Artykuł metodologiczny

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 lutego 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju jelit1-5, fizjologii6-11, chorób12-16 oraz oddziaływań między gospodarzem a mikrobami17-25. Podejścia eksperymentalne w badaniu biologii jelit często wymagają wprowadzenia wybranych materiałów in vivo do światła jelita. W modelu larwalnym danio pręgowanego osiąga się to zazwyczaj poprzez zanurzenie ryb w roztworze wybranego materiału lub poprzez wstrzyknięcie go przez ścianę brzuszną. Przy zastosowaniu metody zanurzeniowej trudno jest dokładnie monitorować lub kontrolować drogę lub czas dostarczania materiału do jelit. Z tego powodu ekspozycja przez zanurzenie może powodować niezamierzoną toksyczność i inne efekty w tkankach pozajelitowych, co ogranicza potencjalny zakres ilości materiałów, które można dostarczyć do jelita. Ponadto ilość materiału przyjętego podczas ekspozycji przez zanurzenie może znacznie różnić się między poszczególnymi larwami26. Choć problemy te nie występują podczas bezpośredniego wstrzykiwania przez ścianę brzuszną, prawidłowe wstrzyknięcie jest trudne i powoduje uszkodzenia tkanek, które mogą wpłynąć na wyniki eksperymentalne. Przedstawiamy metodę mikrozondującej aplikacji doustnej (mikrogavage) u larw danio pręgowanego. Celem tej metody jest zapewnienie bezpiecznego, skutecznego i spójnego sposobu dostarczania materiałów bezpośrednio do światła przedniej części jelita u larwalnych danio pręgowanych przy kontrolowanym czasie podania. Mikrogavage wykorzystuje standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię, powszechnie dostępną w większości laboratoriów prowadzących badania nad danio pręgowanym. Po odpowiednim ustawieniu ryb w metylocelulozie, zabieg można przeprowadzić szybko, w tempie około 7-10 ryb/min, a przeżywalność po zabiegu wynosi blisko 100% w zależności od podanego materiału. Wykazujemy również, że mikrogavage umożliwia załadowanie światła jelita wysokimi stężeniami materiałów, które są śmiertelne dla ryb w przypadku ekspozycji przez zanurzenie. Aby zademonstrować użyteczność tej metody, prezentujemy test mikrogavage z wykorzystaniem fluorescencyjnego dekstranu, który może być użyty do ilościowego określenia przejścia z światła jelita do przestrzeni pozajelitowych. Test ten może służyć do weryfikacji prawidłowego wykonania procedury mikrogavage, a także stanowi nową metodę badawczą u danio pręgowanego do sprawdzania szczelności bariery nabłonka jelitowego w różnych warunkach eksperymentalnych (np. manipulacje genetyczne, leczenie farmakologiczne lub ekspozycja na czynniki środowiskowe). Ponadto pokazujemy, jak mikrogavage może być wykorzystane do oceny motoryki jelit poprzez podanie fluorescencyjnych mikrosfer i monitorowanie ich późniejszego przemieszczania się. Mikrogavage można zastosować do dostarczania różnorodnych materiałów, takich jak żywe mikroorganizmy, wydzielane czynniki/toksyny mikrobiologiczne, środki farmakologiczne i sondy fizjologiczne. Dzięki tym możliwościom metoda mikrogavage u larwalnych danio pręgowanych ma potencjał do usprawnienia szerokiego zakresu dziedzin badawczych wykorzystujących system modelowy danio pręgowanego.

Protokół

W celu pozyskania larw do mikrogavage stosujemy opublikowane protokoły standardowej hodowli i utrzymania rybek zebrafish27. Do rozmnażania ryb wykorzystujemy głównie rozród naturalny, a ryby są utrzymywane w cyklu 14 h światła / 10 h ciemności. Niniejszy protokół został zoptymalizowany dla mikrogavage larw zebrafish w 6-7 dniach po zapłodnieniu (dpf). Przewidujemy, że metody te będą ogólnie stosowalne do młodszych i starszych stadiów rozwojowych po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Jeśli nie wskazano inaczej, wykorzystano szczep zebrafish typu dzikiego TL w 6 dpf, a ryb nie karmiono. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w wodzie systemowej pozyskanej z naszej konwencjonalnej zaprawy akwakultury zebrafish; można jednak zastosować dowolne odpowiednie medium dla zebrafish (np. medium dla embrionów lub gnotobiotyczne medium dla zebrafish (GZM)28). W niniejszym protokole termin „medium dla zebrafish” odnosi się do medium wybranego przez użytkownika.

1. Przygotowanie metylocelulozy, formy do gavage oraz wykonanie igły do mikrogavage

Dzień przed eksperymentem lub wcześnie w dniu jego przeprowadzenia należy przygotować metylocelulozę, formę agarozową do stabilizacji larw oraz igły do mikrogavage.

  1. Rozpuść 3 g metylocelulozy w 100 ml sterylnej wody dejonizowanej lub pożywki dla danio pręgowanych (w zależności od zastosowania), aby przygotować 3% roztwór. Do butelki włóż mieszadło magnetyczne, podgrzej wodę prawie do wrzenia i ustaw na płytce grzewczo-mieszającej w wysokiej temperaturze. Podczas mieszania powoli wsypuj metylocelulozę, aby zapobiec powstawaniu grudek. W ciągu dnia stopniowo zmniejszaj prędkość mieszania oraz temperaturę płytki, aż roztwór osiągnie temperaturę pokojową.
  2. Kontynuuj powolne mieszanie przez noc, aż metyloceluloza całkowicie się rozpuści. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy w szczelnym pojemniku.
  3. Przygotuj formę z 3% żelu agarozowego w szalce Petriego o średnicy 10 cm, używając plastikowego odlewu (Adaptive Science Tools, TU-1) zgodnie z instrukcjami producenta. Uszczelnij parafildem i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia, aby zapobiec wysychaniu. Przed eksperymentem ogrzej formę do temperatury pokojowej lub 28 °C. Formy agarozowe można zazwyczaj wykorzystać wielokrotnie.
  4. Wytwórz kilka igieł do gavage’u, wykorzystując kapilary z borokrzemianowego szkła oraz wyciągarkę do mikropipet Flaming Brown (FT330B) wyposażoną w szeroki włókno grzejne. Programy stosowane do produkcji igieł są następujące:
Typ igłyCiśnienieCiepłoPociągnijPrędkośćCzas
embrion50031510050200
zgłębniki (podawanie przez zgłębnik)50031512575200

Ponieważ włókna mogą różnić się w zależności od instrumentu, należy zapisać czas narastania (aktywny czas nagrzewania). W przypadku tego programu nasz czas narastania mieści się w przedziale 8,57-8,79 ms. Program ten pozwala na stworzenie krótszych i szerszych igieł niż tradycyjne igły do mikrowstrzykiwania (Rysunek 1). Ustawienia te mogą wymagać optymalizacji w przypadku korzystania z różnych wyciągaczy mikropipet.

2. Przycinanie, napełnianie i kalibracja igieł do mikrogavage

Uwaga*: Przycinanie igły jest krytycznym krokiem w tym protokole. Ponadto metody ładowania i kalibrowania igieł będą się różnić w zależności od rodzaju używanego urządzenia do mikroiniekcji. Zoptymalizowaliśmy ten protokół przy użyciu mikroiniektorów Drummond II, jednak przewidujemy, że będzie on możliwy do zastosowania również w innych instrumentach do mikroiniekcji po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Ponieważ zestawy do iniekcji oraz wyciągarki do igieł różnią się pomiędzy laboratoriami, istotne będzie zmierzenie i skalibrowanie objętości iniekcji (patrz sekcja 2.8).

  1. Igły są przycinane pod stereomikroskopem. Używamy stereomikroskopu Leica S6E ustawionego na powiększeniu 2,5x. Przy tym ustawieniu skala okularowa z 100 podziałkami ma długość 2 mm.
  2. Należy wyrównać końcówkę igły z końcem skala okularowej (znacznika podziałki 100) i przyciąć igłę za pomocą precyzyjnej pęsety zegarmistrzowskiej w odległości ok. 1 mm od końcówki (znacznik podziałki 48-50) (Ryc. 1A).
  3. Igła powinna mieć średnicę ok. 27-30 μm i być tępa. Należy zbadać końcówki igieł przy powiększeniu 100x. Igły ostre lub poszarpane zwiększają prawdopodobieństwo uszkodzeń podczas gavage i należy ich w miarę możliwości unikać.
  4. Alternatywnie, jeśli jest dostępny, można użyć mikrokuźni (microforge), aby lepiej kontrolować punkt cięcia igły oraz wypolerować termicznie końcówki igieł w celu usunięcia ostrych krawędzi (Ryc. 1B).
  5. Należy przygotować roztwór do gavage. W większości zastosowań przygotowujemy roztwór z dodatkiem 1:10 rozcieńczenia 0,5% roztworu czerwieni fenolowej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) (Sigma-Aldrich), aby zapewnić widoczność roztworu pod stereomikroskopem w celu monitorowania prawidłowego działania mikroinjektora oraz umiejscowienia roztworu do gavage w przedniej opuszce. Barwniki ładunkowe inne niż czerwień fenolowa nie zostały ocenione, ale mogą być stosowane.
  6. Należy przygotować igłę do gavage, wypełniając ją olejem mineralnym za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 25G 5/8. Następnie należy ją zamontować w urządzeniu do mikroiniekcji Nanoject II.
  7. Plastikową szalkę Petriego o średnicy 10 cm należy owinąć parafilmem, aby uzyskać płaską, wodoodporną powierzchnię, a następnie nanieść ok. 2 μl roztworu do gavage na parafilm. Należy ręcznie wypełnić igłę do gavage, uważając, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza w oleju mineralnym.
  8. Aby przetestować działanie mikroinjektora i skalibrować objętość wyrzutu, należy napełnić szalkę Petriego o średnicy 3 cm olejem mineralnym i wstrzykiwać do oleju, aż krople będą miały jednolity rozmiar. Średnicę kropli należy zmierzyć za pomocą skali okularowej lub funkcji pomiarowej w stereomikroskopie, jeśli jest dostępna. Następnie należy obliczyć objętość kropli (Wzór: V=4/3πr3). Spójność objętości między igłami została przedstawiona na wykresie (Ryc. 1C).
  9. Przed rozpoczęciem gavage należy przepłukać końcówkę igły poprzez wielokrotne zanurzanie w czystym medium dla danio pręgowanego, aby usunąć pozostałości oleju mineralnego. Olej mineralny jest bardzo gęsty i może spowodować uszkodzenie tkanek nabłonkowych, jeśli nie zostanie zmyty z końcówki igły.

3. Znieczulanie, mocowanie i gavage larw rybek danio

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu ogrzać formę agarozową w temperaturze pokojowej lub do 28 °C.
  2. Przygotować formę agarozową do gavage'u, pokrywając 3 rowki 3% metylocelulozą. Należy użyć takiej ilości metylocelulozy, która pokryje rowki i utrzyma ryby, ale nie będzie tak mała, aby szybko wyschła.
  3. W czystej płytce 6-dołkowej rozdzielić larwy danio-ostrobuzych dla każdej grupy eksperymentalnej do osobnych dołków, z których każdy zawiera 3,5-4,0 ml pożywki dla danio-ostrobuzych.
  4. Przygotować 3x roztwór trikainy (0,05% w/v) w odpowiedniej pożywce dla danio-ostrobuzych. Znieczulać ryby kolejno w każdym dołku, dodając do dołka z larwami taką samą objętość 3x trikainy, aby uzyskać końcowe stężenie 1,5x (0,025%), i delikatnie zamieszać ruchem wirowym.
  5. Gdy tylko danio-ostrobuzie przestaną się poruszać, przenieść je z dołka za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim wylocie i pompy pipetującej, a następnie układać pojedynczo na metylocelulozie, z głowami skierowanymi pod kątem 45° rowka, a ogonami w stronę kąta 90° rowka. Delikatnie docisnąć je do metylocelulozy tępą sondą sekcyjną, aby ustabilizować ich pozycję.
  6. Wyregulować zestaw do mikroiniekcji Nanoject II tak, aby igła była nachylona pod niewielkim kątem, niemal równolegle do kąta 45° formy agarozowej. Należy upewnić się, że zakres wysuwu igły będzie wystarczający, aby przekroczyć dno dołka formy, co zminimalizuje konieczność wprowadzania korekt po umieszczeniu ryb.
  7. Ustawić urządzenie do mikroiniekcji tak, aby podawać 4,6 nl (maksymalnie) w trybie wolnej iniekcji (23 nl/sec). Przy tych ustawieniach podawana objętość powinna wypełniać jedynie przednią część jelita, nie wyciekając przez przełyk ani kloakę. W zależności od celu eksperymentu można zastosować mniejsze objętości.
  8. Jedną ręką wprowadzać niewielkie korekty położenia płytki z unieruchomionymi larwami, jednocześnie sterując drugą ręką manipulatorem urządzenia do mikroiniekcji.
  9. Delikatnie wprowadzić igłę do gavage'u do pyska znieczulonej ryby, przez przełyk, lekko docisnąć zwieracz przełyku, aby wprowadzić końcówkę igły tuż za przednią część jelita (Rysunek 2, krok 1-2, a&b).
  10. Po wprowadzeniu do przedniej części jelita, delikatnie nacisnąć pedał nożny lub przycisk iniekcji, aby podać substancję. Szybko i płynnie wycofać igłę, starając się nie uwolnić znacznej ilości materiału do przełyku (Rysunek 2, krok 3-4).
  11. Po gavage'u, używając szklanej pipety Pasteura o szerokim wylocie i pompy pipetującej, delikatnie przenieść larwy danio-ostrobuzych do świeżej pożywki. Napełnić pipetę wodą do około 1 cala powyżej zgięcia szyjki, stworzyć małą kieszonkę wodną w metylocelulozie przy głowie larwy, aby ją zwolnić, delikatnie unieść głowę do otworu pipety i wyciągnąć larwę z metylocelulozy. Delikatnie wypuścić rybę wraz z całą wodą z pipety do naczynia ze świeżą pożywką.
  12. Płukać larwy w świeżej pożywce, delikatnie pipetując w górę i w dół lub kilka razy oblewając pożywką, aby usunąć metylocelulozę i wybudzić larwy z narkozy. Przenieść larwy do szalki Petriego lub płytki 6-dołkowej do czasu kolejnych obrazowań i analiz.

4. Analiza dekstranu w celu oceny bezpieczeństwa gavage i szczelności bariery jelitowej

Mikrogaważ można wykorzystać do podawania różnych substancji do jelit. Jako przykład przedstawiamy poniżej protokół gavage’u dekstranu 10 kD sprzężonego z Texas Red w celu analizy integralności bariery nabłonka jelitowego. Istnieją co najmniej dwie potencjalne drogi przepuszczalności parakomórkowej, różniące się selektywnością w zależności od ładunku i wielkości substancji rozpuszczonych, nazywane szlakami „porów” (pore) lub „przecieków” (leak)29. Ponieważ ten dekstran jest zbyt duży, aby zostać wchłoniętym przez nabłonek jelitowy drogą parakomórkową przez pory (ograniczenie wielkości ~4Å, dekstran 10kD = ~23Å)9,30-32, powinien on pozostać w świetle jelita, o ile integralność bariery jelitowej nie jest naruszona. Chociaż dekstran 10 kD mógłby być transportowany drogą parakomórkową przez szlak przecieków, ścieżka ta ma niższą pojemność i wolniejszą kinetykę29,33, w związku z czym mało prawdopodobne jest, aby wystąpiła ona w czasie trwania tego testu. Jako „kontrolę pozytywną” w celu naruszenia integralności bariery stosuje się EDTA, który rozbija połączenia ścisłe nabłonka34,35. Ten test gavage’u dekstranu może służyć jako kontrola jakości w celu wykazania, że procedura gavage jest wykonywana bezpiecznie, bez niezamierzonego uszkodzenia tkanek. Dodatkowo test ten może być wykorzystany do badania integralności bariery jelitowej w zależności od genotypu lub zastosowanego leczenia.

  1. Przygotować następujące roztwory do zgłębnika: 1% dekstranu/1x PBS/0,05% czerwieni fenolowej oraz 1% dekstranu/20 mM EDTA/1x PBS/0,05% czerwieni fenolowej (kontrola dodatnia). Roztwór stokowy 5% dekstranu w ddH2O przechowuje się w aliquotach po 50 μl w temperaturze -20 °C, aby ograniczyć liczbę cykli zamrażania i rozmrażania. Należy również przygotować pozorny roztwór do zgłębnika składający się z 1x PBS/0,05% czerwieni fenolowej.
    kontrola + (EDTA)bez EDTA
 stężenie zapasustężenie końcoweczynnik rozcieńczenia10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dekstran5%1%522
PBS10x1x1011
Czerwień fenolowa0,50%0,05%1011
   suma częściowa:54
   ddH2O:56
   Suma:1010
  1. Zastosuj protokół opisany w sekcji 3, aby przeprowadzić gavage w grupach 10-20 larw zebrafish dla każdego warunku eksperymentalnego. Jeśli to możliwe, powtórz tę procedurę na grupach dubletowych lub tripletowych.
  2. Po gavage doprowadź larwy do wybudzenia z anestezji i pozwól im swobodnie pływać w świeżym medium.
  3. W 18-20 min po gavage ponownie poddaj larwy anestezji zgodnie z krokiem 3.3. Umieść larwy w 3% metylocelulozie na bloku z 3% agarozy (redukuje to odblaski tła podczas obrazowania).
  4. Wykonaj obrazowanie larw za pomocą stereoskopu fluorescencyjnego (np. Leica M205C> i zestawu filtrów Texas Red przy powiększeniu umożliwiającym obrazowanie larw od pyska do obszaru bezpośrednio za końcem kloaki.
  5. Wszystkie obrazy należy pozyskać przy tych samych ustawieniach ekspozycji, aby można było je później skwantyfikować i porównać. Fluorescencja będzie intensywna w świetle jelita wszystkich larw wstrzykniętych dekstranem, jednak funkcję bariery ocenia się na podstawie poziomu dekstranu, który pojawia się w tkankach pozajelitowych (tzn. w tułowiu i naczyniach krwionośnych) (Rycina 5). Dostosuj ekspozycję do ustawień umożliwiających wizualizację fluorescencji tułowia, nawet jeśli spowoduje to prześwietlenie fluorescencji światła jelita.
  6. Zaplanuj czas gavage w odstępach, tak aby każda grupa spędziła w przybliżeniu taką samą ilość czasu na regenerację po zabiegu i była obrazowana w tym samym przybliżonym czasie po gavage. W tym eksperymencie jedna osoba potrzebuje około 1 hr na ukończenie procedury dla każdej grupy. Ryby są poddawane anestezji w 18-20 min po gavage, a obrazowanie trwa ~1-2 min na rybę.
  7. Użyj programu do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, aby skwantyfikować względną średnią intensywność fluorescencji w obszarze tułowia bezpośrednio nad jelitem. Znormalizuj te wartości, odejmując pomiar tła wykonany w obszarze obrazu poza rybą.
  8. Przedstaw dane z analizy obrazu na wykresach i przeanalizuj je za pomocą GraphPad Prism lub podobnego oprogramowania statystycznego.

5. Test fluorescencyjnych mikrosfer do badania motywności jelit

Gavage (podanie dożylne/zgłębnikowe) zapewnia lepszą kontrolę nad czasem i ilością podawanego do jelit materiału, co czyni tę metodę idealną alternatywą w badaniach nad motylością jelit. Wcześniej opublikowane techniki pomiaru motylości jelit u larw danio-pręgowanego obejmowały bezpośrednią obserwację skurczów i fal jelitowych za pomocą mikroskopii1,21,36 lub karmienie larw pokarmem zmieszanym z żółto-zielonymi fluorescencyjnymi mikrosferami polistyrenowymi26. W niektórych badaniach ilościowa analiza wzorców motylości jelit była usprawniana poprzez zanurzanie larw w mediach zawierających barwnik spożywczy37 lub zastosowanie specjalistycznej techniki analizy wideo zwanej mapowaniem czasoprzestrzennym (spatiotemporal mapping)38,39. W niniejszej pracy przedstawiamy badanie typu proof-of-concept, aby wykazać, że możliwe jest podanie fluorescencyjnych mikrosfer drogą gavage do przedniej części żarawki jelita, a śledzenie ruchu mikrosfer może być wykorzystane do oceny motylości jelit (Rycina 6). Główną różnicą między tą metodą a podejściem Fielda i współpracowników26 jest to, że kuleczki są wprowadzane samodzielnie i nie mogą zostać włączone w pokarm ze względu na ograniczenia średnicy igły do gavage.

  1. Utrzymywać larwy danio pręgowanego w płytkach 10 cm z 35 ml pożywki aż do przeprowadzenia eksperymentu w 7 dpf. Rozpocząć karmienie larw codziennie rano od 5 dpf, podając ~0,6 mg pokarmu w proszku (dieta dla larw, zgodnie z wcześniejszym opisem40; podawana za pomocą sterylnej pętli szczepiącej 1 mm).
  2. Delikatnie wstrząsnąć butelką z polistyrenowymi mikrosferami Fluoresbrite YG 2.0 μm (~2,5% zawiesina wodna), aby wymieszać zawiesinę. Nanieść kroplę z butelki na parafilm, aby umożliwić odmierzenie określonej objętości za pomocą pipety.
  3. W probówce typu Eppendorf odwirować kuleczki z niską prędkością w wirówce laboratoryjnej, usunąć nadsącz i zastąpić go 1x PBS w pierwotnej objętości. Powtórzyć ten proces, aby przemyć mikrosfery 2 razy.
  4. Przygotować zawiesinę do zgłębnikowania zawierającą 0,25% mikrosfer (rozcieńczenie zawiesiny stokowej 1:10)/1x PBS/0,05% czerwieni fenolowej. W objętości 4,6 nl podawanej pojedynczej larwie znajduje się ~2,6x103 mikrosfer.
  5. Zastosować protokół opisany w sekcji 3, aby przeprowadzić zgłębnikowanie pożądanej liczby larw. Mikrosfery wykazują pewną wyporność; dlatego zgłębnikowanie powinno być wykonane tak szybko, jak to możliwe, aby zmaksymalizować jednorodność zawiesiny.
  6. W tym eksperymencie 15 larw poddano zgłębnikowaniu, a następnie utrzymywano w pojedynczych dołkach płytki 12-dołkowej po wybudzeniu z anestezji, aby śledzić transport w poszczególnych osobnikach. Można jednak poddać zgłębnikowaniu większe grupy i oceniać transport w całej populacji, a nie indywidualnie. Standardowe praktyki opisano w pracy Field et al.26.
  7. Ocenić motorykę jelit poprzez określenie najbardziej rostralnej (lub przedniej) lokalizacji fluorescencyjnych mikrosfer u żywych larw w różnych odstępach czasu przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu. Krótko znieczulić larwy w 1x (0,017%) tricaine, a następnie określić strefy lokalizacji mikrosfer lub wykonać zdjęcia do późniejszej oceny.
  8. Przedstawić na wykresie i porównać procent całkowitej liczby larw z mikrosferami w określonym regionie jelita w funkcji czasu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Gdy gavage jest przeprowadzany prawidłowo, podany materiał powinien znajdować się w całości w przedniej części jelita, przy minimalnej lub całkowitej nieobecności pozostałości materiału w przełyku (Rysunek 3). Należy dobrać taką objętość podawanego materiału, która zostanie zmieszczona w przedniej opuszce i nie będzie wyciekać przez kloakę lub przełyk. Jeśli objętość materiału lub ciśnienie podania będą zbyt wysokie, siła fizyczna gavage może doprowadzić do uszkodzenia nabłonka lub wycieku przez niego. M...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisujemy nowy protokół bezpośredniego dostarczania materiałów do jelita larw zebrafish za pomocą mikrozondowania (mikrogavage). W trakcie całej procedury istnieje kilka krytycznych kroków, o których należy pamiętać. Po pierwsze, larwy zebrafish powinny być w dobrym stanie zdrowotnym przed eksperymentem, aby zapobiec zgonom niezwiązanym z zastosowaną terapią. Innym ważnym czynnikiem jest jakość igły do sondowania. Jednym z najtrudniejszych etapów protokołu jest odcięcie igły w odpowiednim miejscu bez t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Rawlsa za pomocne sugestie dotyczące treści oraz dr. Alanowi Fanningowi za cenne dyskusje na temat przepuszczalności rozmiarowej połączeń ścisłych i metod ich naruszania. Dziękujemy również dr. Michaelowi Chui oraz dr. Nealowi Kramarcy z Michael Hooker Microscopy Facility za wsparcie w zakresie mikroskopii konfokalnej. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health T32 DK007737-15 (dla stażysty J.L.C.), F32 DK094592 (dla J.L.C.) oraz R01 DK081426 (dla J.F.R.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Finquel (metanosulfonian tricainy)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Znieczulenie larw
Roztwór czerwieni fenolowejSigma-AldrichP0290-100 ml0,5% w DPBS, testowany w hodowlach komórkowych
Olej mineralny, lekki, biały (wysokiej czystości)AmrescoJ217-500 mlDo wypełniania igły i testowania objętości
TxRed-Dextran, 10,000 MW, utrwalany lizynąInvitrogen/ Molecular ProbesD-18631% zawiesina w 1x PBS/czerwień fenolowa
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Roztwór stokowy 5 mM w wodzie
MetylocelulozaMP Biochemicals0215549590
Kapilary borokrzemoweDrummond Scientific3-000-203-G/XOD 1,14 mm, ID 0,53 mm, długość 3,5 cala
Plastikowa forma do wykonywania odlewówAdaptive Science ToolsTU-1
Urządzenie do mikroiniekcji Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Wytwornica mikropipet Flaming Brown, filament z rynną o szerokości 3,0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330BWytwarzanie igieł
Pinceta studencka Dumont #5Fine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, przycinanie igieł
Siatka okularowa, 5 mm - 100 podziałekLeica10394771Przycinanie igieł
Mikrokuźnia (Microforge)NarishigeMF-900Przycinanie i wypalanie igieł
Igła do strzykawki tuberkulinowej SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, igła 25G 5/8
Mikrosfery Fluoresbrite YG (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Analiza motoryki jelit
Mikroskop sekcyjnyLeicaS6EProcedura gavage
Stereomikroskop fluorescencyjnyLeicaM205CTest bariery dla dekstranu
Mikroskop konfokalnyZeissLSM510Obrazowanie dekstranu w krwiobiegu

Bibliografia

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika mikrogavagewiat o jelitadekstran fluorescencyjnymikroiniekcja zarodkasprz t do stereomikroskopiipozycjonowanie w metyloceluloziekalibracja ig ytest szczelno ci barierymotoryka jelit

Powiązane artykuły