Artykuł metodologiczny

LeafJ: Wtyczka ImageJ do półautomatycznego pomiaru kształtu liści

DOI:

10.3791/50028

⸱

21 stycznia 2013

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, University of California Davis

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstracja kluczowych metod do pomiarów liści o wysokiej przepustowości. Metody te mogą być stosowane do przyspieszenia fenotypowania liści podczas badania wielu mutantów roślinnych lub w inny sposób badania przesiewowego roślin według fenotypu liści.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowe fenotypowanie (fenomika) jest potężnym narzędziem do łączenia genów z ich funkcjami (zobacz przegląd1 i ostatnie przykłady2-4). Liście są głównym organem fotosyntetycznym, a ich rozmiar i kształt różnią się w zależności od rozwoju i środowiska w roślinie. Z tych powodów badania nad morfologią liści wymagają pomiaru wielu parametrów z wielu liści, co najlepiej jest wykonać za pomocą półautomatycznych narzędzi fenomicznych5,6. Cień baldachimu jest ważną wskazówką środowiskową, która wpływa na architekturę roślin i historię życia; zestaw odpowiedzi jest zbiorczo nazywany syndromem unikania cienia (SAS)7. Wśród odpowiedzi SAS, wydłużenie ogonków liściowych wywołane cieniem i zmiany w powierzchni blaszek są szczególnie przydatne jako wskaźniki8. Do tej pory programy do kształtowania liści (np. SHAPE9, LAMINA10, LeafAnalyzer11, LEAFPROCESSOR12) mogą mierzyć kontury liści i kategoryzować kształty liści, ale nie mogą wyświetlać długości ogonków. Brak wielkoskalowych systemów pomiaru ogonków liściowych zahamował fenomiczne podejście do badań nad SAS. W tym artykule opisujemy nowo opracowaną wtyczkę ImageJ o nazwie LeafJ, która może szybko mierzyć długość ogonków liściowych i parametry blaszki liściowej rośliny modelowej Arabidopsis thaliana. W przypadku sporadycznych liści, które wymagały ręcznej korekty granicy ogonka/blaszki liściowej, używaliśmy tabletu z ekranem dotykowym. Ponadto kształt komórek liści i liczba komórek liści są ważnymi wyznacznikami wielkości liścia13. Niezależnie od LeafJ przedstawiamy również protokół korzystania z tabletu z ekranem dotykowym do pomiaru kształtu, powierzchni i rozmiaru komórki. Nasz system pomiaru cech liści nie ogranicza się do badań nad unikaniem cienia i przyspieszy fenotypowanie liści wielu mutantów oraz badania przesiewowe roślin poprzez fenotypowanie liści.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiały roślinne

Zauważ, że ten protokół wzrostu roślin ma na celu wykrywanie reakcji unikania cienia. Możesz uprawiać rośliny w swoich ulubionych warunkach.

  1. Nasiona rzodkiewnika pospolitego rozsypać na nasączonych wodą bibulach filtracyjnych na 9 cm szalkach Petriego i przechowywać (rozwarstwić) w temperaturze 4 °C przez cztery dni w ciemności.
  2. Przenieś te szalki Petriego do symulowanych warunków słonecznych: 80-100 μE promieniowania fotosyntetycznie aktywnego (PAR) i dalekiego czerwonego suplementu, aby uzyskać stosunek R:FR do 1,86. Stosować długie warunki dzienne (16 godzin światła/8 godzin ciemności) i stałą temperaturę 22 °C. Inkubować w tych warunkach przez trzy dni, aby nasiona mogły wykiełkować.
  3. Przenieś kiełkujące nasiona do gleby i utrzymuj rośliny w warunkach słonecznych. W przypadku eksperymentów na dużą skalę zaleca się przygotowanie małych znaczników do etykietowania każdej rośliny za pomocą Menedżera scalania danych w programie Microsoft Word 2004 (lub nowszym) do tworzenia etykiet.
  4. Jedenaście dni po przeniesieniu do gleby przenieś połowę roślin do stanu zacienionego: tak samo jak słońce, ale z dodatkowym światłem dalekiej czerwieni, aby zwiększyć stosunek R/FR do 0,52.
  5. Po dodatkowych dwunastu dniach rośliny są gotowe do obrazowania liści. Na tym etapie starsze liście są w pełni dojrzałe, podczas gdy młodsze liście nadal się rozszerzają, dzięki czemu można uchwycić migawkę rozwoju. Możesz wybrać inny czas rozwoju w zależności od swoich potrzeb.

2. Przechwytywanie obrazów rozciętych liści

  1. Przygotuj przezroczyste arkusze oznaczone genotypem rośliny i warunkami wzrostu z pięcioma prostokątnymi ramkami. Jedna ramka odpowiada liściom z jednej rośliny. Za pomocą programu Microsoft Excel można wydrukować spójną siatkę z etykietami.
  2. Wytnij liście dwudziestosześciodniowych roślin.
  3. Skanowanie liści w rozdzielczości 600 dpi na skanerze płaskim. Zwróć uwagę, że liście z jednej rośliny powinny być umieszczone pionowo w czarnym oknie w kanapce z przezroczystych arkuszy. Unikaj dotykania liści do czarnej ramy okiennej i zachodzących na siebie liści, co spowoduje błędy w przestrzeganiu procedur.

3. Analiza obrazu liścia przez LeafJ

  1. Pobierz ImageJ z http://malooflab.openwetware.org/Resources.html#Software_Tools lub http://bitbucket.org/jnmaloof/leafj. Przeciągnij plik LeafJ.jar do folderu wtyczek ImageJ.
  2. Otwórz plik obrazu w programie ImageJ 1.45s lub nowszym14.
  3. Podziel obraz na kanały trójkolorowe (czerwony, zielony i niebieski) za pomocą opcji "Obraz > kolor > podziel kanały" i zastosuj próg do obrazu w kanale niebieskim.
  4. Wybierz wszystkie liście z jednej rośliny za pomocą narzędzia prostokąta (Rysunek 1A).
  5. Wybierz "LeafJ" z menu wtyczki.
  6. Wybierz informacje adnotacji dla tego zakładu w wyświetlonym oknie dialogowym. Możesz edytować wartości domyślne, które pojawiają się tutaj, klikając "edytuj te opcje".
  7. Po uruchomieniu wtyczki LeafJ i przed kliknięciem przycisku "OK", edytuj śledzone linie z okna menedżera obszaru zainteresowania (ROI) (jeśli to konieczne; Rysunek 1B). Do tej procedury przydatny jest tablet z ekranem dotykowym (taki jak iPad). iPady można podłączyć do komputera jako monitor zewnętrzny za pomocą oprogramowania Air Display.
  8. Eksportuj wyniki pomiarów i związane z nimi informacje (nazwy plików, czas kwitnienia, wypreparowane, zmierzone przez itp.) do programu Microsoft Excel lub równoważnego oprogramowania.

4. Analiza obrazu komórek liści w ImageJ

  1. Napraw rozcięte liście zgodnie z opisem w odnośniku15 po zeskanowaniu (krok 2). Stałe skrzydła FAA mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
  2. Oczyść liście, zmieniając utrwalacz FAA na roztwór hydratu chloralu i inkubuj liście przez 1 ~ 2 godziny przed obserwacją mikroskopową15.
  3. Zamontuj liście na szkiełkach mikroskopowych z włoskami skierowanymi do góry. Używając 40-krotnego powiększenia pod mikroskopem złożonym, zobrazuj warstwę mezofilu środka każdego liścia po obu stronach głównej żyły, unikając komórek w pobliżu trichomów lub żył.
  4. Śledź kontury komórek liści za pomocą narzędzia ImageJ ROI Manager za pomocą tabletu z ekranem dotykowym i rysika (zgodnie z opisem w kroku 3). Analiza obrazu komórki korzysta z wbudowanych funkcji ImageJ, ale nie wymaga LeafJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Obrazy liści pokazujące szacunkową granicę ogonka liściowego i blaszki liściowej oraz okno ich pomiaru

Jedną z najbardziej użytecznych funkcji LeafJ jest automatyczne wykrywanie granicy między blaszką liściową a ogonkiem liściowym (Rysunek 1). Algorytm LeafJ działa w następujący sposób: wbudowana funkcja ImageJ ParticleAnalyzer służy do znajdowania i określania orientacji liści wewnątrz wyboru użytkownika. Dla każdego skrzydła określa się szerokość skrzydła wzdłuż całej osi sk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasza wtyczka "LeafJ" umożliwia półautomatyczny pomiar długości ogonków liściowych, zwiększając przepustowość prawie 6-krotnie w porównaniu z pomiarem ręcznym. Długość ogonków liściowych jest ważnym wskaźnikiem SAS, a także jest punktem orientacyjnym dla innych zjawisk, takich jak odporność na zanurzenie i wzrost hiponastyczny17. Dlatego ta wtyczka może być przydatna dla szerokiego grona badaczy roślin.

Nasza wtyczka jest zaimplementowana w dobrze znanym darmowym oprogramowaniu opa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LeafJ został napisany przez JNM, gdy był na urlopie naukowym w laboratorium dr Katherine Pollard w Instytucie Gladstone'a.

Ta praca została wsparta grantem z National Science Foundation (numer grantu IOS-0923752).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
dalekoczerwone światło LED Orbitecprzezroczystość na zamówienie
IKONHSCA/5
skaner EpsonEpson Perfection V700 PHOTO
Obraz J NIHa href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/
LeafJ customhttp://www.openwetware.org/wiki/Maloof_Lab
Wyświetlacz powietrznyAvatron Software Inc.http://avatron.com/
iPad2 Apple Inc.http://www.apple.com/
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furbank, R. T., Tester, M. Phenomics--technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 16, 635-644 (2011).
  2. Berger, B., Parent, B., Tester, M. High-throughput shoot imaging to study drought responses. J. Exp. Bot. 61, 3519-3528 (2010).
  3. Borevitz, J. O. Natural genetic variation for growth and development revealed by high-throughput phenotyping in Arabidopsis thaliana. G3 (Bethesda). 2, 29-34 (2012).
  4. Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nat. Methods. 8, 599-605 (2011).
  5. Chitwood, D. H., et al. Native environment modulates leaf size and response to simulated foliar shade across wild tomato species. PLoS ONE. 7, e29570(2012).
  6. Chitwood, D. H., et al. The developmental trajectory of leaflet morphology in wild tomato species. Plant Physiol. 158, 1230-1240 (2012).
  7. Casal, J. J. Shade Avoidance. The Arabidopsis Book. , e0157(2012).
  8. Smith, H. Photomorphogenesis in Plants. Kendrick, R. E., Kronenberg, G. H. M. , Kluwer Academic Publishers. 377-416 (1994).
  9. Iwata, H., Ukai, Y. SHAPE: a computer program package for quantitative evaluation of biological shapes based on elliptic Fourier descriptors. J. Hered. 93, 384-385 (2002).
  10. Bylesjo, M., et al. LAMINA: a tool for rapid quantification of leaf size and shape parameters. BMC Plant Biol. 8, 82(2008).
  11. Weight, C., Parnham, D., Waites, R. LeafAnalyser: a computational method for rapid and large-scale analyses of leaf shape variation. Plant J. 53, 578-586 (2008).
  12. Backhaus, A., et al. LEAFPROCESSOR: a new leaf phenotyping tool using contour bending energy and shape cluster analysis. New Phytol. 187, 251-261 (2010).
  13. Tsukaya, H. Mechanisms of Leaf-shape determination. Annual Review of Plant Biology. 57, 477-496 (2006).
  14. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  15. Horiguchi, G., Fujikura, U., Ferjani, A., Ishikawa, N., Tsukaya, H. Large-scale histological analysis of leaf mutants using two simple leaf observation methods: identification of novel genetic pathways governing the size and shape of leaves. Plant. J. 48, 638-644 (2006).
  16. Horiguchi, G., Ferjani, A., Fujikura, U., Tsukaya, H. Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant. Res. 119, 37-42 (2006).
  17. Pierik, R., de Wit, M., Voesenek, L. A. C. J. Growth-mediated stress escape: convergence of signal transduction pathways activated upon exposure to two different environmental stresses. New. Phytol. 189, 122-134 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wtyczka LeafJwysokoprzepustowe fenotypowaniepomiar d ugo ci ogonka li ciowegoparametry blaszki li ciowejanaliza za pomoc tabletu z ekranem dotykowymmikroskopia z o onaobrazowanie skanerem p askimpomiar kszta tu kom rek

Powiązane artykuły