów i przenośności potrzebnego sprzętu, jedną z kluczowych zalet tego podejścia jest możliwość pomiaru zachowania w czasie rzeczywistym i w trzech wymiarach, bez wąskich ograniczeń płaszczyzn obrazu pod mikroskopem. Dzięki tej technice możliwe jest również zbadanie wpływu sił grawitacyjnych lub wielu innych warunków na zachowanie, których nie można zbadać przy użyciu metod opartych na mikroskopie. W ten sposób możemy lepiej zrozumieć naturalne zachowania lokomotoryczne mikroorganizmów uwolnionych z ograniczeń kropelek mikroskopowych lub specjalistycznych komór mikroprzepływowych (Park i in., 2008). 10

Brak informacji o fazie we wzorze dyfrakcyjnym nie pozwala na bezpośrednie odzyskanie obrazu odpowiadającego obiektowi dyfrakcyjnemu, ponieważ wzór dyfrakcyjny dalekiego pola jest proporcjonalny do kwadratu wartości bezwzględnej transformaty Fouriera. W związku z tym obliczamy wzory dyfrakcyjne na podstawie obrazów robaków, aby można je było dopasować do wzorów dyfrakcyjnych swobodnie pływających nicieni (ryc. 6).

Metoda ta przyniosła wyniki dla naprawdę swobodnego pływania C. elegans i może być stosowana do dowolnych mikroskopijnych gatunków, które manewrują w optycznie przezroczystym środowisku, takim jak woda lub wiele różnych roztworów jonowych. Konwencjonalne mikroskopy pozwalają na badania tylko z głębokością ogniskową rzędu mikrometrów. 11 Wynika to z ograniczonej głębi ostrości podczas ustawiania ostrości światła:

Degrees of freedom formula, DoF ≈ 2Nc(m+1)/m^2, equation representation
gdzie liczba f N ma odwrotny związek z okręgiem rozmycia (c), tak że krótka ogniskowa wiąże się z dużym c.12,13 Chociaż ta metoda dyfrakcyjna z pewnością nie zastępuje konwencjonalnej mikroskopii, jest w stanie szybko dostarczyć wyniki ilościowe, dzięki czemu można manipulować gatunkami nawet w czasie rzeczywistym przy niskich kosztach. Wzory dyfrakcyjne można uzyskać za pomocą dowolnego wskaźnika laserowego. Wzory dyfrakcyjne można filmować w zmniejszonej rozdzielczości czasowej za pomocą zwykłej kamery cyfrowej. Chociaż użytkownik może nie mieć łatwo dostępnego mikroskopu lub fotodiody, kluczowe części tego eksperymentu, takie jak pomiar częstotliwości młócenia i ocena wzorów dyfrakcyjnych, można wykonać przy wyjątkowo niskich kosztach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Tzlilowi Rozenblatowi, Alexandrze Bello i Karlowi Spuhlerowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund oraz nagrodę NASA # NX09AU90A, nagrodę National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) nagrodę # 0630388 oraz nagrodę NSF # 1058385.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
543 nm HeNe LaserMelles GriotLGX1Można użyć dowolnego lasera w zakresie widzialnym o mocy mniejszej niż 5 mW.
2 Aluminiowe lusterka na przedniej powierzchniThorlabsPF10-03-F01
Szybka kamera ExilimCasio
Kuweta kwarcowaStarna Cells21/G/5
LoggerPro (oprogramowanie)Noniuszhttp://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8Wolframhttp://www.wolfram.com/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans. J. Exp. Biol. 210, (2007).
  2. James, J. F. A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , Cambridge Univ. Press. (1995).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).
  4. Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue. Nature. 440, 684-687 (2006).
  5. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. ed, W. ormB. ook, , (2006).
  6. Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).
  7. Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction. O. J. Biphys. , (2012).
  8. Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).
  9. Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).
  10. Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment. PLOS One. 3, e2550(2008).
  11. Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).
  12. Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
  13. Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nematode LocomotionC elegansDiffraction Pattern AnalysisThrashing Frequency MeasurementOptical SetupQuartz CuvetteHigh Speed CameraPhoto DiodeData Analysis

Powiązane artykuły