Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Jordan L. Cocchiaro; John F. Rawls

doi:10.3791/4434

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

17.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 lutego 2013

Jordan L. Cocchiaro¹ , John F. Rawls¹

¹Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju jelit^1-5, fizjologii^6-11, chorób^12-16 oraz oddziaływań między gospodarzem a mikrobami^17-25. Podejścia eksperymentalne w badaniu biologii jelit często wymagają wprowadzenia wybranych materiałów in vivo do światła jelita. W modelu larwalnym danio pręgowanego osiąga się to zazwyczaj poprzez zanurzenie ryb w roztworze wybranego materiału lub poprzez wstrzyknięcie go przez ścianę brzuszną. Przy zastosowaniu metody zanurzeniowej trudno jest dokładnie monitorować lub kontrolować drogę lub czas dostarczania materiału do jelit. Z tego powodu ekspozycja przez zanurzenie może powodować niezamierzoną toksyczność i inne efekty w tkankach pozajelitowych, co ogranicza potencjalny zakres ilości materiałów, które można dostarczyć do jelita. Ponadto ilość materiału przyjętego podczas ekspozycji przez zanurzenie może znacznie różnić się między poszczególnymi larwami²⁶. Choć problemy te nie występują podczas bezpośredniego wstrzykiwania przez ścianę brzuszną, prawidłowe wstrzyknięcie jest trudne i powoduje uszkodzenia tkanek, które mogą wpłynąć na wyniki eksperymentalne. Przedstawiamy metodę mikrozondującej aplikacji doustnej (mikrogavage) u larw danio pręgowanego. Celem tej metody jest zapewnienie bezpiecznego, skutecznego i spójnego sposobu dostarczania materiałów bezpośrednio do światła przedniej części jelita u larwalnych danio pręgowanych przy kontrolowanym czasie podania. Mikrogavage wykorzystuje standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię, powszechnie dostępną w większości laboratoriów prowadzących badania nad danio pręgowanym. Po odpowiednim ustawieniu ryb w metylocelulozie, zabieg można przeprowadzić szybko, w tempie około 7-10 ryb/min, a przeżywalność po zabiegu wynosi blisko 100% w zależności od podanego materiału. Wykazujemy również, że mikrogavage umożliwia załadowanie światła jelita wysokimi stężeniami materiałów, które są śmiertelne dla ryb w przypadku ekspozycji przez zanurzenie. Aby zademonstrować użyteczność tej metody, prezentujemy test mikrogavage z wykorzystaniem fluorescencyjnego dekstranu, który może być użyty do ilościowego określenia przejścia z światła jelita do przestrzeni pozajelitowych. Test ten może służyć do weryfikacji prawidłowego wykonania procedury mikrogavage, a także stanowi nową metodę badawczą u danio pręgowanego do sprawdzania szczelności bariery nabłonka jelitowego w różnych warunkach eksperymentalnych (np. manipulacje genetyczne, leczenie farmakologiczne lub ekspozycja na czynniki środowiskowe). Ponadto pokazujemy, jak mikrogavage może być wykorzystane do oceny motoryki jelit poprzez podanie fluorescencyjnych mikrosfer i monitorowanie ich późniejszego przemieszczania się. Mikrogavage można zastosować do dostarczania różnorodnych materiałów, takich jak żywe mikroorganizmy, wydzielane czynniki/toksyny mikrobiologiczne, środki farmakologiczne i sondy fizjologiczne. Dzięki tym możliwościom metoda mikrogavage u larwalnych danio pręgowanych ma potencjał do usprawnienia szerokiego zakresu dziedzin badawczych wykorzystujących system modelowy danio pręgowanego.

Protokół

W celu pozyskania larw do mikrogavage stosujemy opublikowane protokoły standardowej hodowli i utrzymania rybek zebrafish²⁷. Do rozmnażania ryb wykorzystujemy głównie rozród naturalny, a ryby są utrzymywane w cyklu 14 h światła / 10 h ciemności. Niniejszy protokół został zoptymalizowany dla mikrogavage larw zebrafish w 6-7 dniach po zapłodnieniu (dpf). Przewidujemy, że metody te będą ogólnie stosowalne do młodszych i starszych stadiów rozwojowych po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Jeśli nie wskazano inaczej, wykorzystano szczep zebrafish typu dzikiego TL w 6 dpf, a ryb nie karmiono. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w wodzie systemowej pozyskanej z....