Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Jackson Buss; Carla Coltharp; Jie Xiao

doi:10.3791/50048

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50048

⸱

21 stycznia 2013

Jackson Buss¹ , Carla Coltharp¹ , Jie Xiao¹

¹Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, The Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek. Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Streszczenie

Podział komórek bakteryjnych wymaga skoordynowanego składania więcej niż dziesięciu niezbędnych białek w środkowej komórce^1,2. Kluczowe znaczenie dla tego procesu ma tworzenie pierścieniowatej suprastruktury (pierścienia Z) przez białko FtsZ w planie podziału^3,4. Pierścień Z składa się z wielu jednoniciowych protofilamentów FtsZ, a zrozumienie układu protofilamentów wewnątrz pierścienia Z zapewni wgląd w mechanizm montażu pierścienia Z i jego funkcję jako generatora siły^5,6. Informacje te pozostały nieuchwytne ze względu na obecne ograniczenia w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii elektronowej. Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna nie jest w stanie zapewnić obrazu pierścienia Z o wysokiej rozdzielczości ze względu na granicę dyfrakcji światła (~200 nm). Obrazowanie kriotomograficzne elektronowe wykryło rozproszone protofilamenty FtsZ w małych komórkach C. crescentus ⁷, ale jest trudne do zastosowania do większych komórek, takich jak E. coli lub B. subtilis. W tym miejscu opisujemy zastosowanie metody mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), w celu ilościowego scharakteryzowania organizacji strukturalnej pierścienia Z⁸ E. coli.

Obrazowanie PALM oferuje zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną (~35 nm), jak i specyficzne znakowanie, aby umożliwić jednoznaczną identyfikację docelowych białek. Oznaczyliśmy FtsZ fotoaktywowanym białkiem fluorescencyjnym mEos2, które przełącza się z zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 488 nm) na czerwoną fluorescencję (wzbudzenie = 561 nm) po aktywacji przy 405 nm⁹. Podczas eksperymentu PALM pojedyncze cząsteczki FtsZ-mEos2 są aktywowane stochastycznie, a odpowiednie pozycje środka ciężkości pojedynczych cząsteczek są określane z dokładnością <20 nm. Obraz pierścienia Z o wysokiej rozdzielczości jest następnie rekonstruowany poprzez nałożenie pozycji środka ciężkości wszystkich wykrytych cząsteczek FtsZ-mEos2.

Korzystając z tej metody, stwierdziliśmy, że pierścień Z ma stałą szerokość ~100 nm i składa się z luźnej wiązki protofilamentów FtsZ, które nakładają się na siebie w trzech wymiarach. Dane te stanowią punkt wyjścia do dalszych badań nad zależnymi od cyklu komórkowego zmianami pierścienia Z¹⁰ i mogą być stosowane do innych interesujących białek.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

Zaszczepić pożywkę LB pojedynczą kolonią szczepu JB281 [BW25113 / pJB042 (P_Lac:FtsZ-mEos2)]. Rosnąć przez noc w shakerze w temperaturze 37 °C.
Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:1,000 w minimalnej pożywce M9⁺ [sole M9, 0,4% glukozy, 2 mM_MgSO4, 0,1 mM CaCl₂, aminokwasy MEM i witaminy] i rośnić do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ = 0,2-0,3) w obecności chloramfenikolu (150 μg / ml) w temperaturze pokojowej (RT).
Wywołaj hodowlę za pomocą 20 μM IPTG przez 2 godziny (patrz Uwaga #1).
Hodowlę osadów w mikrowirówce (8 000 obr./min, 1 min) i ponowne zawieszenie w równej objętości M9⁺; powtórzyć. Po drugim podwieszeniu kontynuować wzrost w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
Utrwalić indukowaną hodowlę za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS (pH = 7,4) w temperaturze pokojowej przez 40 min. Hodowla osadów i ponownie zawiesić w równej objętości PBS; powtórzyć. W przypadku obrazowania żywych komórek należy pominąć utrwalanie, hodowlę osadów i ponownie zawiesić z równą objętością M9^-[sole M9, 0,4% glukozy, 2 mM_MgSO4, 0,1 mM CaCl₂, aminokwasy MEM]; powtórzyć.
Rozcieńczyć złote koraliki w stosunku 1:10 z ponownie zawieszoną kulturą. Pobrać próbkę do przygotowanej komory obrazowania (patrz krok 2.4).

[1] Uwaga: Powyższy protokół indukcji (kroki 1.1-1.3) został zoptymalizowany dla systemu ekspresji szczepu JB281. Szczegółowe warunki indukcji mogą się różnić w przypadku innych systemów ekspresji lub białek będących przedmiotem zainteresowania.

2. Montaż komory obrazowania

Przygotować 3% (w/v) roztwór agarozy w M9^-. Rozpuść agarozę w temperaturze 70 °C w stołowym bloku grzewczym przez 40 minut. Stopioną agarozę należy przechowywać w temperaturze 50 °C do 5 godzin.
Umieść czysty szkiełko mikroakweduktu w górnej połowie komory obrazowania elektrodami skierowanymi w dół. Dopasuj dolną uszczelkę na zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakryć kanały perfuzyjne.
Nałóż ~50 μl stopionej agarozy na środek szkiełka podstawowego. Natychmiast przykryj kroplę żelu agarozowego czystym, suchym szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić żel do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
1. Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe: ułóż szkiełka nakrywkowe w ceramicznym uchwycie i sonikuj przez 20 minut w obrotowych kąpielach acetonu, etanolu i 1M KOH w szklanych słoikach. Powtórz cykl trzy razy, w sumie 9 soników, a następnie pojedynczą sonikację w dH₂O. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe przechowuj w świeżej dH₂O. Przed użyciem wysusz szkiełka nakrywkowe suszarką przefiltrowanym powietrzem.
Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe, pozostawiając podkładkę żelową na zjeżdżalni mikroakweduktu. Natychmiast dodać 1 μl próbki kultury komórkowej (patrz krok 1.6) do górnej części wkładki żelowej. Odczekać ~2 min, pozwalając roztworowi wchłonąć się przez podkładkę żelową. Górna podkładka żelowa z nowym, czystym, suchym szkiełkiem nakrywkowym. Zmontuj całą komorę obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Akwizycja obrazu

Włącz mikroskop, kamerę i lasery. Otwórz oprogramowanie MetaMorph (Molecular Devices).
Umieść odpowiednie filtry wzbudzenia/emisji w ścieżce obrazowania (rysunek 1).
Ustaw odpowiednio moce lasera i ustawienia akwizycji.
1. Laser 488-nm = 15 mW (patrz Uwaga #2)
2. Laser 561 nm = 75 mW
3. Laser 405 nm = 2 mW ± filtr o neutralnej gęstości (patrz Uwaga #3)
Zablokuj komorę obrazowania w stoliku za pomocą uzupełniającego adaptera stopnia.
Wyznacz odpowiedni obszar obrazowania (100x100 pikseli), który jest równomiernie oświetlony przez wszystkie trzy lasery.
Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia (złote koraliki) w bliskiej odległości, ale nie nakładające się na siebie.
Skoncentruj się na powierzchni komórek znajdujących się najbliżej szkiełka nakrywkowego. Uzyskać jeden obraz w jasnym polu o czasie integracji 50 ms i przesunąć ostrość o 0,5 μm w głąb próbki (rysunek 3Ai).
Uzyskaj zespołowy obraz zielonej fluorescencji ze wzbudzeniem z lasera 488 nm, wykorzystując czas całkowania 50 ms (rysunek 3Aii).
Rejestruj strumieniowe wideo w kanale czerwonym z ciągłym oświetleniem z laserów 405 nm i 561 nm. W przypadku komórek stacjonarnych szybkość odświeżania 50 ms jest używana dla łącznie 20 000 klatek (łącznie ~17 minut) przy mocy lasera 405 nm zwiększanej o ~10% co 1000 klatek (patrz Uwaga #4). W przypadku aktywnych komórek używana jest szybkość odświeżania 10 ms, co daje łącznie 3 000 klatek (łącznie ~30 s) przy stałej mocy lasera 405 nm.
Przenieś fokus z powrotem na dolną powierzchnię komórek i uzyskaj kolejny obraz w jasnym polu, jak w kroku 3.7.

[2] Uwaga: Zintegrowana intensywność zielonej fluorescencji komórki jest wprost proporcjonalna do całkowitej liczby cząsteczek FtsZ-mEos2 wyrażonych w komórce. Ustawienia mocy wzbudzenia 488 nm i akwizycji fluorescencji zespołowej powinny być stałe dla wszystkich komórek, aby można było porównać względne poziomy ekspresji FtsZ-mEos2 w różnych komórkach.

[3] Uwaga: Stałe komórki są obrazowane za pomocą filtra o neutralnej gęstości (ND) (Rysunek 1, Komponent optyczny #5) w celu osiągnięcia powolnego tempa aktywacji, tak aby każda pojedyncza cząsteczka mogła być dokładnie zidentyfikowana. Filtr ND jest usuwany podczas obrazowania żywych komórek w celu zwiększenia szybkości aktywacji, przy jednoczesnym zachowaniu niskiego prawdopodobieństwa jednoczesnej aktywacji dwóch cząsteczek w obszarze ograniczonym dyfrakcją. Szybsze tempo stosowane do obrazowania żywych komórek jest potrzebne, aby skrócić całkowity czas akwizycji, a tym samym "zamrozić" pierścień Z w czasie i ograniczyć efekt fotouszkodzenia komórki.

[4] Uwaga: Liczba pozyskanych ramek została zoptymalizowana dla naszego systemu i zależy od konkretnej struktury komórkowej, gęstości znakowania, szybkości aktywacji i tego, czy wyczerpanie całej puli fluoroforów jest ważne dla analizy. W żywych komórkach ważne jest, aby uzyskać wystarczającą liczbę lokalizacji w jak najkrótszym czasie, aby uniknąć rozmycia obrazu z powodu ruchu struktury komórkowej.

4. Budowa obrazu PALM

Określ położenie środka ciężkości każdego wykrytego miejsca.
1. Załaduj stos obrazów do Matlaba (MathWorks, Inc).
2. Przytnij stos obrazów do obszaru wokół jednej komórki, który wyklucza wszystkie koraliki odniesienia.
3. Wybierz próg intensywności wykrywania punktowego, który znajduje się powyżej poziomu tła, ale poniżej średniej intensywności plamki. Uwzględniamy różnice w poziomie tła w całym eksperymencie, obliczając średnią bieżącą maksymalnej intensywności przy użyciu okna 150 klatek. Próg intensywności dla każdej klatki jest następnie interpolowany od wartości średniej bieżącej.
4. Odejmij odpowiedni próg od każdej klatki. Punkty prospektywne są identyfikowane jako trzy sąsiadujące ze sobą piksele o intensywności powyżej progu.
5. Dopasuj intensywność fluorescencji każdej potencjalnej plamki do dwuwymiarowej funkcji Gaussa [Równanie #1] za pomocą nieliniowego algorytmu najmniejszych kwadratów (Rysunek 2). Precyzja lokalizacji każdej plamki jest obliczana na podstawie całkowitej liczby wykrytych fotonów [Równanie #2]. Każda źle dopasowana plamka o precyzji lokalizacji większej niż 20 nm (stałe komórki) lub 45 nm (żywe komórki) jest odrzucana (patrz Uwaga #5). Każde miejsce o natężeniu większym niż dwukrotność średniej intensywności, prawdopodobnie z powodu nakładających się na siebie emiterów, jest również odrzucane.
6. W przypadku komórek stałych należy usunąć powtarzające się obserwacje tej samej cząsteczki, ignorując każdą plamkę, której położenie środka ciężkości znajduje się w odległości 45 nm od dowolnego innego miejsca, które poprzedzało je o 6 ramek lub mniej. W przypadku żywych komórek wszystkie plamki są zachowywane.
Kalibracja dryftu próbki za pomocą ruchu znacznika odniesienia.
1. Wytnij obszar o wymiarach 10x10 pikseli wokół znacznika odniesienia.
2. Odjąć odpowiedni próg określony w ppkt 4.1.3 od każdej ramki.
3. Dopasuj profil intensywności w każdej klatce za pomocą algorytmu dopasowania najmniejszych kwadratów, przyjmując dwuwymiarowy kształt Gaussa.
4. Obliczanie przemieszczenia między położeniami środka ciężkości względem klatki 1.
Skorygować położenie środka ciężkości każdej unikalnej cząsteczki zidentyfikowanej w ppkt 4.1 przy odpowiednim dryfcie próbki obliczonym w ppkt 4.2. Porównaj obrazy w jasnym polu uzyskane w 3.7 i 3.10. Jeśli zaobserwuje się, że komórki poruszają się względem markerów odniesienia, dane są odrzucane.
Nałóż wszystkie skorygowane pozycje środka ciężkości na pojedynczy obraz złożony z pikseli 15x15 nm. Wykreśl każdą unikalną cząsteczkę jako dwuwymiarowy profil Gaussa o powierzchni jednostkowej wyśrodkowany w położeniu środka ciężkości z odchyleniem standardowym równym precyzji lokalizacji [Równanie #2]. W ten sposób powstaje mapa gęstości prawdopodobieństwa, na której intensywność piksela jest proporcjonalna do prawdopodobieństwa znalezienia cząsteczki w tym pikselu (rysunek 3Aiv).
Porównywanie obrazów PALM z obrazami zespołowymi.
1. Powtórz położenie środka ciężkości jak w ppkt 4.4, ale na płaszczyźnie z pikselami 150x150 nm i odchyleniem standardowym równym 250 nm. W ten sposób generowany jest obraz PALM, który naśladuje obraz z ograniczoną dyfrakcją, który można wykorzystać do porównania z ograniczonym dyfrakcyjnie, zespołowym obrazem uzyskanym w 3.8 (Rysunek 3Aiii).
2. Aby potwierdzić, że wykryte cząsteczki są reprezentatywne dla całej populacji, porównaj zrekonstruowany obraz zespołu (Rysunek 3Aiii, krok 4.5.1) z eksperymentalnym obrazem fluorescencji zespołowej (Rysunek 3Aii, krok 3.8), aby potwierdzić, że oba obrazy pokazują struktury o podobnym kształcie, orientacji i względnej intensywności.

[5] Uwaga: Minimalna wymagana precyzja lokalizacji została określona empirycznie dla każdej metody obrazowania, poprzez wykreślenie dokładności wszystkich cząsteczek dla danej próbki i wybranie odpowiedniego punktu odcięcia.

5. Analiza obrazu PALM

Pomiar szerokości i średnicy pierścienia Z.
1. Obróć obraz PALM tak, aby ustawić w pionie długą oś komórki (Rysunek 4A).
2. Wytnij obszar komórkowy zawierający pierścień Z.
3. Oblicz skumulowaną intensywność, rzutując profil intensywności wzdłuż długiej osi komórki.
4. Dopasuj profil intensywności do rozkładu Gaussa. Szerokość pierścienia definiuje się jako maksymalną połowę szerokości całkowitej (FWHM) dopasowanego rozkładu Gaussa (rysunek 4B).
5. Rzutować skumulowany profil intensywności z ppkt 5.1.2 wzdłuż krótkiej osi ogniwa. Średnicę pierścienia definiuje się jako pełną długość profilu intensywności (rysunek 4C).
Wykreślanie gęstości FtsZ (patrz uwaga #6).
1. Powtórz pozycje środka ciężkości, jak w (4.4), ale bez profilu Gaussa, tak aby każdej unikalnej cząsteczce nadano wartość 1 i przypisano ją do pojedynczego piksela odpowiadającego jej położeniu środka ciężkości. W ten sposób intensywność każdego piksela reprezentuje całkowitą liczbę cząsteczek wykrytych w tym pikselu. Obraz Density PALM można również wizualizować jako wykres konturowy (Rysunek 5E).
Określanie rozdzielczości przestrzennej.
1. Teoretycznie osiągalna rozdzielczość przestrzenna: utwórz reprezentatywny PSF dla całej próbki, korzystając ze średniej wyznaczonej precyzji lokalizacji wszystkich wykrytych cząsteczek i oblicz FWHM (równanie #3).
2. Eksperymentalnie uzyskana rozdzielczość przestrzenna: oblicz średnie przemieszczenie między powtarzającymi się obserwacjami tej samej cząsteczki.

[6] Uwaga: Użyliśmy całkowitego wewnętrznego odbicia PALM (TIR-PALM, Rysunek 1 i 5), aby ograniczyć aktywację i wzbudzenie do cienkiej warstwy (~200 nm) powyżej granicy faz komórka/szkło. tak, że wykrywane będą tylko cząsteczki FtsZ związane z membraną znajdującą się najbliżej szkiełka nakrywkowego.