Przygotowanie i inaktywacja patogenów w koncentratach płytek krwi z podwójnej dawki warstwy leukocytowej z wykorzystaniem systemu INTERCEPT Blood System

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisano proces stosowany w Szpitalu Uniwersyteckim w Örebro do otrzymywania koncentratów płytkowych z warstwy leukocytarnej o podwójnej dawce, przygotowywanych z donacji krwi pełnej i poddawanych inaktywacji patogenów za pomocą systemu INTERCEPT Blood System. Jakość jednostek płytkowych in vitro oceniano w ciągu 7 dni przechowywania.

Streszczenie

Centra krwiodawstwa mierzą się z wieloma wyzwaniami, w tym z maksymalizacją wydajności produkcji z otrzymanych donacji produktów krwi oraz zapewnieniem najwyższego możliwego poziomu bezpieczeństwa pacjentów poddawanych transfuzji, w tym ochrony przed chorobami przenoszonymi przez krew. Musi być to realizowane w sposób odpowiedzialny finansowo, minimalizujący koszty operacyjne, w tym między innymi koszty materiałów zużywalnych, sprzętu, utylizacji odpadów oraz personelu.

Dostępnych jest kilka metod wytwarzania koncentratów platelets do transfuzji. Jedną z najczęstszych jest metoda warstwy leukocytarnej (buffy coat), w której pojedyncza terapeutyczna jednostka platelets (≥ 2,0 x10¹¹ platelets na jednostkę lub zgodnie z lokalnymi przepisami) jest przygotowywana poprzez łączenie warstwy leukocytarnej z maksymalnie sześciu donacji krwi pełnej. Procedura wytwarzania platelets pochodnych z krwi pełnej w „podwójnej dawce” została opracowana dopiero niedawno.

W niniejszej pracy przedstawiono nową metodę przygotowywania podwójnych dawek koncentratów krwineczek płytkowych pochodzących z krwi pełnej z puli 7 warstw leukocytarnych (buffy coats), a następnie poddawanie tych jednostek o podwójnej dawce działaniu systemu INTERCEPT Blood System w celu inaktywacji patogenów. System INTERCEPT został opracowany w celu inaktywacji wirusów, bakterii, pasożytów oraz zanieczyszczających białych krwinek dawcy, które mogą występować w donowanej krwi. Połączenie systemu INTERCEPT z metodą podwójnej dawki z warstw leukocytarnych poprzez zastosowanie zestawu do przetwarzania INTERCEPT z podwójnymi pojemnikami do przechowywania (tzw. „zestaw DS”), pozwala centrom krwiodawstwa na przetwarzanie każdej jednostki o podwójnej dawce w jednym zestawie do inaktywacji patogenów, co maksymalizuje bezpieczeństwo pacjenta przy jednoczesnej minimalizacji kosztów. Metoda podwójnej dawki z warstw leukocytarnych wymaga mniejszej liczby warstw leukocytarnych i redukuje zużycie materiałów eksploatacyjnych nawet o 50% (np. zestawów do pulowania, zestawów filtracyjnych, roztworów dodatkowych do płytek oraz sterylnych złączy) w porównaniu z przygotowaniem i przetwarzaniem jednostek płytek o pojedynczej dawce z warstw leukocytarnych. Inne oszczędności kosztów obejmują mniejszą ilość odpadów, rzadszą konserwację sprzętu, niższe zapotrzebowanie na energię, zmniejszenie czasu pracy personelu oraz niższy koszt pobrania w porównaniu z techniką aferezy.

Protokół

1. Pobieranie krwi pełnej

1. Pobrać krew pełną od ochotników do zestawów do pobrań górnych/dolnych o pojemności 450 ml, zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi pobierania krwi.
2. Krew pełną przechowywać przez co najmniej 2 hr na płycie chłodzącej przed wirowaniem i separacją.

2. Przygotowanie warstwy buffy coat

1. Wirować krew pełną z zastosowaniem silnego wirowania, aby rozdzielić krew na trzy warstwy: erytrocyty, warstwę leukocytarną (buffy coat) i osocze. Zastosowane parametry wirowania to 4 880 RCF przez 11 min w temperaturze 22±2 °C.
2. Użyć automatycznego separatora krwi, aby przenieść osocze do górnej torby satelitarnej, a erytrocyty (RBC) do dolnej torby satelitarnej, pozostawiając warstwę leukocytarną w pojemniku do pobierania. Docelowe średnie wartości objętości i hematokrytu dla warstwy leukocytarnej wynoszą odpowiednio około 48 ml i 37%.
3. Warstwy leukocytarne przechowywać przez noc na agitatorze do płytek w temperaturze 22±2 °C.

3. Łączenie warstw leukocytowych

1. Sterylnie połącz 7 warstw leukocytarnych (buffy coats) i 300 ml roztworu dodatku do płytek SSP+ (PAS) w konfiguracji szeregowej z liniami równoległymi w celu skrócenia długości układu; PAS powinien znajdować się na górze układu. Zaciśnij zacisk na linii między PAS a pierwszą warstwą leukocytarną.
2. Otwórz sterylne połączenia między jednostkami warstw leukocytarnych i pozwól warstwom leukocytarnym spłynąć do ostatniego pojemnika.
3. Otwórz zgrzew i zacisk między PAS a pierwszą warstwą leukocytarną. Pozwól jednej trzeciej roztworu dodatku przepłukać kolejno każdy z pojemników z warstwą leukocytarną. Powtórz tę czynność jeszcze 2 razy, używając za każdym razem połowy pozostałego PAS.
4. Średnia objętość puli warstw leukocytarnych powinna wynosić około 600 ml. Jeśli osiągnięto docelową objętość i hematokryt poszczególnych warstw leukocytarnych, stosunek plazmy wyniesie 32 - 47%, co jest wymagane dla późniejszej w procesie obróbki inaktywacji patogenów INTERCEPT.
5. Wyrzuć puste pojemniki po SSP+ i warstwach leukocytarnych.
6. Aby uzyskać optymalny odzysk płytek, przechowuj pulę na agitatorze przez 1 hr przed wirowaniem.
7. Sterylnie połącz pojemnik do przechowywania płytek z zintegrowanym filtrem do leukoredukcji z pulą warstw leukocytarnych.
8. Przeprowadź „miękkie wirowanie” (soft spin) puli warstw leukocytarnych, aby oddzielić erytrocyty od zawiesiny płytek (462 RCF przez 9 min, 20 sec). Przenieś zawiesinę płytek za pomocą automatycznego separatora krwi przez filtr do leukoredukcji do pojemnika do przechowywania płytek.
9. Opisane wcześniej wymagania procesowe zapewniają, że zawiesina płytek spełnia specyfikacje obróbki INTERCEPT: objętość 300 ml - 420 ml, dawkę płytek 2.5-7.0 x 10¹¹ oraz liczbę erytrocytów ≤ 4 x 10⁶/ml.

4. Obróbka INTERCEPT

1. Wykonaj zabieg INTERCEPT przed końcem Dnia 1 po pobraniu (dzień 0 to dzień pobrania).
2. Wyjmij zestaw do przetwarzania INTERCEPT z podwójnymi pojemnikami do przechowywania z przezroczystej plastikowej torebki.
3. Wykonaj sterylne połączenie pojemnika z zawiesiną płytek z drenem pojemnika z amotosalenem w zestawie do przetwarzania INTERCEPT.
4. Oznakuj pojemniki do przechowywania zestawu do przetwarzania INTERCEPT odpowiednią identyfikacją produktu krwi zgodnie z lokalnymi wymogami.
5. Zawieś płytki i przełam najpierw dolną kaniulę w pojemniku z amotosalenem, umożliwiając przepływ roztworu amotosalenu do pojemnika do naświetlania. Przełam górną kaniulę w pojemniku z amotosalenem, umożliwiając przepływ płytek przez pojemnik z amotosalenem do pojemnika do naświetlania.
6. Delikatnie wymieszaj mieszaninę płytek i amotosalenu, a następnie usuń powietrze z pojemnika do naświetlania do pojemnika z amotosalenem.
7. Wciśnij niewielką ilość mieszaniny płytek do drenu, wypełniając około 4 cm drenu. Zapewnia to, że płytki zarówno w drenie, jak i w pojemniku do naświetlania, zostaną poddane zabiegowi inaktywacji patogenów.
8. Uszczelnij dren pomiędzy pojemnikiem do naświetlania a pojemnikiem z amotosalenem. Pozostaw nie więcej niż około 4 cm drenu wystającego z pojemnika do naświetlania. Usuń i zutylizuj puste pojemniki po płytkach i amotosalenie oraz zamknij zaciski na woreczkach do pobierania próbek.
9. Umieść zestaw do przetwarzania w naświetlaczu, tak aby pojemnik do naświetlania znajdował się w dużej komorze po lewej stronie, a organizer w mniejszej komorze po prawej stronie.
10. Używając ręcznego czytnika kodów kreskowych, wprowadź do naświetlacza identyfikator donacji, kod produktu oraz numer partii zestawu do przetwarzania. Zamknij metalową pokrywę, a gdy pojawi się komunikat na interfejsie graficznym naświetlacza, zamknij szufladę. Naciśnij „Start”, aby rozpocząć naświetlanie.
11. Po naświetlaniu wyjmij zestaw do przetwarzania z naświetlacza. Naświetlacz automatycznie wydrukuje raport z zabiegu dla przetworzonej jednostki (jednostek) płytek.
12. Wyjmij pojemniki z organizera i zawieś płytki oraz zestaw do przetwarzania, przełam kaniulę przy wylocie pojemnika do naświetlania i pozwól płytkom spłynąć do pojemnika z urządzeniem do adsorpcji związków (CAD).
13. Uważając, aby nie zegiąć wkładu CAD, usuń powietrze z pojemnika CAD do pojemnika do naświetlania za pomocą ekstraktora osocza.
14. Uszczelnij dren w pobliżu otworu wlotowego pojemnika CAD. Usuń i zutylizuj pusty pojemnik do naświetlania.
15. Umieść pojemnik CAD z przymocowanymi pojemnikami do przechowywania na agitatorze płytek na co najmniej 6 hr, ale nie więcej niż 16 hr. Spowoduje to redukcję pozostałego amotosalenu do stężenia ≤ 2 μM.
16. Po zabiegu CAD zdejmij jednostki płytek z agitatora. Zawieś płytki. Przełam kaniulę i pozwól płytkom spłynąć do pojemników do przechowywania.
17. Usuń powietrze z pojemników do przechowywania do pojemnika CAD. Pozostaw resztę koncentratu płytek, aby spłynęła grawitacyjnie z powrotem do pojemników do przechowywania. Uszczelnij dren powyżej rozgałęźnika Y i usuń pusty pojemnik CAD.
18. W razie potrzeby ponownie rozdziel objętość pomiędzy pojemnikami do przechowywania. Korekty objętości wykonuje się poprzez ważenie pojemników do przechowywania. Uszczelnij dren do każdego pojemnika do przechowywania kilka centymetrów powyżej wlotu pojemnika; ułatwia to pobranie sterylnej próbki z produktu końcowego, jak opisano w punkcie 5.2.

5. Pobieranie próbek produktu

1. W przypadku rutynowych testów kontroli jakości (QC), próbki z końcowych pojemników do przechowywania można pobrać raz, korzystając z worka do pobierania próbek znajdującego się na pojemnikach. W tym celu należy upewnić się, że jednostka płytek krwi jest dobrze wymieszana, a następnie otworzyć zacisk worka i kilkakrotnie go ścisnąć. Po napełnieniu worka płytkami krwi należy uszczelnić dren. Przenieść próbkę płytek krwi do odpowiedniej probówki laboratoryjnej i niezwłocznie przeprowadzić analizy.
2. Aby pobierać próbki w wielu punktach czasowych podczas przechowywania, na przykład w badaniu walidacyjnym, należy sterylnie podłączyć nowy pojemnik do pobierania próbek do drenu pojemnika do przechowywania płytek krwi. Przed przeniesieniem do pojemnika do pobierania próbek należy upewnić się, że płytki krwi są dobrze wymieszane.

6. Ocena funkcji in vitro

1. W ramach niniejszego badania walidacyjnego ocenę in vitro przeprowadzono po zastosowaniu CAD (w dniu 1. lub 2., w zależności od czasu trwania CAD), a następnie ponownie w dniu 4. (lub 5.) oraz 7. Pomiary in vitro obejmowały objętość, liczbę płytek krwi, pH, gazy krwi (pO₂, pCO₂), glukozę, mleczan oraz zjawisko swirlingu.
2. Objętość określano na podstawie masy, przyjmując gęstość płytek w roztworze dodatku równą 1,01 g/ml.
3. Zanieczyszczenie hemoglobiną oceniano wizualnie, porównując próbki z wzorcem kolorystycznym.
4. Zjawisko swirlingu oceniano wizualnie.
5. Metodykę pozostałych analiz przedstawiono w „Tabeli sprzętu”.

7. Reprezentatywne wyniki

Proces otrzymywania podwójnej dawki płytek krwi z warstwy leukocyplazmatycznej (buffy coat) rozpoczyna się od przygotowania pojedynczych warstw leukocyplazmatycznych, które spełniają docelowe specyfikacje dotyczące objętości i hematokrytu. Ponieważ pomiar hematokrytu poszczególnych warstw leukocyplazmatycznych podczas końcowej walidacji procesu nie jest praktyczny, w pierwszej kolejności podjęto oddzielne działania w celu optymalizacji warstw leukocyplazmatycznych, aby zapewnić powtarzalne osiąganie docelowej objętości i hematokrytu. Jak pokazano w Tabeli 1, zoptymalizowane warstwy leukocyplazmatyczne wypadały korzystnie w porównaniu z wartościami docelowymi zarówno dla objętości, jak i hematokrytu, wynosząc odpowiednio 46 ± 2 ml oraz 37 ± 3%.

Po połączeniu objętość i hematokryt puli warstwy lekocytarnej powinny wynosić odpowiednio około 600 ml i 20% przed odwirowaniem przy niskich obrotach. Jak pokazano w Tabeli 2, nasze pule warstwy lekocytarnej wynosiły średnio 615 ± 5 ml, a hematokryt średnio 19 ± 1%.

Centryfugowanie w trybie soft spin pozwala na uzyskanie koncentratu płytek w podwójnej dawce, który spełni wymagania wejściowe dla inaktywacji patogenów z wykorzystaniem zestawu do przetwarzania INTERCEPT Blood System DS. Kluczowe parametry wejściowe dla obróbki systemem INTERCEPT obejmują objętość, liczbę płytek krwi, stosunek plazmy oraz zawartość RBC. Ponadto dążymy do odzyskania ≥ 75% płytek w koncentracie płytek w porównaniu z pulą buffy coat. Zgodnie z lokalnymi wymogami, zanieczyszczenie leukocytami (WBC) musi wynosić <1x10⁶/unit. Koncentraty płytek w naszej walidacji spełniły kluczowe parametry dla obróbki systemem INTERCEPT, a także cele dotyczące zanieczyszczenia WBC i odzysku płytek, co przedstawiono w Tabeli 3.

Proces INTERCEPT służący do inaktywacji patogenów jest przeprowadzany na podwójnej dawce koncentratu platelets przy użyciu pojedynczego zestawu do przetwarzania INTERCEPT. Zestaw do przetwarzania zawiera dwa zintegrowane pojemniki do przechowywania, które umożliwiają rozdzielenie przetworzonej jednostki na dwie indywidualne terapeutyczne dawki platelets po zakończeniu procesu inaktywacji patogenów. Wytyczne europejskie wymagają, aby 75% badanych jednostek zawierało ≥ 200x10⁹ platelets na dawkę terapeutyczną1; lokalne wymogi w Szwecji stanowią, że 75% badanych jednostek musi zawierać >240x10⁹ platelets na dawkę. Po zastosowaniu metody INTERCEPT średnia zawartość platelets wynosiła 265 ± 22 x10⁹ (n=24). Ponadto 88% jednostek spełniło lub przekroczyło wartość 240x10⁹ platelets na dawkę terapeutyczną, co mieści się w granicach zarówno wytycznych europejskich, jak i szwedzkich przepisów. Ilustrację procesu przygotowania podwójnej dawki buffy coat oraz procesu obróbki INTERCEPT przedstawiono odpowiednio na Rysunkach 1 i 2.

W ramach tej walidacji zmierzono charakterystykę in vitro koncentratów platelets po zastosowaniu metody INTERCEPT (t.j. po rozdzieleniu do poszczególnych pojemników do przechowywania); parametry mierzono przez 7 dni przechowywania. Obliczono średnią i odchylenie standardowe dla dawki platelets, pH, pO₂, pCO₂, produkcji mleczanu oraz zużycia glukozy.

Rycina 3 przedstawia średnią początkową dawkę płytek w koncentracie płytek o podwójnej dawce przed obróbką INTERCEPT oraz średnią dawkę płytek w każdym z rozdzielonych produktów po obróbce INTERCEPT w ciągu 7 dni przechowywania. Strata płytek podczas przechowywania wyniosła około 9%. Redukcja ta nie różni się od oczekiwanej straty płytek podczas przechowywania konwencjonalnych koncentratów płytek.²

Tabela 4 podsumowuje charakterystykę in vitro płytek INTERCEPT po obróbce i rozdzieleniu na pojedyncze jednostki.

Zgodnie z wymogami europejskimi, pH płytek krwi musi pozostawać powyżej 6,4 do końca okresu przydatności do użycia. Podczas przetwarzania pH koncentratów płytek krwi nieznacznie spada w zależności od stężenia płytek, objętości oraz przepuszczalności gazowej pojemnika do przechowywania płytek. Rysunek 4 przedstawia pH rozdzielonych produktów płytkowych w ciągu 7 dni przechowywania. Podczas przechowywania pH jest stabilne i utrzymuje się na poziomie zgodnym z wymogami przetwarzania.

Jak pokazano na rycinach 5A i 5B, zużycie O₂ oraz produkcja CO₂ przez płytki krwi wskazują na utrzymujące się oddychanie komórkowe płytek INTERCEPT w pojemniku PL2410 podczas 7 dni przechowywania. Ryciny 6A i 6B przedstawiają poziomy mleczanu i glukozy w ciągu 7 dni przechowywania. Zużycie glukozy i produkcja mleczanu przez płytki krwi są ze sobą spójne w ciągu 7 dni przechowywania. W 5 jednostkach poziom glukozy wynosił mniej niż 1.11 mmol/l (dolna granica oznaczalności testu glukozy).

Przygotowanie warstwy leukocytowej oraz walidacja łączenia jednostek pozwoliły na uzyskanie koncentratów płytek krwi spełniających kryteria wejściowe dla procesu INTERCEPT; w szczególności w zakresie objętości, liczby płytek krwi, stosunku osocza oraz zanieczyszczenia erytrocytami. Końcowe jednostki spełniały kryteria walidacyjne przez 7 dni przechowywania, w tym w odniesieniu do dawki płytek krwi oraz pH.

Parametr	Zakres docelowy	Średnie wyniki ± SD
Objętość (ml)	~ 48	46 ± 2
Hematokryt (%)	~ 37	37 ± 3
Czas oczekiwania przed łączeniem	Przez noc na mieszadle	Przez noc na mieszadle

Tabela 1. Charakterystyka poszczególnych warstw leukocytarnych (n=19).

Parametr	Zakres docelowy	Średnia wyników ± SD
Objętość (ml)	~ 600	615 ± 5
Hematokryt (%)	~ 20	19 ± 1
Czas oczekiwania przed wirowaniem	1 hr na mieszadle	1 hr na mieszadle

Tabela 2. Charakterystyka pul warstw leukocytarnych (n=12).

Parametr	Wartość docelowa	Wyniki średnia ± SD
Objętość (ml)	370 - 420	404 ± 8
Liczba płytek krwi (x109/jednostkę)	250 - 700	577 ± 62
Średnia odzyskowalność płytek krwi (%)	≥ 75	75 ± 4
Stosunek plazmy (%)	32 - 47	38 ± 1
RBC (x106/ml)	≤ 4	1.2 ± 0.4
WBC (x106/jednostkę)	≤ 1	0.11 ± 0.1
Czas przechowywania przed INTERCEPT (hr)	≤ koniec dnia 1	≤ koniec dnia 1

Tabela 3. Charakterystyka podwójnych dawek koncentratów płytkowych (n=12).

	Średnia ± SD	Min	Max
Objętość (ml)	199 ± 16	182	236
Liczba płytek krwi (x109/jednostkę)	265 ± 22	225	292
pH (22 °C)	6.9 ± 0.1	6.8	7.0
pO2 (kPa)	21.4 ± 4.8	12.8	27.3
pCO2 (kPa)	4.3 ± 0.4	3.3	4.9
Mleczan (mmol/l)	9.1 ± 1.7	6.8	12.4
Glukoza (mmol/l)	5.3 ± 0.9	3.7	6.5

Tabela 4. Charakterystyka płytek krwi poddanych działaniu preparatu INTERCEPT w dniu 1/2 (jednostki pojedyncze, n=24).

Rycina 1. Produkcja podwójnej dawki koncentratu krwineczek płytkowych z puli 7 warstw leukocytarnych.

Rysunek 2. Inaktywacja patogenów w podwójnej dawce koncentratu krwineczek płytkowych za pomocą systemu INTERCEPT Blood System.

Rycina 3. Średnia dawka płytek krwi przed i przez 7 dni po zastosowaniu metody INTERCEPT (n=12 przed INTERCEPT; n=24 po INTERCEPT).

Rycina 4. Średnie pH płytek krwi ±SD po zastosowaniu INTERCEPT (n=24).

Rysunek 5A. Średnie pO₂ ±SD po zastosowaniu metody INTERCEPT (n=24).

Rycina 5B. Średnie pO₂ ±SD po zastosowaniu INTERCEPT (n=24).

Rysunek 6A. Średnie poziomy mleczanu ±SD po zastosowaniu preparatu INTERCEPT (n=24).

Rycina 6B. Średnie poziomy glukozy ±SD po leczeniu INTERCEPT (n=24).

Dyskusja

Przygotowanie płytek krwi z warstwy leukocytaresowej (buffy coat) wymaga kilku etapów przetwarzania, które generują koszty po pobraniu, w tym czas pracy personelu, materiały eksploatacyjne, sprzęt oraz utylizację odpadów, co musi zostać uwzględnione w całkowitym koszcie wytworzenia jednostek płytek krwi. Poprawa wydobycia płytek z każdej warstwy leukocytaresowej (poprzez optymalizację objętości warstwy leukocytaresowej i hematokrytu) umożliwia produkcję jednostki płytek krwi o podwójnej dawce z puli siedmiu warstw leukocytaresowych. Przy zastosowaniu tej optymalizacji liczba warstw leukocytaresowych wymaganych do wytworzenia określonej liczby dawek płytek może zostać zmniejszona, co poprawia ogólną utylizację warstw leukocytaresowych i umożliwia produkcję dodatkowych koncentratów krwinek płytkowych (PC). Czas pracy personelu, jak również koszty materiałów eksploatacyjnych i sprzętu, takich jak zestawy do łączenia, roztwór dodatkowy do płytek krwi, sterylne łączniki waflowe, zestawy filtracyjne oraz procedury wirowania, zostają zredukowane o maksymalnie 50%. Oprócz optymalizacji produkcji płytek i redukcji powiązanych kosztów, ta metoda łączenia pozwala na uzyskanie koncentratu krwinek płytkowych (PC), który spełnia wymagania wejściowe do zastosowania z zestawem do przetwarzania w podwójnym pojemniku do przechowywania INTERCEPT, co pozwala nam zapewnić również zwiększoną ochronę odbiorców transfuzji.

System INTERCEPT Blood System do inaktywacji patogenów wykorzystuje amotosalen oraz światło ultrafioletowe A (UVA) do kowalencyjnego sieciowania DNA i RNA, co zapobiega replikacji kwasów nukleinowych i sprawia, że patogeny nie są w stanie wywoływać chorób.³ Skutecznie inaktywuje on szerokie spektrum patogenów, w tym wirusy, bakterie, pasożyty oraz zanieczyszczające krew leukocyty dawcy.^4-6 INTERCEPT stanowi alternatywę dla obecnego modelu testowania w kierunku nowych patogenów, który historycznie wiąże się ze znacznym opóźnieniem podczas opracowywania nowego testu i ostatecznie wymaga dużych nakładów finansowych na jego wdrożenie po udostępnieniu.^7,8 Może on również stanowić alternatywę dla redundantnych środków bezpieczeństwa, takich jak detekcja bakterii⁹ i irradiacja gamma.^10-12 Dodatkowo INTERCEPT pozwala nam na przetwarzanie jednostek płytek krwi w podwójnej dawce, co zwiększa wydajność produkcji i pomaga nam w przestrzeganiu budżetów.

Metodę INTERCEPT oraz metodę podwójnej dawki warstwy leukocytowej (buffy coat) można dostosować do różnych standardów pracy centrów krwiodawstwa. Przykładowo, objętość pobranej krwi pełnej można zwiększyć do 500 ml; pobrane jednostki mogą być również przechowywane przez noc w temperaturze 22 °C przed rozdzieleniem. Dodatkowo możliwe jest zastosowanie alternatywnej metody łączenia warstw leukocytowych (np. metody „octopus” zamiast metody „train”) oraz/lub wykorzystanie urządzenia zautomatyzowanego (np. TACSI) do drugiego wirowania i oddzielenia zawiesiny płytek krwi od pozostałych erytrocytów.

Jeśli wymagana jest zwiększona zawartość płytek krwi, dostępne są różne techniki, w tym wstępna selekcja dawców na podstawie liczby płytek, inkubacja krwi pełnej przez noc, dostosowanie parametrów wirowania lub wykorzystanie puli 8 warstw leukocytowych zamiast 7.

Ze względu na ograniczenia w aktualnie dostępnych zestawach do łączenia oraz pojemność koszy wirówki, całkowita objętość puli warstw leukocytowych (buffy coat) powinna wynosić około 600 ml. Proces i ustawienia wirowania opisane w niniejszym protokole zostały zoptymalizowane w celu uzyskania produktu spełniającego parametry INTERCEPT dla puli składającej się z 7 warstw leukocytowych. Ustawienia wirowania muszą zostać zmodyfikowane, jeśli zmieni się liczba warstw leukocytowych w puli.

W niektórych krajach minimalna dawka płytek krwi jest wyższa, a wymagania dotyczące kontroli jakości (QC) są bardziej rygorystyczne niż w Szwecji. W związku z tym nasze wyniki mogą nie być uniwersalne. W tych krajach podwójna dawka koncentratu płytek krwi (PC) przed opracowaniem metodą INTERCEPT będzie musiała zawierać większą liczbę płytek, aby spełnić lokalne wymogi po zastosowaniu procesu INTERCEPT i rozdzieleniu. Ponieważ maksymalna zawartość płytek oraz objętość opracowania dla metody INTERCEPT wynoszą odpowiednio 7x10¹¹ płytek i 420 ml, odsetek jednostek, które przekraczają wymagania procesu INTERCEPT lub mają niewystarczającą zawartość płytek, aby można było je rozdzielić na dwie dawki terapeutyczne, będzie się różnić w zależności od takich czynników, jak lokalne wymagania dotyczące dawki płytek, kryteria QC, wyniki optymalizacji warstwy leukocytarnej (buffy coat) oraz stabilność produkcji.

Jeśli podwójna dawka PC przekracza wymagania przetwarzania INTERCEPT, można ją dostosować ręcznie, aby spełnić te wymagania, a następnie poddać obróbce. W nielicznych przypadkach, gdy pula 7 warstw leukocytowych (buffy coat) dostarcza niewystarczającą liczbę płytek do uzyskania produktu o podwójnej dawce po zastosowaniu INTERCEPT, decydujemy się nie przeprowadzać obróbki INTERCEPT. Alternatywnie, inne centra krwiodawstwa mogą zdecydować o poddaniu PC obróbce za pomocą zestawu INTERCEPT do pojedynczej dawki (i.e. zestawu do dużych objętości) i przechowywaniu PC jako pojedynczej, większej dawki terapeutycznej, przeprowadzając w ten sposób inaktywację patogenów we wszystkich jednostkach. Aby zapewnić spełnienie wymagań QC oraz inaktywację patogenów w jak największej liczbie jednostek płytek, wybieramy warstwy leukocytowe na podstawie liczby płytek u dawców, co po połączeniu w puli zapewni minimalną zawartość 5.6x10¹¹ płytek w puli. Gwarantuje to wystarczającą liczbę płytek do wytworzenia dwóch dawek terapeutycznych po obróbce INTERCEPT.

Nasza walidacja wykazuje, że 7 jednostek warstwy leukocytarnej (buffy coat) uzyskanych z krwi pełnej może zostać z powodzeniem połączonych i poddanych procesowi INTERCEPT dla koncentratów krwineczek płytkowych, co skutkuje otrzymaniem 2 produktów krwineczek płytkowych z inaktywowanymi patogenami, które spełniają kryteria akceptacji dla produkcji (wymagania szwedzkie i wytyczne europejskie) oraz dla wsparcia pacjentów wymagających transfuzji krwineczek płytkowych zgodnie z wytycznymi praktyki klinicznej i standardowymi metodami infuzji krwineczek płytkowych w Szwecji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pobieranie krwi pełnej, separacja pierwotna i przygotowywanie koncentratu platelets
Zestaw do pobierania krwi	Fenwal	R6485	Zestaw górny/dolny
Automatyczny ekstraktor komponentów	Fenwal	Optipress-II
System mieszania i balansowania krwi	Baxter	Easymix V3
Zestaw do filtracji leukocytów z koncentratu krwineczek* *(Alternative depending on specific context: Zestaw do leukoredukcji płytek krwi)	Fenwal	K4R7042
Wirówka	Hettich	Roto Silenta 63 RS	Wersja 5.5
Roztwór dodatku do koncentratu płytek krwi - SSP+	MacoPharma	SSP2030U	300 ml
Sterylna zgrzewarka do rurek	Terumo	T-SCD
leczenie INTERCEPT &przechowywanie
zestaw do obróbki INTERCEPT	Cerus	INT2503	zestaw do podwójnego przechowywania (DS)
Iluminator INTERCEPT	Cerus	INT100
Zestaw próbek PC	Fenwal	FTX 1122
Inkubator	Helmer	PC2200/PC3200
Mieszadło	Helmer	PF48H/PF96H
Ocena in vitro Funkcja płytek krwi
Analizator gazometrii krwi	Radiometr	ABL 735	Stosowane do pomiaru pH, gazometrii krwi i poziomu mleczanów
Układ chemiczny	Ortho Clinical Diagnostics	Vitros 5.1	Stosowane do pomiaru poziomu glukozy
Analizator hematologiczny	Boule Medical AB	Medonic CA620-Cellguard	Stosowane do pomiaru liczby płytek krwi
Cytometr przepływowy	BD	FACSCanto	Stosowane do pomiaru liczby białych krwinek