Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

Podsumowanie

Prosta metoda pozyskiwania i utrzymywania linii komórek macierzystych i progenitorowych spermatogoniów od dorosłych myszy jest przedstawiona tutaj. Metoda wykorzystuje komórki zasilające pochodzące z przedziału komórki somatycznej jądra dorosłej myszy. Ta technika ma zastosowanie do popularnych szczepów myszy, w tym myszy transgenicznych, nokautujących i knock-in.

Streszczenie

Spermatogonialne komórki macierzyste i progenitorowe (SSC) jądra reprezentują klasyczny przykład komórek macierzystych dorosłych ssaków i zachowują płodność przez prawie całe życie zwierzęcia. Chociaż dokładne mechanizmy rządzące samoodnawianiem i różnicowaniem in vivo są trudne do zbadania, wcześniej opracowano różne systemy do rozmnażania mysich SSC in vitro przy użyciu kombinacji specjalistycznych pożywek hodowlanych i komórek zasilających^1-3.

Większość prób in vitro w dziedzinie biologii SSC wywodzi linie komórkowe od noworodków, prawdopodobnie z powodu trudności w uzyskaniu linii komórek dorosłych⁴. Jednak jądro dojrzewa do ~5 tygodnia życia u większości szczepów myszy. We wczesnym okresie poporodowym zachodzą dramatyczne zmiany w architekturze jądra oraz w biologii zarówno komórek somatycznych, jak i plemnikotwórczych, w tym zmiany w poziomach ekspresji licznych genów związanych z komórkami macierzystymi. W związku z tym linie SSC pochodzące od noworodków mogą nie oddawać w pełni biologii dorosłych SSC, które utrzymują się po osiągnięciu przez dorosłe jądro stanu równowagi.

Kilka czynników historycznie utrudniało produkcję dorosłych linii SSC. Po pierwsze, odsetek funkcjonalnych komórek macierzystych może zmniejszyć się w wieku dorosłym, zarówno z powodu czynników wewnętrznych, jak i zewnętrznych^5,6. Ponadto, podobnie jak w przypadku innych dorosłych komórek macierzystych, trudno było wystarczająco wzbogacić SSC z całkowitej liczby dorosłych komórek jąder bez zastosowania kombinacji immunoselekcji lub innych strategii sortowania⁷. Powszechnie stosowane strategie obejmują wykorzystanie myszy z wnętrostwem jako źródła komórek dawcy ze względu na wyższy stosunek komórek macierzystych do innych typów komórek⁸. Opierając się na hipotezie, że usunięcie komórek somatycznych z początkowej hodowli zakłóca interakcje z niszą komórek macierzystych, które są niezbędne do przeżycia SSC, wcześniej opracowaliśmy metody uzyskiwania dorosłych linii, które nie wymagają immunoselekcji ani dawców wnętrostwa, ale raczej wykorzystują seryjne wzbogacanie SSC w hodowli, zwane dalej SESC^2,3.

Metoda opisana poniżej obejmuje prostą procedurę wyprowadzania linii SSC dla dorosłych poprzez dysocjację kanalików nasiennych dorosłego dawcy, a następnie posiewanie komórek na karmnikach składających się z linii komórek zrębu jądra (JK1)³. Poprzez seryjne pasażowanie, silnie przylegające, zanieczyszczające komórki nierozrodcze są wyjmowane z hodowli z jednoczesnym wzbogacaniem SSC. Kultury wyprodukowane w ten sposób zawierają mieszaninę spermatogonii na różnych etapach różnicowania, które zawierają SSC, w oparciu o długoterminową zdolność do samoodnawiania. Istotą metody SESC jest to, że umożliwia ona SSC trudne przejście od samoodnawiania się in vivo do długotrwałej samoodnawiania in vitro w radykalnie odmiennym mikrośrodowisku, wytwarza długoterminowe linie SSC, wolne od zanieczyszczeń komórek somatycznych, a tym samym umożliwia późniejszą eksperymentalną manipulację SSC.

Protokół

1. Przygotowanie komórek zasilających

Proszę zauważyć, że wszystkie odczynniki opisane poniżej powinny być przygotowane w sterylny sposób (patrz Tabele 1 i 2). Protokół ten wykorzystuje linię komórkową JK1 (Cell Biolabs, Inc., katalog #CBA-315) jako podajniki, która jest przekształconą pochodną komórek somatycznych jąder dorosłych myszy i została opisana w innym miejscu³. Należy również pamiętać, że wszystkie zabiegi na zwierzętach powinny być wykonywane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi.

1. Komórki JK1 mogą być utrzymywane w hodowli i z powodzeniem wykorzystywane jako żywiciele do pasażu 39. Hodowla komórek JK1 w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm (BD Falcon, katalog #353003) z 10 ml sterylizowanej filtrem pożywki wzrostowej (DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutaminą i antybiotykami). Gdy kultura osiągnie 95% konfluencji, podziel komórki w stosunku 1:6 -1:10.
2. Usuń pożywkę z monowarstwy ogniwa zasilającego JK1.
3. Raz przemyj warstwę komórkową PBS bez wapnia i magnezu.
4. Dodaj wstępnie podgrzaną trypsynę/EDTA, 1x (0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog #25-051-CI) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.
5. Dezaktywuj trypsynę równą objętością pożywki wzrostowej. Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej podajnika.
6. Wstępnie pokryć wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych, dodając tyle 0,4% roztworu żelatyny, aby przykryć studzienkę i usunąć po 5 minutach w temperaturze pokojowej.
7. Płytka ~250 komórek na^mm2 w pokrytej żelatyną płytce do hodowli komórkowej (np. w formacie 48-dołkowym lub 6-dołkowym). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 16–24 godzin.
8. Usuń pożywkę hodowlaną ze studzienek. UWAGA: Aby dezaktywować wzrost komórek, dodaj świeży roztwór mitomycyny-C w stężeniu 10 μg/ml rozcieńczony w DMEM do każdego dołka (np. 200 μl/dołek dla płytki 48-dołkowej). Mitomycyna-C jest toksyczna. Obchodź się z nim i utylizuj go ostrożnie. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
9. Usuń roztwór mitomycyny-C z komórek. Umyj 3 razy DMEM przed posiewem komórek macierzystych.
10. Usunąć DMEM z dołków komórek zasilających i dodać wystarczającą ilość pożywki z komórek macierzystych (100 μl/dołek z płytki 48-dołkowej; patrz Tabela 3), aby zapobiec wysuszeniu karmników podczas pasażowania. Dodać SSC tego samego dnia, jak opisano poniżej w sekcjach 3.1 lub 3.4, używając wskazanych rozmiarów studzienek zawierających podajniki.

2. Dysocjacja tkanki jądra myszy w celu uzyskania komórek rozrodczych dawcy

1. Zbierz jądra dorosłych myszy w sterylny sposób i tymczasowo przechowuj jądra na przykrytej szalce Petriego (bez dodawania płynu). Naczynie należy natychmiast umieścić na lodzie, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać żywotność komórek.
2. Używając sterylnych cienkich kleszczyków i cienkich nożyczek w kapturze do hodowli komórkowych, wykonaj poprzeczne nacięcie w osłonce białawej bez całkowitego przenikania jądra (tj. Przeciąć ~ 1/2-3/4 odległości) i użyj kleszczy, aby wycisnąć kanaliki nasienne w róg płytki; wyrzuć osłonkę i przyczepioną tkankę. Utrzymuj płytkę na lodzie przez cały czas, aby utrzymać tkankę w chłodzie, zachowując w ten sposób jej integralność i zapobiegając parowaniu.
3. Szybko miel kanaliki cienkimi nożyczkami sprężynowymi co najmniej 3 minuty na jądro, trzymając talerz na lodzie.
4. Zebrać fragmenty kanalików do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przemyć w ~ 40 ml schłodzonej PBS/1% albuminy surowicy bydlęcej.
5. Wirować przy 60 x g przez 10 minut, aby oddzielić fragmenty kanalików od plemników i szczątków. Odrzucić supernatant.
6. W stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawiesić osad w 3 ml na jądro wstępnie podgrzanego buforu dysocjacyjnego (DMEM, 0,05% trypsyna, 0,03% kolagenazy typu I, 80 j./ml DNAzy I i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej; Patrz Tabela 2 w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat bufora dysocjacyjnego).
7. Umieść stożkową rurkę poziomo w stojaku w wytrząsarce ustawionej na 150 obr./min w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby zmaksymalizować mieszanie.
8. Wiruj w dół z prędkością 60 x g przez 10 minut, aby oddzielić pojedyncze komórki od niezdysocjowanych kawałków.
9. Zachowaj granulat zawierający kawałki do następnego kroku. Zebrać supernatant z kroku 2.8 i dodać 3 ml DMEM/10% płodowej surowicy bydlęcej, aby zneutralizować bufor dysocjacyjny. Umieść probówkę na lodzie tymczasowo.
10. Powtórz kroki od 2.6 do 2.7 z zapisanym osadem z kroku 2.9, aby ponownie strawić kawałki pozostałe po kroku 2.8.
11. Dodaj równą objętość DMEM/10% FBS, aby zneutralizować bufor dysocjacyjny.
12. Ponownie połącz zawiesinę z kroku 2.11 z zapisaną zawiesiną komórek z kroku 2.9. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.
13. Zawiesić osad w podłożu z komórkami macierzystymi w objętości 16 ml na parę jąder (patrz Tabela 3).

3. Poszycie zawiesiny komórek jądra

1. Płytkę 2 ml zawiesiny komórkowej na basenik na płytce 6-dołkowej zawierającej komórki karmiące mitotycznie inaktywowane mitomycyną-C i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Po 48 godzinach odessać pożywkę, dodać 2 ml świeżej pożywki i wrócić do inkubatora.
3. Po 48 godzinach dodać 0,5 ml świeżej pożywki z komórek macierzystych do każdej studzienki i ponownie umieścić w inkubatorze.
4. Po 48 godzinach należy następnie karmić komórki trzy razy w tygodniu w następujący sposób, aż pojawią się duże, dyskretne kolonie (>50 komórek) (w ciągu 7 do 21 dni). Przy pierwszym i drugim karmieniu każdego tygodnia (np. w poniedziałek i środę) należy usunąć ~50% pożywki i dodać z powrotem 50% objętości świeżej pożywki. Przy trzecim karmieniu (np. w piątek) odessać całe podłoże i zastąpić je 2 ml świeżego podłoża. Podejście to opiera się na założeniu, że unikanie całkowitych zmian pożywki minimalizuje wahania stężeń sygnałów parakrynnych, które są wydzielane do pożywki hodowlanej⁹.

4. Wybieranie kolonii do pierwszego przejścia

1. Usuń pożywkę z dołków zawierających kolonie, które mają być pasażowane, i dodaj świeżą pożywkę z komórek macierzystych.
2. Zidentyfikuj kolonie za pomocą celu 10x. Przy lekko rozogniskowanym mikroskopie, kolonie SSC na krawędzi studzienki pojawią się jako jednorodne jasne grudki, składające się z wielu komórek o średnicy 11-12 μm, w których trudno lub niewyraźnie można dostrzec granice poszczególnych komórek, ponieważ komórki wydają się zrośnięte ze sobą (ryc. 1A). Kolonie inne niż SSC mogą wydawać się ciemniejsze, bardziej ziarniste lub mniej jednorodne, z dostrzegalnymi granicami (ryc. 1A, wstawka).
3. Używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl, przy pipetowniku ustawionym na 50 μl, najpierw nabierz pożywkę ze studzienki i wygładź ją, aby zwilżyć końcówkę. Następnie delikatnie popchnij kolonię końcówką, a następnie szybko wycofaj 50 μl pożywki, aby usunąć kolonię przez zassanie do końcówki (ryc. 1B).
4. Wydalić pożywkę zawierającą kolonię do jednego dołka 48-dołkowej płytki zawierającej inaktywowane komórki zasilające ze 100 μl pożywki z komórek macierzystych (ryc. 1C).
5. Powtórzyć krok 4.3 i dodać do 8 kolonii do tego samego dołka, nie przekraczając 500 μl na studzienkę.
6. Powtórz kroki od 4.3 do 4.5, aby przygotować dodatkowe studzienki na płytce 48-dołkowej z przejściem jednej kolonii SSC.
7. Studzienki będą gotowe do rozszczepienia w ciągu 7-14 dni lub po pojawieniu się dużych grudek do 500 komórek (ryc. 1D).

5. Późniejsza ekspansja i przejście SSC przez roztarcie

1. Komórki podczas pasażu pierwszego powinny być subhodowane na świeże karmniki po maksymalnie 14 dniach w stosunku podziału 1:2 przez pierwsze 3 pasaże, a następnie 1:4 do 1:6 (co 7 dni) w następujący sposób. Delikatnie rozcierać kolonie z dołka częściowo zlewającego się (np. ~300 000 SSC/studzienkę na płytce 6-dołkowej) za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, przemłukując pożywkę przez komórki. Można zobaczyć, jak kolonie się odłączają. Zbyt duża siła działająca ze strumieniem cieczy spowoduje, że niechciane ogniwa podajnika również odpadną.
2. Zebrać rozdrobnione komórki do stożkowej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Uwaga: W tym miejscu można bezpiecznie dodać etap trypsynizacji, jeśli badacz sobie tego życzy.
3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w świeżej pożywce z komórkami macierzystymi, dokładnie pipetując w górę i w dół, aby rozbić kolonie.
4. Płytki SSC na świeżo przygotowanych komórkach zasilających inaktywowanych mitomycyną-C, jak opisano w sekcji 1.
5. Karm komórki trzy razy w tygodniu w następujący sposób. Przy pierwszym i drugim karmieniu (np. w poniedziałek i środę) dodać 50% objętościowo świeżego podłoża. Przy trzecim karmieniu (np. w piątek) odessać całe podłoże i zastąpić je 2 ml świeżego podłoża. Płytki zlewają się w ciągu 7-10 dni. Hodowle powinny składać się z >98% komórek rozrodczych (tj. <1% zanieczyszczających komórek somatycznych) po 5-7 pasażach, w oparciu o barwienie immunologiczne (np. przy użyciu mysiego markera komórek rozrodczych GCNA) w celu odróżnienia komórek rozrodczych od komórek somatycznych¹⁰. Uwaga: Metody te zostały opracowane zgodnie z przepisami i wymaganiami określonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Weill Cornell Medical College.

Wyniki

Wygląd kolonii dorosłych SSC typu dzikiego w pasażu zero po 7 dniach przedstawiono na Rysunku 1. Trójwymiarowe kolonie składają się z warstwy płaskich komórek przytwierdzonych do komórek karmicielskich lub podścielonej macierzy zewnątrzkomórkowej zdeponowanej przez komórki karmicielskie, z wieloma warstwami SSC rosnącymi na górze. Podczas gdy zdrowe SSC są silnie refrakcyjne i mają jednorodną średnicę 11-12 μm, granice komórek są trudne do rozróżnienia, a wielkość kolonii może być wysoce zmienna, zarówno...

Dyskusja

Ta metoda wyprowadzania dorosłych SSC przy użyciu dorosłych komórek żywicielskich pochodzących z jąder jest solidna i odniosła sukces, gdy zastosowano wspólne tła genetyczne (np. FVB, C57Bl6 i mieszane 129SV/C57Bl/6) oraz różne zmutowane szczepy^2,3,7,14. W rzeczywistości mikrośrodowisko stworzone przez system hodowli jest wystarczające do pokonania niektórych barier genetycznych utrudniających utrzymanie dorosłych SSC in vivo (np. w przypadku zwierząt plzf^-/- )⁷...

Materiały

Tabela 1. Specjalne odczynniki i sprzęt.

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Corning	10-013	Rozcieńczalnik do buforu dysocjacyjnego
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Pożywka na bazie komórek macierzystych (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Wymaga suplementacji zgodnie z Shinohara et al. (2003)*
Pożywka z komórkami macierzystymi suplementuje	różne	patrz Tabela 3	Wymaga suplementacji zgodnie z Shinohara et al. (2003)*
Komórki JK1	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Może zastąpić dorosłymi komórkami zrębu jąder zgodnie z Seandel et al. (2007)
mitomycyna-C (UWAGA)	Sigma-Aldrich	M4287	Toksyczny; Obchodź się ostrożnie.
Żelatyna	Sigma-Aldrich	G1890	0,4% roztwór w wodzie
Cyfrowy mikroskop odwrócony EVOS xl Zaawansowana	grupa mikroskopowa	-
DMEM	Corning	10-013	Rozcieńczalnik do buforu dysocjacyjnego
trypsyny (1:250)	Life Technologies	27250-018	Bufor dysocjacyjny: Końcowa kolagenaza 0,05% wag./obj
typ I, 235 U/ml	Bufor	CLS1 235	Końcowa 0,03% wag./obj
DNAzyza I	Sigma-Aldrich	DN25	: Końcowa 80 U/ml
albuminy surowicy bydlęcej	ICP Bio	ABRE-100g	Bufor dysocjacyjny: Końcowy 0,5% wag./obj
Tabela 2. Bufor dysocjacyjny
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Suplement odżywczy	Life Technologies	10639-011
Dodatkowe suplementy**
Aminokwasy endogenne	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Witamina roztwór	Life Technologie	11120-052	1X
L-glutamina	Mediatech	25-005	2 mM
albumina surowicy bydlęcej	ICP Bio	ABRE	0,50%
roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glukoza	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesteron	Calbiochem	5341	60 ng / ml
płodowa surowica bydlęca	zmienna	n/a	1%
bydlęca holotransferyna	Sigma-Aldrich	T1283	100 μ g/ml
insuliny	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μ g/ml
ludzki GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
ludzki bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mysi EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescyny	Research Organics	0778P	60 μ M
Selenin sodu	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
Kwas pirogronowy	Alfa Aesar	A13875	30 μ g/ml
Kwas DL-mlekowy	J.T. Baker	0196-04	1 μ g/ml
β-mercapt– tanol	Life Technologies	21985-023	50 μ M
kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	A4544	100 μ M
D-biotyna	Sigma-Aldrich	B4639	10 μ g/ml
Tabela 3. Pożywka z komórkami macierzystymi
*Uwaga: Dodaj suplementy poniżej przed użyciem pożywki. Filtruj, sterylizuj i utrzymuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka jest stabilna przez co najmniej 2 tygodnie.
**Użyliśmy różnych producentów, preparatów i/lub numerów partii tych odczynników bez żadnych widocznych szkodliwych skutków. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować odczynniki do hodowli komórkowych.

"4"> *Patrz Tabela 3., dysocjacyjny Worthington : . Bufor dysocjacyjny