Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Podsumowanie

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek. Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Streszczenie

Podział komórek bakteryjnych wymaga skoordynowanego składania więcej niż dziesięciu niezbędnych białek w środkowej komórce^1,2. Kluczowe znaczenie dla tego procesu ma tworzenie pierścieniowatej suprastruktury (pierścienia Z) przez białko FtsZ w planie podziału^3,4. Pierścień Z składa się z wielu jednoniciowych protofilamentów FtsZ, a zrozumienie układu protofilamentów wewnątrz pierścienia Z zapewni wgląd w mechanizm montażu pierścienia Z i jego funkcję jako generatora siły^5,6. Informacje te pozostały nieuchwytne ze względu na obecne ograniczenia w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii elektronowej. Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna nie jest w stanie zapewnić obrazu pierścienia Z o wysokiej rozdzielczości ze względu na granicę dyfrakcji światła (~200 nm). Obrazowanie kriotomograficzne elektronowe wykryło rozproszone protofilamenty FtsZ w małych komórkach C. crescentus ⁷, ale jest trudne do zastosowania do większych komórek, takich jak E. coli lub B. subtilis. W tym miejscu opisujemy zastosowanie metody mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), w celu ilościowego scharakteryzowania organizacji strukturalnej pierścienia Z⁸ E. coli.

Obrazowanie PALM oferuje zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną (~35 nm), jak i specyficzne znakowanie, aby umożliwić jednoznaczną identyfikację docelowych białek. Oznaczyliśmy FtsZ fotoaktywowanym białkiem fluorescencyjnym mEos2, które przełącza się z zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 488 nm) na czerwoną fluorescencję (wzbudzenie = 561 nm) po aktywacji przy 405 nm⁹. Podczas eksperymentu PALM pojedyncze cząsteczki FtsZ-mEos2 są aktywowane stochastycznie, a odpowiednie pozycje środka ciężkości pojedynczych cząsteczek są określane z dokładnością <20 nm. Obraz pierścienia Z o wysokiej rozdzielczości jest następnie rekonstruowany poprzez nałożenie pozycji środka ciężkości wszystkich wykrytych cząsteczek FtsZ-mEos2.

Korzystając z tej metody, stwierdziliśmy, że pierścień Z ma stałą szerokość ~100 nm i składa się z luźnej wiązki protofilamentów FtsZ, które nakładają się na siebie w trzech wymiarach. Dane te stanowią punkt wyjścia do dalszych badań nad zależnymi od cyklu komórkowego zmianami pierścienia Z¹⁰ i mogą być stosowane do innych interesujących białek.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

1. Zaszczepić pożywkę LB pojedynczą kolonią szczepu JB281 [BW25113 / pJB042 (P_Lac:FtsZ-mEos2)]. Rosnąć przez noc w shakerze w temperaturze 37 °C.
2. Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:1,000 w minimalnej pożywce M9⁺ [sole M9, 0,4% glukozy, 2 mM_MgSO4, 0,1 mM CaCl₂, aminokwasy MEM i witaminy] i rośnić do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ = 0,2-0,3) w obecności chloramfenikolu (150 μg / ml) w temperaturze pokojowej (RT).
3. Wywołaj hodowlę za pomocą 20 μM IPTG przez 2 godziny (patrz Uwaga #1).
4. Hodowlę osadów w mikrowirówce (8 000 obr./min, 1 min) i ponowne zawi....

Wyniki

Na Rysunku 3Aiv przedstawiono dwuwymiarową renderację o wysokiej rozdzielczości pierścienia Z, wygenerowaną za pomocą opisanej powyżej metody obrazowania PALM. Poniżej podsumowano informacje jakościowe i ilościowe, jakie można z nich uzyskać.

Jakościowo zaobserwowano, że pierścień Z jest nieregularną strukturą przyjmującą wiele konfiguracji (pojedynczy pas lub łuk helikalny), których nie można rozróżnić na konwencjonalnych obrazach fluorescencyjnych (porównać Rycina 3.......

Dyskusja

Obrazy PALM zawierają informacje o liczbie i położeniu cząsteczek w komórce, co pozwala na szczegółową analizę rozmieszczenia i rozmieszczenia docelowych cząsteczek białka, co jest trudne do osiągnięcia w inny sposób. Poniżej przedstawiamy środki ostrożności, które należy podjąć, aby uzyskać dokładne informacje ilościowe przy jednoczesnym zachowaniu biologicznego znaczenia obrazów PALM. Badamy również informacje, które można najlepiej uzyskać przy użyciu komórek aktywnych i stałych. Na koniec sugerujemy sposoby uzyskania.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
50 x MEM Aminokwasy	Sigma	M5550
100 x MEM Witaminy	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% Paraformaldehyd	Mikrsokopia elektronowa Nauki	15710-S
SeaPlaque GTG Agaroza	Lonzo	50111
50 nm Złote Koraliki	Mikrosfery-Nanosfery	790113-010
Komora obrazowania FCS2	sceniczny Bioptechs
	ASI	I-3017
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX71
1.45 NA, 60-krotny obiektyw	Olympus
IXON EMCCD Kamera	Andor Technology	DU897E
488-nm Szafirowy spójny laser
561-nm Szafirowy laser	koherentny
405-nm CUBE	Koherentny

Adapter laserowy