Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.
Artykuł metodologiczny
Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z głównych zadań w neuronauce siatkówki jest zrozumienie obwodów neuronów siatkówki i tego, jak te połączenia są odpowiedzialne za kształtowanie sygnałów przekazywanych do mózgu. Fotony są wykrywane w siatkówce przez fotoreceptory pręcików i czopków, które przekształcają tę energię w sygnał elektryczny, przekazując ją do innych neuronów siatkówki, gdzie jest przetwarzana i przekazywana do centralnych celów w mózgu za pośrednictwem nerwu wzrokowego. Ważne wczesne spostrzeżenia na temat obwodów siatkówki i przetwarzania wzrokowego pochodziły z badań histologicznych Cajal1,2, a później z elektrofizjologicznych zapisów aktywności impulsowej komórek zwojowych siatkówki - komórek wyjściowych siatkówki3,4.
Szczegółowe zrozumienie przetwarzania wzrokowego w siatkówce wymaga zrozumienia sygnalizacji na każdym etapie szlaku od fotoreceptora do komórki zwojowej siatkówki. Jednak wiele typów komórek siatkówki jest głęboko zakopanych w tkance i dlatego jest stosunkowo niedostępnych do zapisu elektrofizjologicznego. Ograniczenie to można pokonać, pracując z pionowymi warstwami, w których komórki znajdujące się w każdej z warstw siatkówki są wyraźnie widoczne i dostępne do zapisu elektrofizjologicznego.
Tutaj opisujemy metodę tworzenia pionowych przekrojów siatkówki z larw salamandry tygrysiej (Ambystoma tigrinum). Chociaż preparat ten został pierwotnie opracowany do nagrań z ostrymi mikroelektrodami5,6, opisujemy metodę podwójnych zapisów cęgów napięciowych całej komórki z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu, w których manipulujemy potencjałem błonowym fotoreceptora, jednocześnie rejestrując odpowiedzi postsynaptyczne w komórkach poziomych lub dwubiegunowych. Fotoreceptory salamandry tygrysiej są znacznie większe niż u gatunków ssaków, co czyni je idealnym przygotowaniem do podjęcia tego technicznie trudnego podejścia eksperymentalnego. Eksperymenty te są opisane z myślą o zbadaniu właściwości sygnalizacyjnych wstęgi synaptycznej - wyspecjalizowanej struktury synaptycznej znajdującej się tylko w kilku neuronach, w tym fotoreceptorach pręcików i czopków, która jest dobrze przystosowana do utrzymania wysokiego tempa uwalniania neuroprzekaźnika tonicznego7,8 - i w jaki sposób przyczynia się do unikalnych właściwości sygnalizacyjnych tej pierwszej synapsy siatkówki.
Protokół
1. Przygotowanie plastrów siatkówki
- Zmontuj komorę (konstrukcja zilustrowana na rysunku 1). Umieść dwie kulki smaru próżniowego, oddalone od siebie o ~8-10 mm, w poprzek komory nagrywającej, aby utworzyć kanał dla superfuzatu i w którym zatopić plastry siatkówki. Dodaj drugą kroplę smaru kilka milimetrów dalej poza każdą z tych dwóch kulek smaru, aby działała jak wału przeciwpowodziowego i ograniczała rozlewanie się. Umieść mały trójkątny kawałek KimWipe na końcu komory, aby zapewnić kontakt płynu z elektrodą odniesienia.
- Dociśnij kawałek membrany nitrocelulozowej (~ 5 x 10 mm; pory 0,8 μm) płasko do szklanego szkiełka mikroskopowego w dwie małe kulki smaru próżniowego. Unikaj umieszczania smaru bezpośrednio pod środkiem membrany nitrocelulozowej, ponieważ może to zapobiec przyleganiu siatkówki.
- Aby przygotować krajalnicę do chusteczek, rozbij żyletkę z podwójną krawędzią na 4 części i przymocuj jedną do ramienia do krojenia. Wytnij cienki plasterek membrany nitrocelulozowej, aby upewnić się, że krawędź tnąca żyletki przylega płasko do komory nagrywającej, a tym samym czysto przecina membranę nitrocelulozową.
- Przechowywać małą zlewkę z roztworem soli fizjologicznej dla (tabela 1) na lodzie w stacji rozbrajania.
- Eutanazja salamandry przez ścięcie. Hemisect głowy strzałkowo i przeciąć rdzeń rdzeniowy przez rdzeń kręgowy. Połóż połowę głowy na kawałku bawełny zwilżonym solą fizjologiczną z na bloku linoleum. Drugą połowę głowy można owinąć wilgotnym ręcznikiem papierowym i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania później w ciągu dnia.
- Wyłuszczyć oko. Za pomocą małych nożyczek Vannas przetnij skórę łączącą oko z otaczającą oczodołą. Po uwolnieniu przedniej części oka z otaczającej tkanki oczodołu, pociągnij oko do przodu i wsuń nożyczki pod oko, aby przeciąć mięśnie oka i nerw wzrokowy, uwalniając oko od oczodołu.
- Umieść wyłuszczone oko na łóżku z bawełny na bloku linoleum. Wyrzuć pół głowy. Przytnij nadmiar tłuszczu oczodołowego z tylnej części oka.
- Wykonaj małe nacięcie na środku rogówki ostrym ostrzem chirurgicznym. Usuń rogówkę, wsuwając cienkie nożyczki Vannas w nacięcie i rozciągając nacięcie promieniście w kierunku ora serrata. Ciąć obwodowo wokół ora serrata, obracając blok linoleum lub bawełnę między cięciami.
- Po przecięciu całego oka usuń rogówkę i soczewkę, wyciągając je z boku muszli ocznej. Przesuń powstałą muszlę oczną na twardą powierzchnię bloku linoleum zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Pokrój go na trzy części ostrą żyletką, wykonując drobny ruch piłowania, aby upewnić się, że przeciąłeś całą twardówkę.
- Umieść jeden lub dwa kawałki muszli ocznej na membranie nitrocelulozowej powierzchnią siatkówki skierowaną w dół. Pozostałe kawałki zanurzyć w dodatkowej soli fizjologicznej i umieścić w lodówce w temperaturze ~4 °C.
- Delikatnie dociśnij kawałek muszli ocznej do membrany nitrocelulozowej za pomocą drobnych kleszczyków. Zanurz membranę nitrocelulozową i muszlę oczną w kilku kroplach zimnej soli fizjologicznej dla i osusz krawędzie KimWipe, aby pomóc siatkówki przylegać. Ponownie zanurz muszlę oczną i membranę nitrocelulozową kilkoma kroplami zimnego roztworu soli fizjologicznej i oderwij nabłonek barwnikowy twardówki/naczyniówki/siatkówki, aby wyizolować siatkówkę (która może wydawać się różowa z powodu obecności niebielonej rodopsyny). W razie potrzeby przetnij nerw wzrokowy, aby uwolnić siatkówkę.
- Jeśli siatkówka nie przylega szczelnie, odcedź sól fizjologiczną za pomocą KimWiste, aby mocniej pociągnąć siatkówkę w dół na membranę nitrocelulozową. Wymień sól fizjologiczną. W razie potrzeby powtórz czynność.
- Napełnij komorę zimną solą fizjologiczną z i przenieś ją do etapu krajalnicy do tkanek. Pokrój błonę siatkówki i nitrocelulozy na cienkie paski, pracując od jednego końca do drugiego, obracając mikrometr noniusza w krokach co 125 μm. Delikatnie, ale stanowczo przeciśnij żyletkę przez błonę siatkówki i nitrocelulozy.
- Przenieść wycinki siatkówki, przesuwając paski membrany nitrocelulozowej do głównego kanału komory zapisu. Podnieś pasek membrany wolny, a następnie przytrzymaj go na miejscu, przesuwając komorę pod nim, upewniając się, że plastry są zanurzone. Osadź krawędzie membrany nitrocelulozowej w paskach smaru próżniowego, obracając je o 90 stopni, aby wyświetlić warstwy siatkówki.
- Dociśnij membranę nitrocelulozową płasko do powierzchni szkła. Nawet jeśli na każdym elemencie nie ma siatkówki, umieść paski membrany nitrocelulozowej w regularnych odstępach (~1 mm od siebie) na całej długości kanału perfuzyjnego, aby pomóc rozbić napięcie powierzchniowe i poprawić przepływ płynu.
2. Sparowane nagrania całych komórek
- Po przeniesieniu wszystkich warstw przenieś komorę zapisu na stolik pionowego, stałego mikroskopu stage i podłącz przewód elektrody referencyjnej. Skoncentruj się na plasterkach, korzystając z dużej odległości roboczej, zanurzenia w wodzie, obiektywu 40-60X. Mikroskop należy umieścić na stole powietrznym w celu tłumienia drgań i zamknąć w klatce Faradaya w celu zmniejszenia zakłóceń elektrycznych.
- Plastry roztopić w sposób ciągły z szybkością 1 ml/min z roztworem soli fizjologicznej dla z pęcherzykami 100%O2. Podłącz ssanie, upewniając się, że dopływ i odpływ są zrównoważone. Odpływ można regulować, obracając skośny koniec igły ssącej lub przesuwając KimWipe na końcu komory bliżej lub dalej od igły odpływowej. Preparat można przechowywać w temperaturze pokojowej lub schłodzić za pomocą urządzenia Peltiera lub po prostu umieszczając okład z lodu na stoliku mikroskopu.
- Zbadaj wycinki w słabym świetle lub w podczerwieni i zidentyfikuj parę komórek - fotoreceptor (pręcik lub stożek) i pobliską komórkę poziomą lub dwubiegunową - do rejestracji całej komórki. Pręciki można rozpoznać po ich dużych ciałach komórkowych i wydatnych, przypominających pręciki segmentach zewnętrznych (ryc. 2A). Stożki są mniejsze niż pręty i mają małe zwężające się segmenty zewnętrzne. Dwubiegunowe komórki i poziome somy komórkowe znajdują się w najbardziej zewnętrznym rzędzie ciał komórkowych w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL; Rysunki 2B i 2C).
- Przed przygotowaniem plastrów należy za pomocą ściągacza do pipet wyprodukować mikropipety ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,2 mm, średnica wewnętrzna 0,95 mm z żarnikiem szklanym). Końcówka każdej mikropipety powinna mieć średnicę ~1-2 mikronów.
- Za pomocą niemetalowej igły do napełniania (np. wykonanej ze strzykawki o pojemności 1 cm3 lub MicroFil) napełnić pipety roztworem wewnątrzkomórkowym (Tabela 1) i przymocować do uchwytu elektrody.
- Nieznacznie podnieś obiektyw mikroskopu. Umieść pipetę fotoreceptorową pod obiektywem, a następnie opuść ją tak, aby końcówka znajdowała się tuż nad plastrami. Powtórzyć czynności z drugą pipetą.
- Dostosuj dowolne przesunięcie w podstawowym poziomie prądu na amplifier. Sprawdź rezystancję pipety za pomocą impulsu depolaryzacyjnego 5-10 mV. Zazwyczaj używamy pipet o częstotliwości od 10 do 15 MΩ, co jest wynikiem długiego zwężania się trzonu i niskiej osmolarności roztworów pipet dla. W przypadku roztworów dla ssaków o wyższej osmolarności, te same pipety wykazują wartości rezystancji ~8-12 MΩ. Chociaż w roztworach dla zastosowaliśmy większe średnice końcówek o wartościach rezystancji 3-4 MΩ, korzyści wynikające z niższego oporu dostępu są równoważone przez większą trudność w uszczelnianiu błon komórkowych i szybszy spływ prądów wapniowych i innych reakcji wrażliwych na drugi przekaźnik.
- Wywierając lekkie nadciśnienie, ustaw pipetę postsynaptyczną tak, aby stykała się z poziomym lub dwubiegunowym korpusem komórki. Następnie umieść pipetę presynaptyczną tak, aby stykała się z ciałem komórki fotoreceptora pręcikowego lub czopkowego. Zapisy wydają się być bardziej stabilne, gdy końcówki pipet stykają się z segmentem wewnętrznym, a nie z somą, zwłaszcza w stożkach.
- Monitorując rezystancję, zwolnij dodatnie ciśnienie na pipecie postsynaptycznej. Czasami uwolnienie nadciśnienia jest wystarczające do utworzenia uszczelki gigaomowej. Jeśli nie, zastosuj delikatne odsysanie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml lub doustnie. Gdy rezystancja końcówki wzrośnie do > 100 MΩ, zastosuj potencjał podtrzymania -60 mV. Po uzyskaniu gigaomowego uszczelnienia należy usunąć wszelkie stany przejściowe pojemności pipety i powtórzyć procedurę uszczelniania dla pipety fotoreceptorowej, stosując potencjał podtrzymania -70 mV.
- Rozerwij plaster, używając ust lub strzykawki, aby odsysać kolejno każdą komórkę. Pręciki, czopki i komórki dwubiegunowe zazwyczaj pękają przy delikatnym zasysaniu. Uzyskanie konfiguracji całoogniwowej z ogniwem poziomym może wymagać większego ssania (tj. za pomocą strzykawki o pojemności 3 cm3) w połączeniu z silnymi szybkimi impulsami napięciowymi dostarczanymi z funkcją "zap" wzmacniacza patch clamp. Pęknięcie błony i ustalenie konfiguracji całej komórki będzie widoczne po pojawieniu się stanów przejściowych pojemności całej komórki.
- Potwierdź fizjologicznie tożsamość komórki postsynaptycznej, stosując błysk świetlny i dostarczając serię kroków napięcia od -120 do +40 mV w krokach co 20 mV (ryc. 3 i 4).
- Aby ocenić, czy para komórek jest połączona synaptycznie, należy przeprowadzić krótką (25-100 ms), krokową depolaryzację 60 mV do fotoreceptora (do -10 mV, w pobliżu szczytu prądu wapniowego bramkowanego napięciem typu L) i poszukać prądów postsynaptycznych w neuronie drugiego rzędu (ryc. 5). Silny krok depolaryzacyjny powinien wywołać szybki, przejściowy wewnętrzny prąd postsynaptyczny w postsynaptycznej komórce poziomej lub dwubiegunowej OFF spowodowany wybuchem uwalniania pęcherzyków ze stożka (ryc. 5).
Wyniki
Reprezentatywne zapisy odpowiedzi świetlnych neuronów w pionowych przekrojach siatkówki salamandry przedstawiono na Rysunku 3. Czop, komórka pozioma oraz komórka bipolarna typu OFF wykazują prąd wychodzący w odpowiedzi na włączenie światła. Wyraźny prąd wchodzący następujący po błysku światła w zapisach z komórek poziomych i bipolarnych jest spowodowany zwiększonym uwalnianiem glutaminianu z fotoreceptorów podczas ich depolaryzacji po wyłączeniu światła. Komórka bipolarna typu ON odpowiada prądem wchodzącym przy włączeniu światła, co wynika z kaskady sygnalizacyjnej metabotropowego receptora glutaminianu odwracającej znak oraz aktywacji kanałów TRPM19. Komórki poziome i bipolarne można odróżnić na podstawie ich charakterystyk I-V (Rysunek 4). Komórki poziome mają zazwyczaj liniową lub wewnątrzprostującą charakterystykę I-V i niską rezystancję wejściową (<500 MΩ; Rysunek 4A), podczas gdy komórki bipolarne wykazują wysoką rezystancję wejściową (0,5-2 GΩ) i zewnątrzprostującą charakterystykę I--V (Rysunek 4B). Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne wyniki zapisów z pary komórka czopowa-komórka pozioma (Rysunek 5A) oraz pary komórka czopowa-komórka bipolarna typu OFF (Rysunek 5B). W każdym przypadku depolaryzacja czopa do -10 mV z potencjału spoczynkowego -70 mV wywołała napięciozależny prąd wapniowy w czopie oraz szybki wchodzący EPSC w komórce poziomej lub bipolarnej. Ten silny bodziec jest wystarczający do opróżnienia łatwo uwalnianej puli około 20 pęcherzyków z każdej wstążki synaptycznej, co skutkuje EPSC o wartości ~47 pA/wstążka10. EPSC komórki poziomej na Rysunku 5A wyniósł 232 pA, co sugeruje, że otrzymała ona 5 kontaktów wstążkowych od presynaptycznego czopa. Podobna ocena dla EPSC o wartości 178 pA w komórce bipolarnej typu OFF (Rysunek 5B) sugeruje, że otrzymała ona 4 kontakty wstążkowe od presynaptycznego czopa.
| Sól fizjologiczna dla płazów | Pipeta presynaptyczna | Pipeta postsynaptyczna | |
| NaCl | 116 mM | 3.5 mM | 3.5 mM |
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 1.8 mM | 1 mM | 1 mM |
| MgCl2 | 0.5 mM | 1 mM | 1 mM |
| HEPES | 10 mM | 10 mM | 10 mM |
| Glukoza | 5 mM | ||
| Cs-glutaminian* | 40 mM | ||
| Cs-glukonian** | 50 mM | 90 mM | |
| Chlorek tetraetyloamoniu | 10 mM | 10 mM | |
| ATP-Mg | 9 mM | 9 mM | |
| GTP | 0.5 mM | 0.5 mM | |
| EGTA | 5 mM | 5 mM | |
| pH*** | 7.8 | 7.2 | 7.2 |
| Osmolalność**** | 245 mOsm | 240 mOsm | 240 mOSM |
*Cs-glutaminian jest przygotowywany poprzez neutralizację 40 mM kwasu L-glutaminowego za pomocą 40 mM CsOH w roztworze do pipety. ** Zapasowy roztwór 1 M Cs-glukonianu przygotowuje się poprzez neutralizację roztworu CsOH 45-50% kwasem D-glukonowym. *** pH należy skorygować za pomocą NaOH dla roztworu zewnątrzkomórkowego oraz CsOH dla roztworów do pipety. **** Utrzymanie osmolarności roztworów do pipety na poziomie nieco niższym niż w przypadku roztworu zewnątrzkomórkowego zapobiega obrzękowi komórek i zwiększa trwałość rejestracji.
Tabela 1. Składniki i parametry standardowych roztworów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych wykorzystywanych w niniejszym protokole.
Rycina 1. Konstrukcja komory rejestrującej. (A-C) Widoki z góry, z boku i w przekroju komory rejestrującej z zaznaczonymi wymiarami. Komora jest wykonana z arkrylu o grubości 2 mm. (D) Zmontowana komora. Superfuzat dostaje się do komory przez rurkę teflonową o długości 10 cm (rurka wlotowa; typ 24LW). Superfuzat jest usuwany poprzez zastosowanie lekkiego ssania do ściętej metalowej rurki o rozmiarze 20 G po przeciwnej stronie komory. Obok tej rurki wylotowej znajduje się pelletowa elektroda odniesienia Ag/AgCl. Przewód z tej elektrody odniesienia jest podłączony do wejścia referencyjnego wzmacniacza przedwzmacniacza. Mały trójkąt chusteczki KimWipe umieszcza się nad elektrodą odniesienia, aby utrzymać ją w kontakcie z roztworem i regulować przepływ roztworu do rurki wylotowej. Podstawę komory tworzy szkiełko przedmiotowe mikroskopu umieszczone w zagłębieniach krawędzi komory. Szkiełko jest mocowane za pomocą kropli smaru próżniowego. Paski membrany nitrocelulozowej z wycinkami siatkówki są osadzone w kropkach smaru próżniowego, które tworzą kanał dla przepływu roztworu. Przed wykonaniem wycinków, fragment membrany nitrocelulozowej o wymiarach 5 x 10 mm jest mocowany do komory za pomocą dwóch małych kropel smaru próżniowego. Fragment oczodołu jest kładziony stroną witralną w dół na tę membranę nitrocelulozową i podnoszony po przywarciu siatkówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
Rycina 2. Pary komórek wypełnionych barwnikiem w preparacie z przekroju pionowego. A) Obrazy pręcika i synaptycznie sprzężonej komórki poziomej, które zostały wypełnione kontrastującymi barwnikami fluorescencyjnymi wprowadzonymi za pomocą pipety patch podczas jednoczesnego rejestrowania całokomórkowego. Lucifer yellow (2 mg/ml) zawarto w roztworze pipety dla pręcika (żółty), a sulfarhodamine B (1 mg/ml) zawarto w roztworze pipety dla komórki poziomej (fioletowy). Obrazy fluorescencyjne zarejestrowano za pomocą konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem (Perkin Elmer Ultraview LCI) wyposażonego w chłodzoną kamerę CCD (Orca ER) i zamontowanego na mikroskopie ze stałym stolikiem (Nikon E600 FN z obiektywem imersyjnym wodnym 60X, 1.0 NA). Obrazy te nałożono na obrazy w polu jasnym odpowiadających im przekrojów siatkówki przy użyciu programu Adobe Photoshop. B) Obrazy czopka i synaptycznie sprzężonej komórki dwubiegunowej typu OFF. Zakończenie aksonu komórki dwubiegunowej rozgałęzia się w zewnętrznej (S1) podwarstwie wewnętrznej warstwy splotowej, w pobliżu granicy z wewnętrzną warstwą jądrową. C) Obrazy czopka i synaptycznie sprzężonej komórki poziomej. Zauważmy, że zakończenia czopków są znacznie większe niż zakończenie aksonu pręcika. Chociaż komórki poziome można zidentyfikować po podłużnym kształcie ich ciał komórkowych, ciała komórek dwubiegunowych typu ON i OFF w INL nie można łatwo odróżnić przed rejestracją. Można jednak celować w przemieszczone komórki dwubiegunowe typu OFF sterowane przez czopki, których ciała komórkowe znajdują się w ONL i które można odróżnić od czopków przez brak segmentów wewnętrznych i zewnętrznych. Pasek skali wynosi 20 μm.
Rycina 3. Prądy wywołane światłem, zarejestrowane metodą clampy napięciowej w czterech różnych neuronach siatkówki w odpowiedzi na jasny, 500 ms błysk białego światła. Stożek (A), komórka pozioma (B)oraz komórka bipolarna typu „off” (C) wszystkie zareagowały na światło prądem wychodzącym. (D) Komórka dwubiegunowa typu „on” zareagowała na ten sam bodziec świetlny prądem wewnątrzkomórkowym. Szum bazowy wykazany przez komórkę dwubiegunową typu „off” (C) odzwierciedla ciągłe uwalnianie pęcherzyków synaptycznych w ciemności, które zmniejsza się, gdy fotoreceptory ulegają hiperpolaryzacji w świetle. Odpowiedzi tych czterech komórek uzyskano w oddzielnych pomiarach z wykorzystaniem skrawków przygotowanych w białym świetle. Natężenie bodźca białego światła zastosowane w tych przykładach wywołało w komórkach horyzontalnych i bipolarnych odpowiedzi odpowiadające strumieniowi fotonów o długości fali 580 nm wynoszącemu 1 x 105 fotonów/s/μm2.
Rycina 4. Zależności prądowo-napięciowe (I-V) komórek poziomych i komórek dwubiegunowych typu off. (A) Górny panel, prądy błonowe wywołane serią skoków napięcia o czasie trwania 150 msec od -120 do +40 mV w przyrostach 20 mV (dolny panel) przyłożonych do komórki poziomej. Komórki poziome zazwyczaj charakteryzują się niską opornością wejściową i liniowymi lub wewnątrzprostującymi zależnościami I-V. (B) Zależność I-V komórki dwubiegunowej typu off w odpowiedzi na serię skoków napięcia. Komórki dwubiegunowe mają wyższą oporność wejściową i zewnątrzprostującą zależność I-V, co wynika z aktywacji napięciowo zależnych prądów potasowych.
Rycina 5. Przykłady danych z rejestracji parzystej. (A) Rejestracja napięciowo-zależnego prądu wapniowego czopka (Cone ICa) w odpowiedzi na 100 msec skok do -10 mV z potencjału spoczynkowego -70 mV (Cone Vm). Prądy przecieku i przejściowe prądy pojemnościowe zostały odjęte przy użyciu protokołu odejmowania przecieku P/8. Jednocześnie zarejestrowano szybki pobudzający prąd postsynaptyczny (EPSC; HC PSC) z komórki poziomej, co wykazuje sprzężenie synaptyczne tych dwóch komórek. (B) EPSC został zarejestrowany w komórce bipolarna typu off w odpowiedzi na ten sam bodziec w innym czopku.
Dyskusja
Preparat do wycinka siatkówki okazał się bardzo przydatny do analizy obwodów i mechanizmów wykorzystywanych przez siatkówkę do przetwarzania informacji wizualnych. Możliwość jednoczesnego uzyskiwania zapisów całych komórek z neuronów pre- i postsynaptycznych była szczególnie pomocna w tym przedsięwzięciu. Sparowane nagrania całych komórek są znacznie łatwiejsze do osiągnięcia za pomocą plastrów niż za pomocą płaskich preparatów siatkówki, ponieważ różne warstwy siatkówki są odsłonięte. Co więcej, ze względu na duże neurony siatkówki, salamandry mają długą historię jako preparat siatkówkowy i dlatego stanowią szczególnie dobrze scharakteryzowany system modelowy.
Przy odrobinie wprawy zdrowe plastry siatkówki salamandry można przygotowywać regularnie. Kilka kluczowych kroków może zadecydować o sukcesie lub porażce. 1) Upewnij się, że żyletka jest zamontowana na krajalnicy do tkanek tak, aby leżała płasko na powierzchni szkła i czysto przecinała zarówno tkankę, jak i leżącą pod nią błonę nitrocelulozową. Jeśli wykonałeś czyste cięcie przez membranę nitrocelulozową, powinieneś usłyszeć słabe kliknięcie, gdy żyletka uderza o powierzchnię szklanego szkiełka. 2) Upewnij się, że siatkówka przylega do błony nitrocelulozowej. W przeciwnym razie siatkówka może odpłynąć od błony podczas dowolnego etapu zabiegów. 3) Nie wystawiaj pokrojonych plastrów na działanie powietrza, ponieważ uszkodzi to wiele powierzchownych komórek. 4) Upewnij się, że plastry i membrana nitrocelulozowa leżą płasko na szkiełku podstawowym, tak aby warstwy siatkówki były widoczne pod mikroskopem preparacyjnym. 5) Zrównoważyć szybkości dopływu i odpływu superfusatu, aby uniknąć przepełnienia komory nagrywającej. Zapobiega to nagłym zmianom poziomu roztworu, które mogą powodować nagłe ruchy tkanek. 6) Wybierz zdrową parę komórek znajdujących się blisko siebie. Komórki z gładką cytoplazmą są zdrowsze niż komórki z ziarnistą cytoplazmą. Komórki znajdujące się głębiej w wycinku mają większe szanse na zachowanie nienaruszonych kontaktów synaptycznych. 7) Upewnij się, że końcówka pipety nie złamała się ani nie otarła o inne tkanki lub zanieczyszczenia w drodze do komórek. 8) Sprawdź rezystancję pipety, aby upewnić się, że nie jest zatkana zanieczyszczeniami lub pęcherzykami, które mogą utrudnić uzyskanie wysokiej jakości zapisu całej komórki.
Zamiast przyczepiać siatkówkę do bibuły filtracyjnej nitrocelulozowej, niektórzy badacze osadzają siatkówki w bloku agaru i używają wibratomii do wycinania plastrów siatkówki. Chociaż nie próbowaliśmy tego podejścia, Kim i wsp.11 Omów zalety obu podejść. Z ich doświadczenia wynika, że podejście oparte na agarze zapewnia bardziej spójną wydajność płaskich plastrów z dobrze zaznaczonymi warstwami siatkówki, ale podejście oparte na bibule filtracyjnej daje zdrowsze fotoreceptory.
Pręciki i czopki są odpowiedzialne za przekształcanie światła w zmiany potencjału błonowego. W przypadku sparowanych nagrań potencjałem błonowym pręcików lub czopków można manipulować bezpośrednio, a zatem zdolność do generowania odpowiedzi świetlnych, choć pomocna w identyfikacji typów komórek, może nie być niezbędna. Dlatego często przygotowujemy plastry w białym świetle. Jednak nawet po przygotowaniu w jasnym oświetleniu neurony siatkówki salamandry mogą generować duże odpowiedzi świetlne, jak pokazano w odpowiedziach na ryc. 3. Jest to częściowo spowodowane stosunkowo dużym rezerwuarem chromoforu w dużej objętości zewnętrznego segmentu, ale może również odzwierciedlać zdolność komórek Müllera do regeneracji 11-cis-retinalu dla czopków12. Aby uzyskać w pełni przystosowane do ciemności odpowiedzi świetlne, można przygotować plastry w świetle podczerwonym. Do sekcji w świetle podczerwonym podłączamy wzmacniacze obrazu GenIII (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) do okularów mikroskopu preparacyjnego i oświetlamy tkankę latarką LED na podczerwień. Do krojenia i innych zabiegów, które nie są przeprowadzane pod mikroskopem preparacyjnym, stosujemy wzmacniacz obrazu montowany na głowie. W celu umieszczenia pipet z plastrami wizualizujemy plastry za pomocą czułej na podczerwień kamery CCD (np. Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) zamontowanej na pionowym mikroskopie stałopozycyjnym. Dzięki tym środkom ostrożności można uzyskać odpowiedzi pręcików wykazujące czułość pojedynczego fotonu6, 13.
Jednym z ograniczeń pracy w wycinkach siatkówki jest to, że długie procesy komórkowe neuronów siatkówki o dużym polu mogą stracić wiele swoich dendrytów podczas procedury krojenia. Preparaty plastrów siatkówki są zatem bardziej przydatne do badania fizjologii komórek, w których kontakty synaptyczne obejmują procesy bliskie ciału komórki. Siatkówki i ssaków mają wiele tych samych typów komórek i wykorzystują podobne mechanizmy fizjologiczne14-16. Podczas gdy siatkówka salamandry jest dobrym modelem dla wielu aspektów siatkówki ssaków, jedną z ważnych różnic wydaje się być obecność dedykowanej ścieżki pręcikowej u ssaków, która obejmuje kontakty wyspecjalizowanych pręcików komórek dwubiegunowych z komórkami amakrynowymi AII14. Dodatkowym ograniczeniem siatkówki salamandry jest niewielka liczba narzędzi genetycznych opracowanych specjalnie dla tego gatunku. Jednak przeciwciała i odczynniki shRNA, które są ukierunkowane na dobrze zachowane regiony u innych gatunków, mogą być z powodzeniem stosowane w salamandrze, podobnie jak wiele inhibitorów małocząsteczkowych i odczynników peptydowych. Dodatkowo, przy kilku modyfikacjach techniki, plastry siatkówki można przygotować z innych gatunków, w których niektóre z tych narzędzi są łatwiej dostępne.
Oprócz użyteczności do rejestrowania sparowanych całych komórek, preparat plastra siatkówki salamandry jest również podatny na wiele innych podejść. Jak omówiono powyżej, plastry siatkówki można wykorzystać do badania reakcji na światło w połączeniu z różnymi protokołami zacisków napięciowych17. Neurony siatkówki mogą być również obciążone barwnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na Ca2+, Cl- lub Na+ wprowadzanymi za pomocą pipety plastrowej lub przez aplikację kąpielową15,18-20. Peptyd fluorescencyjny, który wiąże się z wstęgą synaptyczną21 , może być wprowadzony przez pipetę z plastrem i użyty do obrazowania wstążki10 lub, w przypadku sprzężenia z fluoresceiną, do ostrego i selektywnego uszkodzenia wstęgi22. Użyliśmy również wycinków siatkówki w połączeniu z kropkami kwantowymi do monitorowania ruchów poszczególnych kanałów wapniowych na zakończeniach synaptycznych pręcików i stożków23. Tak więc pionowy wycinek siatkówki jest wszechstronnym preparatem eksperymentalnym do badania podstawowych mechanizmów synaptycznych i unikalnych funkcji przetwarzania wykonywanych w pierwszej synapsie w szlaku sygnalizacji wzrokowej.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Research to Prevent Blindness i grant National Institutes of Health EY10542.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Krajalnica do tkanek | Stoelting | 51425 | |
| Żyletki z podwójną krawędzią | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Membrany nitrocelulozowe | Milipore | AAWP02500 Typ AAWP 0,8 mm pore | |
| Pipety ze szkła borokrzemianowego | World Precision Instruments | TW120F-4 | 1,2 mm OD 0,95 mm ID |
| Ag / AgCl pellet | Warner | E206 | |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 ga. Igła do napełniania, długość 67 mm |
Bibliografia
- Thorpe, S. A., Glickstein, M. The Structure of the Retina. , Charles C Thomas. Springfield, IL USA. (1972).
- Piccolino, M. Cajal and the retina: a 100-year retrospective. Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).
- Hartline, H. K. The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina. Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).
- Kuffler, S. W. Discharge patterns and functional organization of mammalian retina. J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).
- Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the riger salamander retina. J. Physiol. 280, 449-470 (1978).
- Wu, S. M. Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina. J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).
- Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).
- Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).
- Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells. Bioessays. 32, 609-614 (2010).
- Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse. J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).
- Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices. J. Vis. Exp. (59), e3345(2012).
- Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation. Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).
- Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina. Neuroscience. 122, 785-798 (2003).
- Wu, S. M. Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).
- Babai, N., Thoreson, W. B. Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina. J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).
- Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors. Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).
- Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage. Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).
- Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors. J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).
- Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization. Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).
- Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation. Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming. Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).
- Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).
Przedruki i uprawnienia
