Method Article

Polimeryzacja wielowarstwowa z gradientem gęstości (DGMP): nowatorska technika tworzenia wielokompartyjnych, konfigurowalnych rusztowań dla inżynierii tkankowej

DOI:

10.3791/50018

⸱

February 12th, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego , 2Biomedical Sciences Program, University of California, San Diego , 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy unikalną strategię tworzenia biokompatybilnych, warstwowych matryc z ciągłymi interfejsami między różnymi warstwami dla inżynierii tkankowej. Takie rusztowanie może zapewnić idealne, konfigurowalne środowisko do modulowania zachowania komórek za pomocą różnych sygnałów biologicznych, chemicznych lub mechanicznych

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożone matryce kultur tkankowych, w których typy i stężenia bodźców biologicznych (np. czynniki wzrostu, inhibitory lub małe cząsteczki) lub struktura matrycy (np. skład, stężenie lub sztywność matrycy) zmieniają się w przestrzeni, umożliwiłyby szeroki zakres badań dotyczących wpływu tych zmiennych na różnicowanie komórek, migrację i inne zjawiska. Głównym wyzwaniem w tworzeniu matryc warstwowych jest utrzymanie integralności strukturalnej interfejsów warstw bez dyfuzji poszczególnych komponentów z każdej warstwy1. Obecne metodologie pozwalające to osiągnąć obejmują fotowzorce2-3, litografię4, funkcjonalizację sekwencyjną5, liofilizację6, mikrofluidykę7 lub wirowanie8, z których wiele wymaga zaawansowanego oprzyrządowania i umiejętności technicznych. Inne polegają na sekwencyjnym łączeniu poszczególnych warstw, co może prowadzić do rozwarstwieniawarstw 9.

DGMP rozwiązuje te problemy, używając obojętnego modyfikatora gęstości, takiego jak jodixanol, do tworzenia warstw o różnej gęstości10. Ponieważ modyfikator gęstości można mieszać z dowolnym prepolimerem lub cząsteczką bioaktywną, DGMP umożliwia dostosowanie każdej warstwy rusztowania. Prosta zmiana stężenia modyfikatora gęstości zapobiega mieszaniu się sąsiednich warstw, gdy pozostają one wodne. Następująca po niej jednoetapowa polimeryzacja prowadzi do powstania strukturalnie ciągłego rusztowania wielowarstwowego, w którym każda warstwa ma odrębne właściwości chemiczne i mechaniczne. Modyfikator gęstości można łatwo usunąć po wystarczającym wypłukaniu bez zakłóceń poszczególnych warstw lub ich składników. Technika ta doskonale nadaje się zatem do tworzenia hydrożeli o różnych rozmiarach, kształtach i materiałach.

Protokół wytwarzania żelu z glikolu polietylenowego (PEG) 2D, w którym naprzemienne warstwy zawierają RGDS-350, jest opisany poniżej. Używamy PEG, ponieważ jest biokompatybilny i obojętny. RGDS, peptyd adhezyjny11 komórek, służy do wykazania przestrzennego ograniczenia sygnału biologicznego, a koniugacja fluoroforu (Alexa Fluor 350) umożliwia wizualne rozróżnienie różnych warstw. Procedura ta może być dostosowana do innych materiałów (np. kolagenu, hialuronianu itp.) i może być rozszerzona o wytwarzanie żeli 3D z pewnymi modyfikacjami10.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza znakowanego fluorescencyjnie akryloilo-PEG-RGDS

  1. Peptyd RGDS należy reagować z estrem karboksymetylo-akrylowym AKRYLOIL-PEG-sukcynimidylo (aPEG-SCM, PEG MW: 3400 g/mol) i N-N diizopropyloetyloaminą (DIPEA) w stosunku molowym 1,2:1:2 w dimetylosulfonku (DMSO) pod argonem w temperaturze pokojowej przez noc.
  2. Potwierdź koniugację za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF). Dodać 1 μl roztworu reakcyjnego aPEG-RGDS do miejsca próbki na tarczy MALDI i wysuszyć. Przygotować nasycony roztwór Universal MALDI Matrix w tetrahydrofuranie (THF) i wirować przez 1 min. Dodać ~1 μl tego roztworu do tego samego miejsca próbki. Powtórz procedurę dla aPEG-SCM dla porównania. Załaduj i przeanalizuj. Masa cząsteczkowa aPEG-RGDS powinna być większa niż aPEG-SCM (ryc. 2).
  3. Aby sprzęgnąć fluorofor, dodać równomolową ilość kwasu karboksylowego Alexa Fluor 350 (estru sukcynimydylu), rozpuszczonego w minimalnej objętości DMSO, do roztworu reakcyjnego aPEG-RGDS z 1,1 i przereagować pod argonem w temperaturze pokojowej przez noc.
  4. Oczyszczać aPEG-RGDS-350 przez dializę (MW 3500 Da) przeciwko DI-H2O w temperaturze 4 °C przez 48 godzin w stosunku objętościowym 1,000:1, wymieniając dialilat co najmniej dwa razy dziennie.
  5. Oczyszczony aPEG-RGDS-350 należy liofilizować w systemie liofilizacji Labconco Freezone Plus lub równoważnym systemie liofilizacji i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie formy 2D i produkcja żelu 2D PEG z naprzemiennymi warstwami RGDS-350

  1. Przygotuj szkiełka hydrofobowe. Umieść czyste szkiełka w szklanym naczyniu w piekarniku próżniowym. Podgrzewać do 80 °C przez 30 minut, aby całkowicie wyschnąć powierzchnie. Umieść naczynie ze szkiełkami w dygestoriach i dodaj 250 μl Sigmacote do każdego szkiełka, delikatnie kołysząc przez 30 sekund, aby pokryć całą powierzchnię. Dokładnie wypłukać powlekane szkiełka 100% metanolem, a następnie umyć w wodzie destylowanej, mocząc dwukrotnie przez 5 minut w co najmniej 10 ml.
  2. Wytnij silikonowe przekładki (o grubości 0,8 mm) za pomocą stempli biopsyjnych 10 mm.
  3. Autoklaw silikonowych przekładek i szkiełek szklanych poddanych obróbce Sigmacote.
  4. Sformułować roztwory dla każdej odpowiedniej warstwy w oddzielnych probówkach do mikrofuge, mieszając prekursor diakrylanu PEG (PEGda) (stężenie końcowe 15% w/v) z różnymi ilościami jodiksanolu (60% roztwór podstawowy w wodzie) w celu uzyskania różnych stężeń końcowych (np. 40%, 30%, 20% i 10%), uzupełniając pozostałą objętość solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu uzyskania roztworów o stopniowanej gęstości. W podobny sposób, dla naprzemiennych warstw, zmieszaj aPEG-RGDS-350 (stężenie końcowe 8 mM) z jodiksanolem i PBS, aby uzyskać różne stężenia (np. 35%, 25% i 15%).
  5. Dodać fotoinicjator (2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon, 333 mg/ml zapasu w N-winylopirolidonie) do każdego roztworu dla różnych warstw (10 μl roztworu podstawowego na ml roztworu każdej warstwy). Fotoinicjator jest dodawany jako ostatni, aby zapobiec polimeryzacji przed nałożeniem warstw żeli w formie, ponieważ jest wrażliwy na światło.
  6. Kolejne etapy tego protokołu będą wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego w celu zapewnienia sterylności.
  7. Przefiltruj i wysterylizuj każdy roztwór za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i filtra 0,2 μm. Zmontuj konfigurację formy, umieszczając przekładkę między dwoma szkiełkami szklanymi poddanymi obróbce Sigmacore i zabezpiecz za pomocą zacisków, umieszczając je tak, jak pokazano na rysunku 1.
  8. Odlać warstwowe żele, dodając najpierw najbardziej gęsty roztwór (np. PEGda z 40% jodiksanolu), a następnie mniej gęsty roztwór (np. aPEG-RGDS-350 z 35% jodiksanolu). Powtórz naprzemienne nakładanie warstw, aby uzyskać kilka warstw o pożądanym składzie i gęstości, jak pokazano na rysunku 1.
  9. Naświetlić formę światłem o długości fali 365 nm przez 3 minuty za pomocą przenośnej lampy UVR-9000. Pozostaw spolimeryzowane żele do utwardzenia przez 5 minut. Zdejmij zaciski, a następnie delikatnie podnieś górny szkiełko i formę; rozwarstwione żele DGMP pozostaną na szkiełkach. Za pomocą sterylnej szpatułki ostrożnie umieścić żele w probówce o pojemności 50 ml zawierającej sterylny PBS lub pożywkę hodowlaną do przemycia.
  10. Przemyj spolimeryzowane żele w PBS w stosunku objętościowym 1,000:1, wymieniając bufor co najmniej dwa razy dziennie w celu usunięcia modyfikatora gęstości, fotoinicjatora i nieprzereagowanego polimeru. Alternatywnie, PBS można wymienić na pożywkę do wzrostu komórek. Przechowuj żele DGMP w PBS lub pożywce wzrostowej do eksperymentu z hodowlą komórkową opisanego w kroku 3.
  11. Aby uwidocznić naprzemienne warstwy, ułóż żel DGMP (te żele nie będą nadawały się do hodowli komórkowych) wzdłuż linijki na tacy na próbki w jednostce dokumentacji żelu VersaDoc. Eksponować żele w 350 nm; Czas ekspozycji będzie się różnić w zależności od stężenia fluoroforu. Naprzemienne ciemne i niebieskie pasma w hydrożelu DGMP pokazują tworzenie się dyskretnych warstw o różnym składzie chemicznym (ryc. 3).

3. Hodowla komórkowa 2D na żelach DGMP

  1. W przypadku żeli zawierających peptyd RGDS należy użyć komórek zależnych od adhezji, takich jak mioblasty C2C12.
  2. Delikatnie wprowadzić żele DGMP (przechowywane w PBS) do dołków 48-dołkowych płytek do hodowli komórkowych za pomocą sterylnego skrobaka do komórek w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  3. Wstępnie ogrzane podłoże wzrostowe (zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco lub DMEM uzupełniona 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej i 1% v/v 100x roztwór penicyliny i streptomycyny) i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Umyj 60% zlewającą się płytkę (10 mm) komórek C2C12 trzykrotnie za pomocą PBS. Odessać PBS i zebrać komórki, dodając 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej i policz komórki. Dobrze wysiewać hodowlę komórkową zawierającą żel DGMP z mioblastami C2C12 (20 000 komórek / cm2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej 5% CO2/95%. Delikatnie wymień podłoże po 4 godzinach, uważając, aby nie usunąć lekko przylegających komórek.
  5. Po 24 godzinach przyłączenie mioblastów C2C12 do warstw żeli DGMP zawierających RGDS można potwierdzić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i kontrastu fazowego (Zeiss Axiovert 200).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza MALDI-TOF potwierdza koniugację peptydu RGDS z akryloilo-PEG (Rysunek 2). Obrazowanie żelu ujawnia naprzemienne warstwy RGDS-350 (niebieskie) po fotopolimeryzacji (ryc. 3A). Jak pokazano na rysunku 3A, rozmiar żelu 2D DGMP można zmieniać w zależności od średnicy form silikonowych (10 mm, po lewej; 8 mm, po prawej), a zatem można je łatwo dostosować do użycia w wielu testach – w tym przypadku, aby pasowały do 48-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (rysunek 3B). Mikroskopia epifluorescencyjna i kontrastu fazowego mioblastów C2C12 hodowanych na żelu DGMP wykazuje selektywne przyłączanie do warstw PEG zawierających RGDS-350 (ryc. 4), wykazując kompartmentalizację peptydu adhezyjnego komórek (RGDS).

figure-results-1
Rysunek 1. Analiza masy cząsteczkowej metodą MALDI-TOF porównująca aPEG-SCM z aPEG-RGDS otrzymanym po koniugacji peptydu RGDS.

figure-results-2
Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie wytwarzania żelu DGMP. Po ułożeniu gradientów warstwami, można je pozostawić do osiadania przez różne okresy czasu(ts), aby utworzyć stopniowane interfejsy, a następnie fotopolimeryzację. Warstwowe żele DGMP można łatwo wyjąć z formy w celu dalszego wykorzystania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

figure-results-3
Rysunek 3. A) Żele wielowarstwowe 2D otrzymane po fotopolimeryzacji zobrazowane przy użyciu kanałów światła białego 350 nm i światła białego jednostki dokumentacji żelu VersaDoc. Obraz w skali szarości odsłania naprzemienne warstwy zawierające RGDS w kolorze białym. B) Wprowadzenie żelu DGMP do 48-dołkowych naczyń do hodowli komórkowych.

figure-results-4
Rysunek 4. Połączony obraz kontrastu fazowego i epifluorescencji mioblastów C2C12 hodowanych na żelach DGMP (podziałka 50 μm).

figure-results-5
Rysunek 5. Wpływ jodiksanolu na elastyczność powierzchni żelu. Pomiary mikroskopii sił atomowych próbek statycznych usieciowanych substratów PEG przy użyciu wcześniej ustalonych metod z wyzwalaczem siły 2 nN 12. *p< 0,05 i **p<0,01.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DGMP to prosta strategia przygotowania wielowarstwowych żeli, która nie opiera się na drogim oprzyrządowaniu. Protokół ten można dostosować do tworzenia rusztowań przy użyciu innych biokompatybilnych materiałów, takich jak kolagen i kwas hialuronowy. Bioaktywne małe cząsteczki, na przykład peptyd RGDS sprzyjający adhezji komórek, mogą być przywiązane do matrycy polimerowej, aby zapobiec mieszaniu się sygnałów między warstwami. Białka mogą być zamknięte w odrębnych warstwach bez konieczności koniugacji chemicznej, ponieważ, w zależności od rozmiaru oczek matrycy, są mniej podatne na dyfuzję przez hydrożele10. W tym przypadku użyliśmy jodiksanolu (Nycoprep), obojętnego modyfikatora gęstości, który wcześniej był używany do zastosowań w żywotnych komórkach. Można również stosować inne modyfikatory gęstości, takie jak sacharoza i dekstroza. Zmieniając czas ustalania (ts), można precyzyjnie dostroić interfejsy między dwiema warstwami, aby uzyskać gładkie lub ostre przejścia w zależności od potrzeb (dłuższy czas osiadania zapewnia płynniejsze przejścia)10. Na przykład, płynniejsze przejścia między warstwami żelu DGMP mogą być wykorzystane do generowania ciągłego gradientu sygnału biologicznego w celu zbadania procesów komórkowych, takich jak chemotaksja.

Wpływ modyfikatora gęstości na sztywność żelu pokazano na rysunku 5 dla żelu 15% aPEGda; Obecnie trwają prace nad pełniejszą charakterystyką sztywności i porowatości w funkcji stężeń PEGda i jodiksanolu. Chociaż stężenie PEGda w tym przykładzie jest stosunkowo wysokie, zaobserwowaliśmy o 60% większy moduł sprężystości w żelach zawierających 30% jodiksanol w porównaniu z żelami bez niego. Zmianę sztywności żelu można skorygować, modulując stężenie makromeru lub gęstość usieciowania.

Zastosowaliśmy również technikę DGMP do tworzenia wielowarstwowych żeli 3D z wykorzystaniem prekursorów poliakrylamidu i PEG10. Zmiana stężenia lub stopnia usieciowania prepolimeru pozwala na zmianę strukturalną rusztowań, które można wykorzystać do badania zachowania komórek, takiego jak spolaryzowany wzrost i migracja w 3D.

Podsumowując, DGMP to elastyczna technika, którą można zastosować do wytwarzania rusztowań 2D i 3D z różnych materiałów biokompatybilnych do szerokiego zakresu zastosowań biomedycznych i badań podstawowych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni za wsparcie od NIH Director's New Innovator Awards (1DP2 OD006499-01 dla A.A. i 1DP2 OD006460-01 dla A.J.E.), oraz King Abdulaziz City for Science and Technology (UC San Diego Center of Excellence in Nanomedicine). Chcielibyśmy podziękować Pani Jessice Moore za jej krytyczne uwagi na temat manuskryptu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Glikol polietylenowy sukcynimydyl karboksymetylo (a-PEG-SCM)Laysan120-64
Diakrylan glikolu polietylenowego (PEGda)DajacLabs 9359
Kwas argininino-glicynowy-asparaginowy-seryna (RGDS)Amerykański peptyd49-01-4
N,N- Diizopropyloetyloamina (DIPEA)SigmaD125806
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2438
N,N- dimetyloformamid (DMF)FisherD119-4
Tetrahydrofuran (THF)KasetaT397
(3500 Da)Thermo Scientific66330
Alexa Fluor 350 ester sukcynimydylowy kwasu karboksylowegoLife TechnologiesA-10168
SigmacoteSigmaSL2
Dystanse silikonoweGrainger1MWA4
Stemple do biopsjiAcudermP1025 (10 mm)
P850 (8 mm)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)HyclonSH30028
Jodixanol (NycoPrep)FisherNC9388846
2-Hydroxy-4'-(2- hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon Sigma410896
Zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco)Life Technologies11054
Surowica bydlęca płoduLife Technologies10082
Penicylina-streptomycynaLife Technologies15140
Mioblasty C2C12ATCC CRL-1772
MALDIBrukerN/A
UVR-9000BaycoUVR-9000
VersaDocBio-RadN/A
do dializy Fisher

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in biomaterials for tissue engineering. Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).
  2. Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers. J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).
  3. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Eng. 13, 405-414 (2007).
  4. Hahn, M. S., et al. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  5. Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization. Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).
  6. Harley, B. A., et al. Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold. J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).
  7. Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels. Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).
  8. Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres. Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).
  9. Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).
  10. Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue. Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).
  11. Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule. Nature. 309, 30-33 (1984).
  12. Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium. Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Density Gradient Multilayered PolymerizationMulti compartment ScaffoldsTissue EngineeringPolymerization TechniqueHydrogel FabricationLayered Cell CultureRGDS Peptide ConjugationFluorescent LabelingUV IrradiationAtomic Force Microscopy

Related Articles